Summary
우리는 마우스의 복부 대동맥의 한 부분이 단지 allogeneic 또는 syngeneic받는 사람의 신장 동맥 아래에 orthotopically 이식되는 기술을 설명합니다. 이 기술은 균일 한 크기의 큰 동맥의 이식이 유리한 것으로 간주되는 연구에 유용 할 수 있습니다.
Abstract
마우스의 문합을 포함하는 혈관 절차는 일반적으로 어렵고 개별 외과 의사의 기술에 크게 의존 할 것으로 생각됩니다. 이 대부분 사실이지만, 이러한 절차의 어려움을 줄이고 재현성을 향상시킬 수 있습니다 중요한 원칙에는 여러가지가 있습니다. Orthotopic 대동맥 이식은 두 엔드 - 투 - 엔드 문합을 포함하기 때문에 이러한 원칙을 배울 수있는 훌륭한 절차이지만, 일관된 성공을위한 좋은 suturing 기술과 선박의 취급이 필요합니다. 이 절차는받는 사람의 기본 대동맥의 분단 다음 기증자 동물의 복부 대동맥의 길이의 조달과 함께 시작합니다. 조달 대동맥은 다음받는 사람 대동맥의 구분 끝 사이에 위치하여 엔드 - 투 - 엔드 문합을 사용하는 곳으로 봉합되어 있습니다. 이 목표를 성공적으로 농도의 높은 수준, 좋은 도구, 침착, 그리고 감사를 필요로 수행하는 방법을 쉽게마우스 vasculature는 혈전증의 결과로 손상 될 수 있습니다. 이러한 중요한 원칙을 배우는 것은 작은 설치류에 미세을 배우고 대부분의 초보자의 시간을 차지하고이야. 이 프로토콜 전반에 걸쳐, 우리는 다음과 같은 중요한 사항을 참조하십시오. 이 모델은 다른 실험 시스템 1-8의 다양한 혈관 질환을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에 표시된 맥락에서,이 가장 많이 후 이식 혈관 질환, 내막 증식증이 allograft 내에서 발생하는 고체 장기 이식의 일반적인 장기 합병증의 연구에 사용됩니다. 모델의 주요 장점은 양적 morphometric 분석을 용이하게하고 이식 혈관은 추가 제어 구 역할을 할 수있는 내생 선박에 인접 자리 잡고 있다는 것입니다. 여기에 표시된 기술은 가장 자주 18~25g 무게 마우스에 사용됩니다. 우리는 C57BL/6J, BALB / CJ, 그리고 C3H/HeJ의 변종을 사용하여 우리의 경험의 대부분을 축적하고 있습니다.
Protocol
1. Presurgical 준비
- 수술 절차,주의 깊게 수행 방법에 상관없이, 중요한 스트레스의 결과. 이러한 스트레스의 영향을 최소화하고 매장량을 극대화하기 위해 동물을 사용 10,11 전에 최소 72 시간 동안 동식물 사육장에서 유지되어야한다.
- 수술 도구, 거즈, 그리고 면봉은 살균해야합니다. 이 악기 터치 봉합이나 수술 분야의 만 팁을 제공하는 멸균 장갑을 사용할 필요가 없습니다.
- 지혈를 들어, 클램핑 압력이 최소가 필요하다고 필수적입니다. 과도한 압력이나 거친 취급으로 인해 혈관에 손상은 24 시간 이내에 엉덩이 - 다리 마비, 장 국소 빈혈, 죽음의 결과로, 혈전증을 일으킬 것입니다. 우리는 더 이상 2보다 GM / cm 2의 압력으로 클램프를 사용하여 문제를 제거하는 것으로 확인되었습니다. 이 클램프는 표 1에 설명되어 있습니다. 클램프 압력은 높은 품질의 외과 instrumen에 의한 클램프의 사양에 표시되어 있습니다t 제조업체. 우리는 저렴한 클램프 또는 일회용 클램프가 보편적 너무 많은 압력을 발휘하는 것으로 확인되었습니다.
