Summary
Konstruerad muskelvävnad har stor potential i regenerativ medicin, som sjukdomsmodell och även som en alternativ källa för kött. Här beskriver vi konstruktion av en muskel konstruktion, i detta fall från stamceller mus myoblast celler, och stimulering av elektriska pulser.
Abstract
Engineered muskelvävnad kan användas för flera olika ändamål, som innefattar framställning av vävnader för användning som en sjukdom modell in vitro, t.ex. för att studera trycksår, för regenerativ medicin och som ett kött alternativ 1. De första rapporterade 3D muskel konstruktioner har gjorts för många år sedan och pionjärer på området är Vandenburgh och kollegor 2,3. Framstegen i muskelvävnad teknik är inte bara ett resultat av den stora vinsten i kunskap om biokemiska faktorer, stamceller och progenitorceller, men är framför allt baserade på insikter av forskare som fysiska faktorer spelar viktiga roller i kontrollen av cellens beteende och vävnadsutveckling. State-of-the-art konstruerade muskel konstruerar för närvarande består av cell-befolkade hydrogel konstruktioner. I vårt labb dessa består i allmänhet av murina celler myoblast progenitorceller isolerade, från murina bakbenen muskler eller en murin myoblast cellinje C2C12, MIfixerad med en blandning av kollagen / Matrigel och ströks mellan två förankringspunkter, imitera muskeln ligament. Andra celler kan betraktas också, t.ex. alternativa cellinjer som L6 råtta myoblaster 4, neonatal muskel härledda progenitorceller 5, celler som härrör från vuxna muskelvävnad från andra arter såsom människa sex eller till och med inducerade pluripotenta stamceller (iPS-celler) 7 . Cell kontraktilitet orsakar inriktning av cellerna längs den långa axeln av konstruktionen 8,9 och differentiering av muskelceller progenitorceller efter ungefär en vecka av odling. Dessutom kan tillämpningen av elektrisk stimulering förbättra processen av differentiering i viss mån 8. På grund av sin begränsade storlek (8 x 2 x 0,5 mm) kan hela vävnaden analyseras med hjälp konfokalmikroskopi för att övervaka t.ex. lönsamhet, differentiering och celljustering. Beroende på den specifika tillämpningen kraven för engineeröd muskelvävnad varierar, t.ex. användning för regenerativ medicin kräver upp skalning av vävnad storlek och vaskularisering, medan att fungera som en kött alternativ översättning till andra arter är nödvändiga.
Protocol
1. Kultur av murina celler myoblast progenitorceller eller C2C12-celler
- Isolera celler enligt protokollet som ursprungligen publicerades av Shefer och kollegor 10 och senare anpassas av Collins et al. 11 och Boonen et al. 12 och lagra dem i flytande kväve. Detta kräver möss, t.ex. C57BL / 6. Alternativa metoder används i andra laboratorier, t.ex. en metod publicerad i Journal of visualiseras experiment av Li Y et al. 13. För reagenser och utrustning som du hänvisas till tabellen på sidan 7 och 8. Från muskler från en mus kommer du vanligtvis få tillräckligt med celler för att cryopreserve cirka 20 flaskor i flytande kväve. Därefter börjar vi protokollet att tina cellerna från flytande kväve lagring.
- Placera cellerna från 1 flaska i en 25 cm 2 Matrigel (1 mg / ml) belagd vävnadsodling kolv och tillsätt tillväxtmedium (GM) som består av (335 ml DMEM avancerad, 100 ml fetalt bovine serum (FBS), 50 ml HS, 5 ml penicillin / streptomycin, 5 ml L-glutamin, 5 ml kycklingembryo extrakt (CEE)).
Anmärkning: päls för 2 timmar vid rumstemperatur och avlägsna Matrigel genom aspiration.
- Subkultur cellerna 1:03 ungefär var 3 dagar.
Detta innebär: dag 3: Passage celler från en 25 cm 2 till en 75 cm 2 kolv, på dag 6: Passage celler från en 75 cm 2 kolv till två 150 cm 2 flaskor (med 30 minuter preplating för obestruket kolvar). På dag 9 överföring en 150 cm 2 kolven till 1 trippel 150 cm 2 kolv, eller om otillgänglig för tre 150 cm 2 kolvar (vid behov preplate återigen beroende på fenotypen av cellerna). På dag 12 cellerna är redo för ympning i en muskel konstruktion.
Observera: - Per trippel 150 cm 2 antalet celler kommer att vara cirka 4,5 x 10 6 celler.
- Användning viaÄr från olika isoleringar att blanda dem för att få en blandad population av celler vid tidpunkten för sådd.
Obs: Om du väljer att inte arbeta med primära celler, C2C12 myoblaster är ett bra alternativ.
