Summary
Tissu musculaire d'ingénierie a un grand potentiel pour la médecine régénératrice, comme modèle de la maladie et aussi comme une source alternative pour la viande. Nous décrivons ici la technique d'une construction musculaire, dans ce cas, à partir de cellules souches de souris myoblastes, ainsi que la stimulation par des impulsions électriques.
Abstract
Les tissus musculaires modifiées peuvent être utilisées à des fins différentes, qui comprend la production de tissus pour une utilisation en tant que modèle in vitro la maladie, par exemple pour étudier les escarres, pour la médecine régénérative et en tant que solution de rechange 1 viande. Les premières constructions rapportées musculaires 3D ont été faites il ya plusieurs années et pionniers dans le domaine sont Vandenburgh et ses collègues 2,3. Les progrès réalisés dans l'ingénierie des tissus musculaires ne sont pas seulement le résultat du gain vaste connaissance des facteurs biochimiques, les cellules souches et les cellules progénitrices, mais sont en base notamment sur les connaissances acquises par les chercheurs que les facteurs physiques jouent un rôle essentiel dans le contrôle du comportement cellulaire et développement du tissu. State-of-the-art musculaire ingénierie construit actuellement composé de constructions d'hydrogel cellules peuplées. Dans notre laboratoire, ceux-ci sont généralement constitués de cellules murines souches isolées à partir de myoblastes murins, les muscles des membres postérieurs ou une ligne de myoblastes murins C2C12, mixe avec un mélange de collagène / Matrigel et étalées entre deux points d'ancrage, mimant les ligaments musculaires. D'autres cellules peuvent être pris en compte, par exemple, des lignées cellulaires alternatives telles que les myoblastes de rat L6 4, néonatale cellules musculaires précurseurs dérivés 5, les cellules dérivées de tissus musculaires adultes d'autres espèces telles que 6 humaine ou même cellules souches pluripotentes induites (cellules iPS) 7 . La contractilité cellulaire provoque l'alignement des cellules le long de l'axe long de la construction et de 8,9 différenciation des cellules progénitrices musculaires après environ une semaine de culture. En outre, l'application d'une stimulation électrique peut améliorer le processus de différenciation dans une certaine mesure 8. En raison de sa taille limitée (8 x 2 x 0,5 mm), le tissu complet peut être analysée en utilisant la microscopie confocale à surveiller la viabilité, par exemple, la différenciation et l'alignement des cellules. Selon l'application spécifique, les exigences relatives à l'ingéle tissu musculaire rouge varie; par exemple l'utilisation pour la médecine régénérative nécessite la mise à l'échelle de la taille et de la vascularisation des tissus, tandis que pour servir de translation alternatif de la viande à d'autres espèces est nécessaire.
Protocol
1. Culture de myoblastes murins cellules progénitrices ou des cellules C2C12
- Isoler les cellules selon le protocole initialement publié par Shefer et ses collègues 10 et plus tard adapté par Collins et al. 11 et Boonen et al. 12 et les conserver dans l'azote liquide. Cela nécessite la souris, par exemple C57BL / 6. D'autres méthodes sont utilisées dans d'autres laboratoires, par exemple, une méthode publiée dans le Journal of expériences visualisées par Li Y et al. 13. Pour les réactifs et les équipements sont renvoyés au tableau de la page 7 et 8. Depuis le muscle d'une souris, vous aurez généralement obtenir suffisamment de cellules pour la cryoconservation environ 20 flacons dans l'azote liquide. Ensuite, nous commençons le protocole de décongeler les cellules du stockage d'azote liquide.
- Placer les cellules du flacon 1 dans un 25 cm 2 Matrigel (1 mg / ml) revêtu flacon de culture tissulaire et ajouter le milieu de croissance (GM) constitué de (335 ml de DMEM advanced, 100 ml bovin foetale sérum (FBS), 50 ml SH, 5 ml de pénicilline / streptomycine, 5 ml de L-glutamine, 5 ml d'extrait d'embryon de poulet (CEE)).