- 담보 선박뿐만 아니라 복부 대동맥의 상대적 위치와 아래 대정맥 (IVC)의 위치는 변형에 따라 달라집니다. 당신은 또한 특히 부수적 인 선박의 위치에서 각각의 생쥐 사이의 작은 차이를 발견하실 수 있습니다.
2. 기부자 운영
- 마우스는 isoflurane (1.5-2.5 %의 유도, 공기의 1.0 % 유지 보수) 또는 (55-65 밀리그램 / kg) pentobarbital과 anesthetized 수 있습니다. Pentobarbital는 시간 제한 (최대 1.5 시간) 부과하지만, 원하는 경우 더 나은 액세스를 위해 동물을 회전 할 수있는 옵션과 함께 외과 의사를 제공합니다. 마취 시간은 수술 중 소장이나 간에 필요로 할 때 마취로부터 2-3 방울을 넣어 2까지 시간까지 연장 할 수 있습니다. 케타민 / xylazine (케타민과 Xylazine, IP 7 MG / kg 100 밀리그램 / kg 체중)도 잘 훈련 외과 의사 인증 기관 (CA)에서 사용할 수 있습니다N 1-1.5 시간 내에 절차를 완료하지만, 좁은 금고 선량 범위를 갖는다. 미국에서는 pentobarbital의 사용 때문에 짧은 공급의 최근 몇 년 동안 더 많은 문제가되고 있습니다. 그것은 마취의 깊이가이 충분한 지 확신 할 수 모니터링하는 것이 필수적입니다. 발가락 - 핀치 반사는 적절한 깊이의 가장 지표 하나는 또한뿐만 아니라 호흡 속도와 다른 움직임을 유의해야합니다.
- 마취 유도 후, 복부 복부에 머리를 제거하는 탈모 젤이나 면도기를 사용합니다.
- 확산 eagled 위치에 고정 실험실 테이프를 사용하여 운영 보드에 동물을 탑재합니다. 금속 운영위원회는 수술 중에 온도 지원을 제공하기 위해 그 아래에는 난방 패드의 사용을 허용합니다. 우리는 수동으로 집에서 사용하기 위해 소비자 학년 단위 난로의 온도를 제어합니다. 온도는 35-38 ° 사이에 유지됩니다. 금속 운영위원회는 절차를 사이에 소독하기에 용이합니다.
- chlorhexidine 같은 살균제를 사용하여 영역을 소독, 에탄올 세척이 나타납니다. 적절한 소독을 확보하기 위해이 절차를 세 번을 반복합니다. 만약 존재한다면이 또한 머리카락의 잔류 컷 조각을 제거합니다.
- 사용 가위는 복부 내장을 노출하는 몸의 벽을 통해 절개를합니다.
- 복부의 큰 혈관을 노출 옆에 내장 밀어, 면봉을 사용합니다. 내장은이 촉촉한 유지 따뜻한 식염수에 침수되어 거즈의 한 부분에 표시됩니다.
- 무딘 절개를 사용하여 매우 신중하게 떨어져 주변 조직에서 복부 대동맥을 해부. 아래 대정맥에서 떨어져 혈관을 해부 매우주의해야합니다. 조심스럽게 올려 코를해야 같은 허리 동맥과 같은 하나 이상의 지점,있을 것입니다. 해부하는 대동맥의 섹션은 신장 혈관 아래에서 대퇴 동맥에 대동맥의 분기 이상이어야합니다. 이 섹션에서는 많은에 기증 소재로 제공 할 수혈관이 존재 분기 및 기증 동물의 크기 얼마나 많은에 따라 두사람 수신자.
- 방금 분기 위의 신장 동맥과 다른 아래 봉합사를 묶어주세요. 사용 가위는 대동맥을 나눈 완전히 200 U / ML의 헤파린을 포함 식염수에 이식을 씻어. 매우 조심스럽게 용기의 한쪽 끝을 잡고 중력에 의해 혈관을 실행하도록 생리 식염수를 똑. 기포가 혈관을 실행하게하지 마십시오. 그렇지 않으면 intima 나중에 혈전증의 결과로 손상 될 수 있습니다 가능한 한 작은으로 혈관의 끝을 처리합니다. 현장에서 제거하고 즉시 얼음처럼 차가운 생리의 컨테이너에 배치합니다. 기증 동물이 ...에게서 피를 뽑다 할 수 있습니다.