2. Engineering Skelettmuskulatur Vävnader
- Förbered kisel lim genom att blanda "elast" med "härdningsmedlet" (10:1). Klipp + / - 5 mm kvadratiska segment av kardborreband med en triangulär sida (hus-liknande form, figur 1). Limma kardborre i brunnarna på en 6-brunnars odlingsplatta vid ett utrymme av ungefär 12 mm mellan rutorna.
Observera: - Använd endast den mjuka sidan av kardborreband och möta denna sidan uppåt.
- Se till att hustaken mot varandra.
- Endast omfatta kardborreband med kisel lim, inte sprider lim över hela brunnen.
- För senare elektrisk stimulering är det relevant att anpassa konstruktionerna i vertikal riktning och PLåt (längs den långa axeln).
- Låt torka över natten i vakuumugn, inte uppvärmd, primärt för att avlägsna luftbubblor. Sterilisera genom tillsats 70% EtOH till brunnarna och inkubera under 15 min. Skölj 3x med PBS och sattes under UV under 15 minuter. Ta bort alla PBS från brunnarna och kardborreband och plats i inkubatorn fram till användning.
- Tina Matrigel lösning i kylskåpet och förbereda kollagen lösningen till önskad koncentration strax innan 3D konstruktioner. Späd beståndet kollagen med steril 0,02% ättiksyra (slutlig koncentration 3,2 mg / ml).
Obs: Lämna allt på is.
- Trypsinisera cellerna, återsuspendera i GM och räkna. Låt celler i centrifugrör i inkubatorn.
- Lägg önskad mängd kollagen stamlösning för antalet konstruktioner som du vill göra till ett rör (enligt tabell 1), lägg 0,5 M NaOH till denna kollagen lösning tills en ljusrosa coloR indikerar ett pH av 7,5. Blanda försiktigt genom att pipettera upp och ned och undvika bubbelbildning. Tillsätt sedan Matrigel och blanda mycket försiktigt men grundligt. Slutligen lägger GM till kollagen / Matrigel blandning (för lämpliga mängder se tabell 1).
Observera: - Utför varje steg på is! Matrigel och kollagen kommer lätt gel vid ökande temperatur.
- Sköt att färgen verkligen är rosa! En ökning av pH-värdet kommer också inducera snabb gelning.
- Slutlig koncentration av kollagen: 1,6 mg / ml.
- Centrifugera den önskade mängden celler vid 1.000 rpm under 5 minuter och avlägsna supernatanten.
Observera: - Beroende på aktiviteten av cellerna antalet celler per bygga behöver justeras. Typiskt ligger antalet celler mellan 750.000 och 1.250.000 celler per konstruktionen.
- Använda en del av gelblandningen att resuspendera cellpelletenoch överföra cellerna i den återstående blandningen och blanda väl, men utan att införa luftbubblor.
- Ta de förvärmda brunnar ur inkubatorn och pipettera 0,35 -0,4 ml av cell-gelblandningen i kardborre först. Sedan börjar pipettera blandningen från centrum mellan bindningsställen och sträcker sig till kardborreband. Slutligen använder resten av gelen att fylla gapet mellan de två Velcro ankare och pipett runt kardborrebanden.
- Kontrollera noga efter 5-10 min om gelerna är fast nog att överföras, dvs slå försiktigt rätter och inspektera visuellt om gelen är stel. Om så är fallet, försiktigt placera rätter i en inkubator. Vanligtvis, kan de plockas upp efter tio minuter. Sedan, efter 1-2 timmar, försiktigt lägga över varje gel med 4 ml varm GM.
Obs:-Gör inga kraftiga rörelser vid hantering av plattorna.
- Byt GM genom differentiering medium (tillväxtmediumutan kycklingembryo extrakt) efter 24 timmar, och ersätt med färskt medium var 2-3 dagar. På dag 7 du borde ha fått mogna orienterade muskelfibrer, som kan utvärderas med färgning för gränsöverskridande ränder utveckling i smält muskelfibrerna.
3. Elektrisk stimulering
- Sterilisera elektroderna från ionoptix plattan (se tabell av reagenser och utrustning) före användning med 70% etanol och därefter torka under UV i säkerhetsskåp. Placera plattan med elektroder på odlingsplattan med konstruktionerna och på locket från odlingsplattan och överföring till en inkubator. Anslut Ionoptix C-pacemakern med lämpliga kablar.
Obs: Elektroder placeras parallellt längs muskeln konstruktionen (Figur 2).
- Applicera stimulering protokoll som väntat.