Remarque: manteau pendant 2 heures à température ambiante et retirez le Matrigel par aspiration.
- Sous-culture des cellules d'environ 1:3 tous les 3 jours.
Cela signifie: jour 3: cellules passage d'un 25 cm 2 à un flacon de 75 cm2, le jour 6: cellules de passage d'un flacon de 75 cm2 à deux flacons de 150 cm2 (avec 30 min de prédépôt dans des flacons non couchés). Le jour 9 transfert unique 150 cm 2 flacon de 1 triple ballon de 150 cm 2, ou à défaut à trois flacons de 150 cm 2 (si nécessaire preplate nouveau en fonction du phénotype des cellules). Le jour 12, les cellules sont prêtes pour l'ensemencement dans une construction musculaire.
Notes: - Par trois fois 150 cm 2 le nombre de cellules sera d'environ 4,5 x 10 6 cellules.
- Utilisez vials de isolements différents pour les mélanger pour obtenir une population mixte de cellules au moment de l'ensemencement.
Remarque: Si vous choisissez de ne pas travailler avec des cellules primaires, myoblastes C2C12 sont une bonne alternative.
2. Ingénierie des tissus musculaires squelettiques
- Préparer la colle silicone en mélangeant le "élastomère" avec le "durcisseur" (10:1). Couper + / - 5 mm segments carrés de Velcro avec un côté triangulaire (maison-comme la forme, la figure 1). Coller le velcro dans les puits d'une plaque de culture à 6 puits dans un espace d'environ 12 mm entre les carrés.
Remarques: - Utilisez uniquement le côté doux du velcro et faire face à ce côté vers le haut.
- Assurez-vous que les toits en face de l'autre.
- Ne couvrez le velcro avec colle silicone, colle ne se propagent pas à travers le puits.
- Pour la stimulation électrique ultérieure, il est pertinent d'aligner les constructions dans le sens vertical du puits jmangé (le long de l'axe long).
- Laisser sécher une nuit dans un four sous vide, pas chauffé, principalement pour éliminer les bulles d'air. Stériliser en ajoutant EtOH à 70% dans les puits et incuber pendant 15 min. Rincer 3x avec PBS et mis sous UV pendant 15 min. Retirez tous PBS dans les puits et le Velcro et le lieu dans l'incubateur jusqu'à leur utilisation.
- Décongeler la solution au réfrigérateur Matrigel et préparer la solution de collagène à la concentration désirée avant d'effectuer rapidement les constructions 3D. Diluer le collagène stérile stock avec l'acide acétique 0,02% (concentration finale de 3,2 mg / ml).
Remarque: tout laisser sur la glace.
- Trypsiniser les cellules, remettre en suspension dans GM et le nombre. Laisser les cellules dans un tube de centrifugation dans l'incubateur.
- Ajouter la quantité voulue de solution de collagène pour le nombre de constructions que vous voulez faire un tube (selon le tableau 1), ajouter 0,5 M NaOH à cette solution de collagène jusqu'à ce qu'une lumière colo roseR indique un pH de 7,5. Mélanger doucement par pipetage de haut en bas et d'éviter la formation de bulles. Puis ajouter le Matrigel et mélanger très délicatement mais soigneusement. Enfin, ajoutez le au mélange GM collagène / Matrigel (pour les quantités appropriées voir tableau 1).
Notes: - Effectuez chaque étape sur la glace! Matrigel et du collagène sera facile de gel à température augmente.
- Occupe-toi que la couleur est bien rose! L'augmentation du pH va également induire une gélification rapide.
- La concentration finale de collagène: 1,6 mg / ml.
- Centrifuger la quantité désirée de cellules à 1000 rpm pendant 5 min et éliminer le surnageant.
Remarque: - En fonction de l'activité des cellules du nombre de cellules par la construction doit être ajusté. En règle générale, le nombre de cellules se situe entre 750.000 et 1.250.000 cellules par construction.
