Summary
ونحن نقدم طريقة جديدة للحفاظ على الغشاء المخاطي المعوي الإنسان في الثقافة ورصد استجابة لأنواع مختلفة من المحفزات أكثر من 24 ساعة على الأقل. مع أسلوبنا، يتم الحفاظ على قطبية من الأنسجة، والسماح لالتحفيز الفسيولوجية عبر الطريق القمي.
Abstract
وجود عدد قليل من النماذج حاليا لمحاكاة واقعية أمعاء الإنسان المجمع الجزئي للبيئة، حيث مجموعة متنوعة من التفاعلات تأخذ مكان. التوازن السليم يعتمد بشكل مباشر على هذه التفاعلات، لأنها تشكل استجابة مناعية بأكمله يحفز التسامح ضد المستضدات الغذائية بينما في الوقت نفسه تصاعد الاستجابات المناعية فعالة ضد الميكروبات المسببة للأمراض بلعها عن طريق الخطأ مع الغذاء.
هو الحفاظ على توازن الأمعاء أيضا من خلال مختلف التفاعلات المعقدة بين مجهريات البقعة (بما في ذلك المواد الغذائية المرتبطة السلالات البكتيرية النافعة) والدولة المضيفة، التي تنظم المرفقات / تدهور مخاط، وإنتاج الببتيدات المضادة للميكروبات من حاجز الظهارية، و "التعليم" من الخلايا الظهارية 'التي تسيطر على النمط الظاهري مولد للتحمل أو مناعة فريدة من نوعها، الأمعاء مقيم الخلايا اللمفاوية' السكان. وكانت هذه التفاعلات حتى الآن صعبة للغاية مع تكرار في فحوصات المختبرسواء باستخدام خطوط خلايا مستنبتة أو الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى. وبالإضافة إلى ذلك، نماذج الماوس تختلف اختلافا جوهريا في مكونات الغشاء المخاطي المعوي (منظمة طبقة المخاط، المجتمع البكتيريا المتعايشة) مع الاحترام لأمعاء الإنسان. وهكذا، كانت دراسات من مجموعة متنوعة من العلاجات في المثول في عيادات للظروف المهم المرتبطة بالتوتر أو المرضية مثل متلازمة القولون العصبي، مرض التهاب الأمعاء أو سرطان القولون والمستقيم من الصعب القيام بها.
لمعالجة هذه القضايا، ونحن وضعت نظاما الرواية التي تمكننا من حفز إإكسبلنتس من الغشاء المخاطي في الأمعاء البشرية التي تحتفظ بها تكييف في الموقع من قبل مجهريات البقعة المضيفة والاستجابة المناعية، بطريقة الاستقطاب. التحفيز قمية الاستقطاب هو من أهمية كبيرة بالنسبة لنتائج أثارت استجابة مناعية. وقد تبين مرارا وتكرارا أن نفس المحفزات يمكن أن تنتج استجابات مختلفة تماما عندما تجاوز وجه قمية من برنامج التحصين الموسع المعويةحلمة، وتحفيز الخلايا الظهارية basolaterally أو ملامسة مباشرة مع مكونات الصفيحة المخصوصة، والتحول من النمط الظاهري مولد للتحمل لمناعة والتسبب في التهاب غير الضرورية والمفرطة في المنطقة.
حققنا التحفيز الاستقطاب من قبل الإلتصاق اسطوانة الكهف الذي محدد مجال التحفيز على وجه قمية من الغشاء المخاطي كما سيتم موضح في البروتوكول. استخدمنا هذا النموذج لدراسة، من بين أمور أخرى، والآثار التفاضلية من ثلاث سلالات البكتريا المكونة مختلفة. وتبين لنا أن هذا النموذج هو نظام قوي جدا لتقييم الخصائص المناعية من البروبيوتيك في ظروف صحية والمرض.