3. 받는 운영
- 위의 동물을 마취하고 탈모 젤을 적용하거나 복부에 머리를 제거하는 면도기를 사용합니다. 우리가 0.1 밀리그램 / 진통제를 구축 할 kg에 피하 buprenorphine의 복용량을 관리 절개하기 전에.
- 엠실험실 테이프를 사용하여 운영 분야에 ount는 동물. 동물은 수술하는 동안 체온을 유지 도움이 될 것입니다 따뜻한 운영 단계에 장착해야합니다.
- 그는 말리는 것을 방지하기 위해 눈에 gentamycin의 안과 연고를 적용합니다.
- 에탄올 세척 한 다음 복부를 소독. 적절한 소독을 확보하기 위해이 절차를 세 번을 반복합니다.
- 다음 단계로 이동하기 전에 다시 한 번 마취의 적절성을 확인합니다.
- 아래에있는 조직에 가해진하지 않도록주의하는 것 두 개의 스테이지에서 피부와 바디 벽을 통해 중간 선 절개를합니다.
- 복부 절개가 열려 개최 확장기를 삽입합니다. 방식의 클램프의 대부분을 유지하는 뒷다리 끝 부분 나사 어셈블리를 가리 킵니다.
- 식염수 멸균 거즈의 광장을 습식 및 장내 이상을 배치합니다. 거즈에 부드럽게 손가락으로 장내에서 면봉을 삽입하고 부드럽게 s (으)로 창자를 통해 반영IDE는 그래서 그들은 거즈의 꼭대기에 앉아있다. 거즈의 또 다른 조각을 가지고, 장내에 넣고 식염수 었죠.
- 대동맥과 아래 대정맥 (IVC)를 다루는 모든 지방 조직을 제거합니다. 부드러운합니다. IVC는 매우 약한 것입니다.
- 부드럽게 IVC에서 infrarenal 대동맥을 해부하기 위해 집게를 사용합니다. 그들 사이의 충분한 용기있는 두 개의 클램프을위한 공간을 제공 할 수있을만큼 넓은 지역에 이러한 구분하면, 이식은 봉합 할 수있는 충분한 용기가있을 것입니다, 그런.의 선택을 해제합니다 해부 할 때, 선박 지점을 찾습니다. 필요한 경우는 낮은 온도 cauterizer로를 부식.
- 방금 분기 위의 신장 동맥과 또 하나 아래 혈관 클램프를 삽입합니다.
- 대동맥을 잘라 요. 대동맥의 끝은 보통 5 mm의 공간을 남겨두고 취소됩니다. 지혈를 확인합니다. 클램프가 올바르게 작동하는 경우, 혈액 만 작은 금액은 절단 후 탈출해야합니다. 출혈이 계속되면, 물론 아무 것도 할 수 없습니다하도록 클램프를 확인하는 것은 interfer입니다그들과 들죠. 대동맥의 아무도가 제거되지 않습니다. 그것은 단지 나눈 값입니다.
- heparinized 생리와 컷이 종료 (200 U / ML)를 헹굼 후 면봉으로 추가 솔루션을 제거합니다.
- 각 끝에서 세 불연속 봉합을 사용하여 장소에 압정으로 고정 그라프 트합니다. 그냥 각 끝에서 문합의 한쪽면을 봉합 한 후 연속 실행 봉합 이상의 불연속 봉합과 나머지 입력하십시오. 7 ~ 8 불연속 봉합은 충분합니다. 당신은 실행 봉합를 사용하는 경우, 혈관 벽이 편안한 상태로 유지하고 문합에 협착증의 원인이하지 않는 것이 있는지 확인하십시오.