- Utiliser une partie du mélange de gel pour remettre en suspension le culot cellulaireet transférer les cellules dans le mélange restant et mélanger soigneusement, mais sans introduire de bulles d'air.
- Prenez les assiettes préchauffées et hors de l'incubateur et pipette de 0,35 ml -0.4 du mélange de cellules-gel dans le premier Velcro. Puis, commencez à introduire à la pipette le mélange du centre entre les sites de fixation et d'étendre à la bande Velcro. Enfin, utiliser le reste de gel pour combler le fossé entre les ancrages velcro deux et pipettes autour des morceaux de Velcro.
- Vérifiez soigneusement après 5-10 min si les gels sont suffisamment solides pour être transférés, c'est-à tapoter doucement les plats et inspecter visuellement si le gel est rigide. Si c'est le cas, placez soigneusement la vaisselle dans un incubateur. Habituellement, ils peuvent être ramassés au bout de dix minutes. Puis, après hr 1-2, doucement recouvrir chaque gel avec 4 ml d'eau tiède GM.
Remarque:-Ne faites pas de mouvements vigoureux lors de la manipulation des plaques.
- Remplacer par GM milieu de différenciation (milieu de croissancesans extrait d'embryon de poulet) au bout de 24 h, et le remplacer par du milieu frais tous les 2-3 jours. Le jour 7, vous devez avoir obtenu fibres musculaires matures orientées, comme on peut être évaluée avec la coloration pour le développement striation transversale dans les fibres musculaires fusionnées.
3. Stimulation électrique
- Stériliser les électrodes de la plaque ionoptix (voir tableau des réactifs et du matériel) avant de l'utiliser avec de l'éthanol 70% puis séché sous UV dans une enceinte de sécurité. Placer la plaque d'électrodes sur la plaque de culture avec les constructions et couvrir avec le couvercle de la plaque de culture et transfert dans un incubateur. Branchez le Ionoptix C-stimulateur avec les câbles appropriés.
Remarque: Les électrodes sont placées parallèlement aux côtés de la construction musculaire (figure 2).
- Appliquer le protocole de stimulation comme prévu.
Remarque: Nous utilisons généralement 4 V / cm,6 ms impulsions à une fréquence de 2Hz. Changer milieu de culture tous h 24 pendant la stimulation.
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Representative Results
Le produit final sera constructions musculaires, comme indiqué à la figure 3. La taille du tissu sera d'environ 8 mm de long, 2 mm de large et 0,5 mm d'épaisseur. La stimulation électrique au cours de la différenciation va changer l'expression des isoformes de myosine à chaîne lourde, mais n'a pas grandement améliorer le processus de différenciation induite par le support 8 différenciation, mais la stimulation électrique peut également être appliqué à la fin du processus pour vérifier la fonctionnalité du muscle , car un muscle avec sarcomères pleinement développés pourront contracter sur une impulsion électrique.
Différenciation et la maturation peuvent également être analysées à l'aide de PCR quantitative pour l'évaluation et l'expression des gènes de coloration pour des marqueurs de maturation des muscles ou des stries de développement cross (coloration par exemple pour l'alpha actinine) sur des sections soit fabriqués à partir des tissus ou des échantillons entiers de montage des tissus colorés. Maturation des muscles et relativement différenciationted gènes et la myosine à chaîne lourde d'expression comprennent MyoD par exemple, myogénine, MFR4 et MLP, et MYH 1, 2, 4 et 8 8. Preuve que le tissu musculaire qui est formé effet est le tissu musculaire, basée sur l'expression des gènes, colorations immunohistochimiques et l'induction de contraction par stimulation électrique, a été publiée auparavant 8 et un chiffre d'tachés sections de tissus musculaires fabriqués à partir de cellules progénitrices de myoblastes C2C12 et les cellules à partir de ce document est présenté à la figure 4.
| Solution | Volume (si faire 10 muscles) en pl |
| Collagène (3,2 mg / ml, dilué avec de l'acide acétique 0,02%) | 2570 (51,3%) |
| NaOH (0,5 M) | 10 (0,2%) |
| Matrigel | 430 (8,6%) |
| Le milieu de croissance | 2.000 (39,9%) |
| total | 5010 (devrait suffire à renverser et suffisant pour pipetage perte) |
Tableau 1. Mélange de cellules et de gel pour la génération d'un muscle ingénierie tissulaire construire.