Protocol
1. الحصول على وإعداد الأنسجة
- يتم الحصول على الأنسجة (صحية أو مرض التهاب الأمعاء المخاطي) أثناء الجراحة. مرة واحدة يتم رفعه العينة نقل إلى المختبر في أسرع وقت ممكن، والحفاظ عليها في كا + + / + المغنيسيوم العازلة HBSS مجانا +-تستكمل مع القلم / بكتيريا في 4 درجات مئوية أو على الجليد.
* حجم العينة يعتمد على توافر النسيج: جزء من الأنسجة التي تم الحصول عليها، هو حصرا ما ليست هناك حاجة للتشخيص ويمكن أن تختلف بشكل كبير بين الاشخاص الاصحاء ومرض التهاب الأمعاء. يتم استئصاله الأنسجة السليمة من المرضى الذين يخضعون لجراحة لسرطان القولون.
- غسل الأنسجة بلطف وتنظيفه من جميع المواد المساريقي. فصل طبقة الغشاء المخاطي من تحت المخاطية باستخدام مقص العقيمة وملقط مع الحفاظ على الأنسجة العازلة في HBSS في طبق بتري (وليس بالضرورة immerged). تلمس سطح الغشاء المخاطي مع ملقط أقل قدر ممكن.
- قطع الغشاء المخاطي في المشارب لا يقل عن 1 جمترا وأطول فترة ممكنة. استخدام اثنين من المشارط معقمة، بكثير كما لو كنت قطع المواد الغذائية الخاصة بك.
- غسل تنظيف الغشاء المخاطي بلطف في HBSS وتمديده على طبق بيتري مع الجانب قمية متجهة لأعلى.
2. تركيب الأنسجة
- إعداد متوسطة جديدة (tisDMEM). استخدام DMEM تستكمل مع الجلوتامين (2 ملم) وNaPyr (1 ملم)، وإضافة 15٪ FBS نا (الجنين المصل البقري - أمريكا الشمالية)، 1٪ ITS-X و 200 نانوغرام / مل EGF في وقت الاستخدام.
- ملء سم طبق بتري 10 مع بقية FBS نا (استخدام حوالي 30 مل بحيث تكون مغمورة تماما شبكات معدنية) وغمر شبكات معدنية. الحفاظ على لوحة فتح ودعم اسطوانات من البلاستيك على الصنبور لها.
* مصنوعة من شبكات معدنية من الحديد. شبكة هو على شكل مربع مع جانب من 0.5 مم.
- يستغرق 3 ميكرولتر من الغراء الجراحية مع 10 أو 20 ماصة ميكرولتر. تطبيقه بعناية إلى واحد من الحدود من اسطوانة بلاستيكية في حين عقد ذلك [ف]IRM مع ملقط.
- وضع بلطف الاسطوانة على الجانب قمية من الغشاء المخاطي، أقرب إلى واحد من حدود قطاع ممكن.
- لإتاحة الوقت الغراء لنعلق بحزم الاسطوانة على النسيج، وإعداد مركز جيدا الجهاز لوحة ثقافة: الاستغناء عن 850 مل ميكرولتر-1 من المتوسطة في مركز جيد ودعم الشبكة المعدنية على حواف لوحة المركزي أيضا.
- قطع بعيدا الأنسجة الزائدة عن الحدود من الاسطوانة باستخدام اثنين من المشارط معقمة كما كان من قبل.
- رفع بلطف الاسطوانة مع النسيج المرفقة ووضع الجانب basolateral على شبكة معدنية في وسط اللوحة.
3. تنبيه
- استخدام المنبهات من اختيارك في تركيز المفضل لديك.
- تطبيق حجم مناسب في وسط الاسطوانة البلاستيكية دون إزعاج اسطوانة أو على سطح المخاطية مع طرف ماصة. تأكد من حجم اخترتها يغطي بشكل موحد على السطح داخل الاسطوانة. فيأحجام dicated:
كبير الاسطوانة البلاستيكية: 200 ميكرولتر
متوسطة البلاستيك اسطوانة: ميكرولتر 100
اسطوانة بلاستيكية صغيرة: 50 ميكرولتر - احتضان لمدة تصل إلى 3 ساعة في حاضنة التقليدية.