Obs: Vi använder normalt 4 V / cm,6ms pulser vid en frekvens av 2 Hz. Ändra odlingsmedium varje 24 timmar under stimulering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Slutprodukten blir muskel konstruktioner såsom visas i fig 3. Storleken av vävnaden kommer att vara cirka 8 mm långa, 2 mm bred och 0,5 mm tjock. Elektrisk stimulering under differentiering kommer att förändra uttrycket av myosin tung kedja isoformer, men inte i hög grad öka differentiering processen som induceras av differentiering mediet 8, men elektrisk stimulering kan även appliceras vid slutet av processen för att kontrollera funktionaliteten hos muskeln eftersom en muskel med fullt utvecklade sarkomerer kan krympa på en elektrisk puls.
Differentiering och mognad kan också analyseras med kvantitativ PCR för genuttryck utvärdering och färgning för markörer muskel mognad eller kors ränder utveckling (t.ex. färgning för alfa aktinin) på antingen delar tillverkade av vävnader eller hela mount färgade vävnadsprover. Muscle mognad och differentiering relationted gener och myosin tung kedja uttryck är bl.a. MyoD, myogenin, MFR4 och MLP och MYH 1, 2, 4 och 8 8. Bevis på att muskelvävnaden som bildas verkligen är muskelvävnad, baserad på genuttryck, immunhistokemiska färgningar och kontraktion induktion genom elektrisk stimulering, har publicerats tidigare 8 och en siffra med färgade tvärsektioner av muskelvävnad gjorda celler myoblast progenitorceller och C2C12-celler från detta dokument visas i Figur 4.
| Lösning | Volym (om att göra 10 muskler) i pl |
| Kollagen (3,2 mg / ml, utspäddes med 0,02% ättiksyra) | 2570 (51,3%) |
| NaOH (0,5 M) | 10 (0,2%) |
| Matrigel | 430 (8,6%) |
| Tillväxtmedium | 2000 (39,9%) |
| totalt | 5010 (bör räcka med tillräckligt för spill och förlust pipettering) |
Tabell 1. Blandning av celler och gel för generering av en vävnadsteknisk muskel konstruktion.
Figur 1. Skära bitar av kardborreband.
Figur 2. En bild tagen från botten av en muskel konstruktion i en brunn i en 6-brunnars platta som visar placeringen av elektroderna. Elektroderna (indikerade med de vita pilarna) är placerade parallellt med muskel konstruktionerna.
Figur 3. En vävnadkonstruerad muskel mellan två bitar av kardborreband i en 6-brunnars odlingsplatta.
Figur 4. Typiska exempel på gränsöverskridande strimmor i C2C12 (A) och MPC (B) i konstruerade skelettmuskulatur vävnad. Frysta snitt av icke-stimulerade mBAMs (dag 8 av differentiering) färgades för sarkomeriskt α-aktinin (röd), sarkomeriskt myosin (grön ) och kärnor (blå). (Aa-AB och BA-Bb) förstoringar av förpackade områden i (A, B) α-aktinin (röd) och sarkomeriskt myosin (grön). Omtryckt med tillstånd från 8. Klicka här för att se större bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den konstruktion av muskelvävnad har stor potential för användning som en sjukdom modell för läkemedelsscreening i regenerativ medicin och för köttproduktion. Men kraven för dessa applikationer varierar. Vi valde att arbeta med en kombination av kollagen och Matrigel, eftersom kollagen möjliggör celljustering och eftersom myoblast progenitorceller kräver närvaro av källare härledda membranproteinerna som bestämts i tidigare studier 2D 12. Dessutom har fibringeler testats i vårt laboratorium och verkar inte stödja C2C12 och myoblast progenitorceller liksom blandningen av kollagen och Matrigel ™ och speciellt inte leder till vävnad packning 14. Den modell som beskrivs här har använts redan i studier om trycksår skador under användning av en cellinje 15. För regenerativ medicin applikationer har översättningen till mänskliga satellit celler nyligen gjorts 6,16. Dessutom,som en alternativ källa för köttkonsumtionen tekniken har stor potential 1. I vår mening behöver emellertid den nuvarande tekniken för att avancera till nästa steg för att främja dess användning i klinik och för konsumtion. Exempelvis stoppar differentieringen runt den neonatala stadiet och även kraft produktionen är mycket mindre än en muskel producerar in vivo. Dessutom, även mus, råtta och människa stamceller kan implementeras i 3D konstruktioner, isolering och särskilt differentiering och mognad av husdjur härrör muskelceller stamceller inte utvecklas så långt ännu 1. Också användningen av Matrigel och djur härledda serum behov utelämnas 1. För att främja programmet i regenerativ medicin, har vävnaden storlek ökas, och kräver (neo) vaskularisering och användning av system perfusionsbioreaktor att övervinna syre och näringsämnen begränsningar diffusion. Några inledande vaskularisering studier på små konstruktioner have gjorts under de senaste åren 9,17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Yabin Wu för odling av vävnader som presenteras i figur 2, var bilden tagits av Bart van Overbeeke. Arbetet stöds ekonomiskt av SenterNovem, bevilja ISO 42022.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel-growth factor reduced | Beckton and Dickinson | ||