- 조심스럽게 두개골 끝에서 클램프를 제거하고 봉합 라인에 누출이 있는지 확인하십시오. 삼투의 작은 금액은 OK는 약 1 분 이내에 정차 제공하고 있습니다. 그것보다 더이 있다면, 그것은 출혈을 멈추게하기 위해 하나의 바늘을 사용할 수 있습니다.
- 부드럽게 침수면 작은 주걱으로 문합 사이트 위의 대동맥에 키를 누른 다음 두 번째 클램프를 제거합니다. 부드럽게 눌러몇 번을 해제하고 대동맥이 특허가 나타납니다 있는지 확인합니다. 이식은 즉시 perfused되고 맥박이 표시됩니다.
- 장내를 덮고있는 거즈를 제거 장소로 다시 이동합니다. 소장의 트위스트를 방지하고 정상적인 해부학 적 방향을 유지하고 있습니다.
- 5-0 Vicryl을 사용하여 근육 층을 닫습니다.
- 5-0 또는 6-0 prolene을 사용하여 피부를 닫습니다.
- 5 MG / 마취를 종료하기 전에 진통제를 증가시키기 위해 kg에 carprophen로 피하에 마우스를 취급합니다.
- 마우스 0.5-0.8 ML의 생리에게 피하을 제공합니다.
- 복구 할 수있는 온수 새장에 마우스를 놓습니다. 가 정상적으로 회복되고 있는지 확인하기 위해 복구하는 동안주의 깊게 모니터링 할 수 있습니다. 수술 후 2-3 시간은 마우스가 비교적 정상적으로 작동해야합니다. 12 시간 후 조합에서 진통제를위한 2 밀리그램 / kg에서 피하 buprenorphine과 동물을 취급합니다. 언제든지 동물이 hunched되어있는 경우, 소음을 만들거나 운동의 제한된 범위를 전시, 문제를 조사합니다. 면최종 원인이 설립 고정 할 수없는, 동물 기관 프로토콜에 따라 euthanized해야합니다. 24 시간에있는 동물은 5 밀리그램 / kg에서 피하 carprophen의 다른 복용량을 받으실 수 있습니다. 뒷다리 마비는 실패 문합이나 혈전을 나타냅니다. 이런 상황에서, 동물은 euthanized해야합니다.
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Representative Results
그림 1은 대동맥 이식을 보여줍니다. 흰색 화살표는 봉합 라인을 나타냅니다. 특허 수술이 볼 수 펄스를 표시합니다. 그림 2는받는 사람의 생존은 56일 기간 동안 다음에 한에서 전형적인 실험을 나타냅니다. 한 그룹은 BALB / C 대동맥으로 이식 (C57BL / 6 X FVB) 야생 - 타입받는 마우스로 구성. "KO"지정 다른 그룹은, 24 시간 이내에 이식의 혈전증에 결과 헴 oxygenase-1, 표현의 결함 수신자 (C57BL / 6 X FVB)로 구성되어 있습니다. 특히, 모든받는 사람의 죽음이 결과는 그림과 같이. 그림 3 쇼 에코 IVC와 일반 동물과 이식받는 사람의 복부 대동맥의 측정. 이식은 특허 및 비 이식 대동맥 모양과 비슷합니다.
1 그림.이식 대동맥의 전망을 자랑합니다. 흰색 화살표는 봉합 라인을 나타냅니다.
그림 2. BALB / C 마우스에서 대동맥으로 이식 생쥐 두 그룹에서 대동맥 이식 후 생존의 카플란 - 마이어의 묘사. "KO"는 24-48 시간 내에 대동맥 이식의 혈전증에 결과 헴 oxygenase-1의 표현에 결함받는 사람을 지정합니다. "WT"는 야생 형 littermates를 지정합니다. 에서 재 : 일산화탄소가 allogeneic 대동맥 이식, 첸 B, 구오 L, 팬 C, Bolisetty S, 조셉 R, 라이트 MM, Agarwal, 조지 JF의 동맥 혈전증의 헴 oxygenase-1-결핍 쥐를 구출. J Pathol을입니다. 2009 7월, Elsevier의 허가와 175 (1) :422-9.