* إذا كنت ترغب في احتضان للحصول على نقاط وقتا أطول، تأكد من استخدام حجم أصغر بكثير من المحفزات (10-20 ميكرولتر) ووضعه مباشرة على الأنسجة في جو من 100٪ O 2 في ضغط 1 ATM (انظر 3.5) .
- خذ المتوسطة مع المحفزات من السطح القمي في الأنسجة وعدم استبدال مع متوسطة جديدة، وذلك لأن الأنسجة لا تحصل على ما يكفي O 2 إذا طبقة سميكة من المتوسطة على وجه قمي يمنع تبادل الغازات. تغطية لوحة.
- وضع الأنسجة في جو من 100٪ O 2 في ضغط 1 ATM.
4. حصاد
- بعد 24 ساعة من إجمالي الوقت للثقافة (± 2.5 ساعة) إزالة بعناية الاسطوانة من اله الأنسجة بمساعدة مشرط كشط بلطف الغراء قبالة وتخزينه اعتمادا على التحليل المطلوب (إصلاح لالمناعية و / أو المقايسات المناعي، أو تجميد المفاجئة في N2 السائل لتنقية RNA والجينات التنميط التعبير أو تنقية البروتين والمقايسات لطخة غربية ).
- حصاد المتوسطة basolateral للخلوى إفراز التنميط. الطرد المركزي في 8،000 دورة في الدقيقة لمدة 7 دقائق لتكوير الحطام، ونقل طاف في أنبوب إيبندورف (بدلا من قسامة) وتخزينها على الفور في -20 درجة مئوية.
* إذا كنت تريد أن تبقي supernatants لفترة أطول، وتخزينها في -80 درجة مئوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نجحنا في الحفاظ على الغشاء المخاطي في الأمعاء البشرية السليمة وIBD في الثقافة لمدة 24 ساعة على الأقل الحفاظ على رفاهية الأنسجة. وفقا للملاحظات السابقة 1، وكان هذا ممكنا إلا إذا أخذت معظم الوقت ثقافة (لا يقل عن 85٪ من المجموع) في مكان O 2، والنسيج لم البقاء على قيد الحياة لمدة 24 ساعة في الحاضنات التقليدية (الشكل 2). لقد أظهرنا أيضا أن استجابات مختلفة من إإكسبلنتس يمكن ملاحظتها على هذا النموذج اعتمادا على قطبية من التحفيز (قمية مقابل basolateral) والمناعية من المحفزات 2،3.
باستخدام هذا البروتوكول، وتبين لنا أن سلالات بروبيوتيك المختلفة يمكن أن تثير ردود مختلفة على جزء من الأنسجة و. ثبت الملبنة plantarum NCIMB8826 أن تكون مناعة من المستغرب على الأنسجة السليمة. وخلافا للسلالتين البكتريا المكونة الأخرى، وليس فقط أنها لم تحفز هجرة الخلايا اللمفاوية إلى عنابر السطح العلوي من الغشاء المخاطي، لكنه أيضا إلى حد كبير في upregulated chemokine ذات الصلة لهذه الهجرة، CCL4، وكذلك IL-1B، خلوى المرتبطة تقليديا إلى آخر الموالية للالتهابات. لدهشتنا، على الرغم من أننا قد لاحظت سابقا إجراءات وقائية من L. paracasei في نموذج الفأر من التهاب القولون 4، وهذا لم يترجم إلى الأثر العلاجي عند تطبيق البكتيريا الحية من هذه السلالة على الأنسجة الملتهبة IBD. بدلا من ذلك، أثبتت جميع السلالات الثلاث ضارة عند استخدامها على IBD الغشاء المخاطي في المرحلة الحادة من المرض 2.
علاوة على ذلك، نحن أظهرت أن المنتج الأيضية من الكائنات الحية المجهرية، ودعا postbiotic، قادر على التدريع ظهارة صحي ضد سلالة السالمونيلا الغازية بدلا (FB62)، بينما في نفس الوقت التقليل بشكل كبير التهاب عند تطبيقها على IBD الغشاء المخاطي 2.