| DMEM (high glucose)* | Gibco | 42430 | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491 | |
| Horse serum | Gibco | 65050-122 | |
| Fetal bovine serum | Greiner | 758075 | |
| 0.45 and 0.22 μm syringe filter* | Whatmann (Schleicher and Scheull) | 10462100 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | |
| Culture plastic | Greiner | Includes culture flasks and pipets | |
| Chick embryo extract | United States Biological | C3999 | |
| Pasteur pipet* | Hilgenberg | Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 0,9 - 1,1 mm | |
| Pasteur pipet* | Hilgenberg | Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 1,4 - 1,6 mm | |
| Pasteur pipet | VWR | 612-1702 | |
| Collagenase type I* | Sigma | C0130-16 | |
| 40 μm cell strainer* | BD Falcon | 352340 | |
| 19G needle | |||
| Elastomer | Dow Corning corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| Curing agent | Dow Corning corporation | Silastic MDX 4-4210# | |
| Velcro | Regular store | You can buy this at a regular store, only use the soft side | |
| Collagen type I, rat tail | BD Biosciences | 3544236 | |
| C-Pace EP Culture Pacer | Ionoptix | ||
| 6-well culture dishes for electrical stimulation | Beckton Dickinson-Falcon | BD Falcon #353846 | |
| C-Dish culture dish electrodes | Ionoptix | ||
| * Needed for the isolation of cells (point 1.1) # Together in one kit |
|||
References
- Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Polak, R. B., et al. Meet the new meat: tissue engineered skeletal muscle. Trends Food Sci. Tech. 21 (2), 59-66 (2010).
- Shansky, J., Chromiak, J., Tatto, M., Vandenburgh, H. A simplified method for tissue engineering skeletal muscle organoids in vitro. In Vitro Cell Dev. Biol. Animal. 33 (9), 659-661 (1997).
- Vandenburgh, H., Del Tatto, M., Shansky, J., et al. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Hum. Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 61 (2), 477-483 (1968).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J. Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Koning, M., Werker, P. M. N., vander Schaft, D. W. J., Bank, R. A., Harmsen, M. C. MicroRNA-1 and MicroRNA-206 Improve Differentiation Potential of Human Satellite Cells: A Novel Approach for Tissue Engineering of Skeletal Muscle. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Darabi, R., Pan, W., Bosnakovski, D., et al. Functional myogenic engraftment from mouse iPS cells. Stem Cell Rev. 7 (4), 948-957 (2011).
- Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., et al. Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells. J. Tissue Eng. Regen. Med. 5 (7), 529-539 (2011).
- van der Schaft, D., van Spreeuwel, A. C., van Assen, H. C., Baaijens, F. Mechanoregulation of vascularization in aligned tissue engineered muscle; a role for VEGF. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Shefer, G., Wleklinski-Lee, M., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells can spontaneously enter an alternative mesenchymal pathway. J. Cell. Sci. 117 (Pt. 22), 5393-5404 (2004).
- Collins, C. A., Olsen, I., Zammit, P. S., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
- Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., Baaijens, F. P. T., van der Schaft, D. W. J., Post, M. J. Essential environmental cues from the satellite cell niche: optimizing proliferation and differentiation. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296 (6), C1338-C1345 (2009).
- Li, Y., Pan, H., Huard, J. Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues. J. Vis. Exp. (41), e2011 (2010).
- Boonen, K. J. M., Langelaan, M. L. P., Polak, R. B., et al. Effects of a combined mechanical stimulation protocol: Value for skeletal muscle tissue engineering. J. Biomech. 43 (8), 1514-1521 (2010).
- Gawlitta, D., Boonen, K. J. M., Oomens, C. W. J., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. The influence of serum-free culture conditions on skeletal muscle differentiation in a tissue-engineered model. Tissue Eng. Part A. 14 (1), 161-171 (2008).
- Koning, M., van Luijn, M., van der Schaft, D. W. J., et al. Human skeletal muscle formation and engraftment In vivo is independent of preconditioning In vitro with HUVEC. , In revision (2013).
- Levenberg, S., Rouwkema, J., Macdonald, M., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nat. Biotechnol. 23 (7), 879-884 (2005).
- Koffler, J., Kaufman-Francis, K., Yulia, S., et al. Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (36), 14789-14794 (2011).