FigurE 3. 아래 대정맥 (IVC)과 일반 마우스 (왼쪽 패널)과 대동맥 이식받는 (오른쪽 패널)의 생체 내 복부 대동맥의 이미지 에코. 이미지는 Visualsonics Vevo 660 장비로 생산되었다. 별표는 혈관의 내강을 나타냅니다.
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Discussion
마우스가 잘 immunogenetically 9,12,13 정의되어 있으며, 원하는 경우들이 쉽게 특정 유전자의 표현을 변경하기 위해 조작 할 수 있기 때문에 대동맥 이식의 마우스 모델은 많은 장점을 제공합니다. 도입에 명시된 바와 같이 마우스에 혈관 수술 때문에 선박의 크기 대부분의 모델보다 더 어렵습니다. 같은 대동맥 등의 큰 동맥, 보통 내부 직경 100-200 μm보다 더하지 않습니다, 때문에 이러한 혈관을 조작하는 것은 기술과 민첩성 8,14 상당한 양의가 필요합니다. 단지 시스템을 구현하기 시작 자에 의해이 수술에서 관찰하는 가장 일반적인 합병증은 일반적으로 거친 핸들링 또는 클램핑의 intima의 부상으로 인한 혈전증으로 인한, 엉덩이 - 다리 마비입니다. 미세을위한 도구가 적절한 판매 회사가 판매 클램프의 대부분은 25 GM / cm 2보다 일반적으로 더 큰 압력으로, 마우스에 사용되는 너무 많은 압력을 만들 수 있습니다. CIA에서우리가 사용하는 의원은 2 GM / cm 2, 지혈를 달성하고 혈관을 손상하지 않도록 충분히있는 압력의 압력과 부드러운 있습니다. 일부 의사는 오히려 클램프보다 봉합을 사용하는 것을 선호합니다. 그것이 올바른 압력을 측정하고, 우리의보기에 더 낮은 성공률에 기여 할 수있는 외과 의사의 능력에 크게 의존하는 방법이기 때문에 우리는 이러한 행위를하지 않는 것이 좋습니다. 연습으로, 90 % 또는 더 나은의 생존 속도는 예상해야합니다.
엔드 - 투 - 엔드 문합을위한 기술을 Suturing 것은 경험을 획득하는 중요한 기술입니다. 수술 기술과 수동 손재주와 사전 경험에 따라, 전체 능력은 50-100 절차 후 달성 될 수있다. 더 최근의 연구는 문합을위한 대체 기술이 미래 15 사용할 수 있습니다하는 것이 좋습니다.
이 절차의 주요 제한은 기술의 높은 수준이고, 마우스에서 가장 microsurgical 절차 같은 것입니다우수한 미세 모터 기술없이 성공적으로 실행 및 개인 필요는 능력의 높은 수준을 달성하지 못할 수 있습니다. 그러나, 연습에, 대부분의 개인이 받아 들일 수있는 생존 속도를 달성 할 수 있습니다. 그라프 트의 크기가 아주 작은이기 때문에 조직의 작은 크기는 또한 추가 제한에 결과 때문에 이후 분석을위한 자료의 양이 제한되어 있습니다. 모델의 가장 큰 장점은 생체에서 분자 메커니즘을 해결하기 위해 매우 유용한 실험을 허용, 마우스의 잘 특징 immunogenetics, 수많은 근친 변종, 유전자 변형 마우스 및 녹아웃 마우스의 넓은 객실입니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH P30 오브라이언 센터 (DK 079337)의 핵심 자원의 지원을받는되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vascular Clamps | Fine Science Tools | 00396-01 (Size B-1) | |
| Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11293-00 | |
| 10-0 Needled microsuture | AROSurgical | TK-107038 | |
| Straight scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5620 | |
| Low temperature cauterizer | Beaver-Visitec International | 8441000 | |
| Self retaining retractor | World Precision Instruments | 14240 |
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