_upload/4368/4368fig1.jpg "FO: محتوى العرض =" 5IN "FO: SRC =" / files/ftp_upload/4368/4368fig1hires.jpg "/>
الشكل 1. تمثيل تخطيطي للانشاء والصور. أ. التمثيل التخطيطي للمجموعة حتى ينظر اليها من الجانب، ب. التمثيل التخطيطي للمجموعة حتى ينظر إليها من أعلى، ج. الصورة من الشبكة المعدنية المستخدمة كدعم لل ازدراع. عندما وضعت بشكل صحيح، ويحصل فقط على الجانب basolateral على اتصال مع غرفة متوسطة الوسطى، د. صورة للفرقة كاملة. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل 2. الأنسجة على قيد الحياة فقط الثقافة في O 2. أ. الأنسجة غير مثقف، ثابتة لدى وصوله من غرفة العمليات،
الشكل 3 تأثير التحفيز الموالية للالتهابات على إإكسبلنتس C-: الأنسجة Unstimulated تربيتها لنقاط الوقت المشار إليه؛ سال:. الأنسجة تحدى مع السالمونيلا ومثقف لنقاط الوقت المشار إليه. تدمير الطبقة العليا من البشرة هو بالفعل مرئية في 2 ساعة. يعرض ازدراع انحطاط واسعة بعد 24 ساعة. التكبير الأصلي: 10X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد تم التأكيد على الحاجة إلى النماذج ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية التي علاجات لمخاطية الأمعاء الإنسان يمكن اختبارها بصورة صحيحة طويلة. وقد حدد كثير من الباحثين التحف والعيوب المحتملة في كل خلية 5 و 6 نماذج الماوس المستخدمة حتى الآن لهذا الغرض. في الواقع، حتى لو تم الحصول على بيانات قبل السريرية الواعدة في كثير من الأحيان، وهذه نادرا ما يترجم إلى فائدة سريرية كبيرة.
الطريقة الموضحة في هذا العمل، يقدم التكيف بسيط نسبيا، لكنها فعالة ومبتكرة لالبروتوكولات القائمة 7 و 8 للثقافة والتحفيز من explants الإنسان مخاطية الأمعاء بطريقة الاستقطاب.
هذا النموذج يمكن أن توفر نهجا مكملا ممتازا لتوليد بيانات ما قبل السريرية صالح قبل أخذ العلاج المحتملة من أي نوع إلى العيادات. وبالتالي، النتائج السريرية المؤسف 9 يحتمل ينبغي تجنبها، وتمكن الباحثون من أكثرتعزيز بأمان العلاجات إلى العيادات لمعالجة حالات الالتهابات الحادة.
وتشمل المزايا الرئيسية للنموذج هي إمكانية لمقارنة الاستقطاب مقابل عدم التحفيز والاستقطاب لمتابعة استجابة الأنسجة على مدى فترة زمنية على مدار 24 ساعة. معلمة مهم جدا هو أنه في كل تجربة، يتم تطبيق علاجات مختلفة على إإكسبلنتس القادمة من نفس المريض والذي يسمح مع الأخذ بعين الاعتبار التباين بين المرضى. حقيقة أن إإكسبلنتس ذات حجم كبير نسبيا مقارنة الخزعات يعني أيضا أن مجموعة متنوعة من التحليلات يمكن أن يؤديها على نفس ازدراع، مؤكدا النتائج بطرق مختلفة كثيرة (فحوصات ELISA، rtPCRs الكمية والتحليلات ميكروأري، المناعية و / أو المناعي البيانات). وعلاوة على ذلك، وأنواع أخرى من التحليلات يمكن أن يكون الأمثل في المستقبل، مثل تنقية السكان الخلية من الاهتمام من إإكسبلنتس حفز وتقييم النمط الظاهري من خلال cytofluorimetric analyجهاز الأمن والمخابرات.