Figure 1. Couper les morceaux de Velcro.
Figure 2. Une photo prise de la partie inférieure d'un muscle construire dans un puits d'une plaque 6-puits montrant le placement des électrodes. Les électrodes (indiquée par les flèches blanches) sont placées parallèlement aux constructions musculaires.
Figure 3. Un tissuconçu musculaire entre deux morceaux de velcro dans une plaque de culture à 6 puits.
Figure 4. Des exemples typiques de contre-stries dans C2C12 (A) et MPC (B) en ingénierie des tissus musculaires squelettiques. Coupes congelées de mBAMs non stimulées (8 e jour de différenciation) ont été colorées pour sarcomérique α-actinine (rouge), sarcomérique myosine (vert ) et des noyaux (bleu). (Aa-Ab et Ba-Bb) Grossissements de zones encadrées en (A, B) α-actinine (rouge) et sarcomérique myosine (vert). Reproduit avec la permission de 8. Cliquez ici pour agrandir la figure.
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Discussion
L'ingénierie des tissus musculaires a un grand potentiel pour l'utilisation comme un modèle de la maladie, pour le criblage de médicaments, la médecine régénérative et pour la production de viande. Toutefois, les exigences de ces applications varient. Nous avons choisi de travailler avec une combinaison de collagène et d'matrigel, parce que le collagène permet l'alignement des cellules et parce que les cellules progénitrices de myoblastes nécessitent la présence de protéines de membrane basale dérivés tel que déterminé dans les études précédentes 2D 12. En outre, des gels de fibrine ont été testées dans notre laboratoire et ne semblent pas soutenir les cellules souches C2C12 et myoblastes comme le mélange de collagène et Matrigel ™ et surtout ne pas conduire à 14 compactage des tissus. Le modèle décrit ici a déjà été utilisée dans les études sur les dommages ulcère de pression tout en utilisant une cellule de la ligne 15. Pour les applications en médecine régénérative, la traduction de cellules satellites de l'homme a récemment été accomplis 6,16. En outre,comme une source alternative pour la consommation de viande de la technique a une grande potentiel 1. À notre avis, cependant, la technologie actuelle a besoin pour passer à une prochaine étape pour faire avancer son utilisation dans la clinique ainsi que pour la consommation. Par exemple, la différenciation s'arrête à peu près au stade néonatal et la production de force aussi est beaucoup moins d'un muscle produit in vivo. En outre, bien que les cellules souches de souris, de rat et de l'homme peut être mis en œuvre dans les constructions 3D, l'isolement et surtout la différenciation et la maturation des animaux d'élevage provenant des cellules souches du muscle ne se développe pas encore là 1. En outre, l'utilisation de Matrigel et animale dérivés besoins de sérum pour être omis 1. Pour favoriser l'application dans la médecine régénérative, la taille du tissu doit être augmentée, et nécessite (néo) vascularisation et l'utilisation de systèmes de bioréacteurs perfusion de surmonter les limitations de diffusion de l'oxygène et des éléments nutritifs. Certaines études initiales sur la vascularisation petit constructions have été fait au cours des dernières 9,17,18.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Yabin Wu pour la culture des tissus présentés dans la figure 2, l'image a été prise par Bart van Overbeeke. Ce travail a été soutenu financièrement par SenterNovem, ISO 42022 subvention.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel-growth factor reduced | Beckton and Dickinson | ||
| DMEM (high glucose)* | Gibco | 42430 | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491 | |
| Horse serum | Gibco | 65050-122 | |
| Fetal bovine serum | Greiner | 758075 | |
| 0.45 and 0.22 μm syringe filter* | Whatmann (Schleicher and Scheull) | 10462100 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | |
| Culture plastic | Greiner | Includes culture flasks and pipets | |
| Chick embryo extract | United States Biological | C3999 | |