ومع ذلك، هناك أيضا القيود الهامة التي ينبغي أخذها في الاعتبار. في شكله الحالي هذا النموذج ليست مناسبة للفحص إنتاجية عالية من عدد كبير من العلاجات، كما أنها تعتمد على توافر الأنسجة. نماذج ثقافة الخلية هي على الأرجح أكثر ملاءمة لهذا الغرض كما أنها أسهل في التعامل معها وتنفيذ عدد كبير من التحفيز على 10 في حين أن نموذج وصفنا شأنه أن تستخدم في اختبار نهاية العلاجات مرشح قبل دخول العيادات بشكل أكثر كفاءة. وعلاوة على ذلك، والإطار الزمني خلالها نجحنا في الحفاظ على بقاء الأنسجة لا يسمح للتجارب التي تتطلب فترات طويلة الرصد، مثل تدخل الحمض النووي الريبي. وأخيرا، يتم تحفيز البكتيريا في حاضنة العادية، ولا تسمح للحفاظ على أو اختبار تأثير البكتيريا اللاهوائية. ومن عزمنا على العمل على هذه القضايا في المستقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر اريكا Mileti حصول على الدعم الفني ممتاز والدكتور أنطونيو دي Sabatino لتوفير غرف الأكسجين.
التمويل: وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من برنامج الاتحاد الأوروبي 7 إطار (IBDase، ERC: Dendroworld) وFONDAZIONE Cariplo إلى MR والدعم من قبل شبكة كوري التنقل الدولي للتدريب ماري (عبر الحديث، اتفاقية منحة رقم: 21553-2) إلى KT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 10X HBSS | Eurocalne | ECM4006XL | |
| Peni/Strepto | Lonza | DE17602E | |
| Gentamycin | Gibco | 15750-037 | |
| DMEM | Lonza | BE12614 | |
| FBS-Na | Gibco | 16000-044 | |
| 100X ITS-X | Gibco | 51500-056 | |
| EGF | Tebu-bio | 100-15 | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17605E | |
| Non essential aminoacids 100X | Gibco | 11140-035 | |
| NaPyr | Gibco | 11360-039 | |
| Materials | |||
| Cloning cylinders 6x8 mm | BellCo | 2090-00608 | |
| Cloning cylinders 8x8 mm | BellCo | 2090-0080 | |
| Cloning cylinders 10x10 mm | BellCo | 2090-01010 | |
| Metal grids | Home made | ||
| Centre well organ culture plate | BD Falcon | 353037 | |
| Surgical glue (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Oxygen Jars | Home made | ||
| Oxygen tanks | Air Liquid Sanità | ||
References
- Schuller, S., Lucas, M., Kaper, J. B., Giron, J. A., Phillips, A. D. The ex vivo response of human intestinal mucosa to enteropathogenic Escherichia coli infection. Cell. Microbiol. 11, 521-530 (2009).
- Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. , (2012).
- Tsilingiri, K., Rescigno, M. Should probiotics be tested on ex vivo organ culture models? Gut Microbes. , Manuscript in preparation (2012).
- Mileti, E., Matteoli, G., Iliev, I. D., Rescigno, M. Comparison of the immunomodulatory properties of three probiotic strains of Lactobacilli using complex culture systems: prediction for in vivo efficacy. PLoS One. 4, e7056 (2009).
- Cencic, A., Langerholc, T. Functional cell models of the gut and their applications in food microbiology--a review. Int. J. Food Microbiol. 141, Suppl 1. S4-S14 (2010).
- te Velde, A. A., Verstege, M. A., Hommes, D. W. Critical appraisal of the current practice in murine TNBS-induced colitis. Inflamm. Bowel Dis. 12, 995-999 (2006).
- Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture. J. Anat. 134, 459-469 (1982).
- Browning, T. H., Trier, J. S. Organ culture of mucosal biopsies of human small intestine. J. Clin. Invest. 48, 1423-1432 (1969).
- Besselink, M. G., et al. Probiotic prophylaxis in predicted severe acute pancreatitis: a randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 371, 651-659 (2008).
- Lakhdari, O., et al. Identification of NF-kappaB modulation capabilities within human intestinal commensal bacteria. J. Biomed. Biotechnol. 2011, 282356 (2011).