| Pasteur pipet* | Hilgenberg | Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 0,9 - 1,1 mm | |
| Pasteur pipet* | Hilgenberg | Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 1,4 - 1,6 mm | |
| Pasteur pipet | VWR | 612-1702 | |
| Collagenase type I* | Sigma | C0130-16 | |
| 40 μm cell strainer* | BD Falcon | 352340 | |
| 19G needle | |||
| Elastomer | Dow Corning corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| Curing agent | Dow Corning corporation | Silastic MDX 4-4210# | |
| Velcro | Regular store | You can buy this at a regular store, only use the soft side | |
| Collagen type I, rat tail | BD Biosciences | 3544236 | |
| C-Pace EP Culture Pacer | Ionoptix | ||
| 6-well culture dishes for electrical stimulation | Beckton Dickinson-Falcon | BD Falcon #353846 | |
| C-Dish culture dish electrodes | Ionoptix | ||
| * Needed for the isolation of cells (point 1.1) # Together in one kit |
|||
References
- Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Polak, R. B., et al. Meet the new meat: tissue engineered skeletal muscle. Trends Food Sci. Tech. 21 (2), 59-66 (2010).
- Shansky, J., Chromiak, J., Tatto, M., Vandenburgh, H. A simplified method for tissue engineering skeletal muscle organoids in vitro. In Vitro Cell Dev. Biol. Animal. 33 (9), 659-661 (1997).
- Vandenburgh, H., Del Tatto, M., Shansky, J., et al. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Hum. Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 61 (2), 477-483 (1968).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J. Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Koning, M., Werker, P. M. N., vander Schaft, D. W. J., Bank, R. A., Harmsen, M. C. MicroRNA-1 and MicroRNA-206 Improve Differentiation Potential of Human Satellite Cells: A Novel Approach for Tissue Engineering of Skeletal Muscle. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Darabi, R., Pan, W., Bosnakovski, D., et al. Functional myogenic engraftment from mouse iPS cells. Stem Cell Rev. 7 (4), 948-957 (2011).
- Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., et al. Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells. J. Tissue Eng. Regen. Med. 5 (7), 529-539 (2011).
- van der Schaft, D., van Spreeuwel, A. C., van Assen, H. C., Baaijens, F. Mechanoregulation of vascularization in aligned tissue engineered muscle; a role for VEGF. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Shefer, G., Wleklinski-Lee, M., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells can spontaneously enter an alternative mesenchymal pathway. J. Cell. Sci. 117 (Pt. 22), 5393-5404 (2004).
- Collins, C. A., Olsen, I., Zammit, P. S., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
- Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., Baaijens, F. P. T., van der Schaft, D. W. J., Post, M. J. Essential environmental cues from the satellite cell niche: optimizing proliferation and differentiation. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296 (6), C1338-C1345 (2009).
- Li, Y., Pan, H., Huard, J. Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues. J. Vis. Exp. (41), e2011 (2010).
- Boonen, K. J. M., Langelaan, M. L. P., Polak, R. B., et al. Effects of a combined mechanical stimulation protocol: Value for skeletal muscle tissue engineering. J. Biomech. 43 (8), 1514-1521 (2010).
- Gawlitta, D., Boonen, K. J. M., Oomens, C. W. J., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. The influence of serum-free culture conditions on skeletal muscle differentiation in a tissue-engineered model. Tissue Eng. Part A. 14 (1), 161-171 (2008).
- Koning, M., van Luijn, M., van der Schaft, D. W. J., et al. Human skeletal muscle formation and engraftment In vivo is independent of preconditioning In vitro with HUVEC. , In revision (2013).
- Levenberg, S., Rouwkema, J., Macdonald, M., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nat. Biotechnol. 23 (7), 879-884 (2005).
- Koffler, J., Kaufman-Francis, K., Yulia, S., et al. Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (36), 14789-14794 (2011).
