Summary
Introduzimos um novo método para a manutenção da mucosa intestinal humana em cultura e monitorização da resposta a vários tipos de estímulos durante pelo menos 24 horas. Com o nosso método, a polaridade do tecido é mantida, o que permite um estímulo fisiológico por via apical.
Abstract
Existem poucos modelos atualmente para simular realisticamente micro-ambiente do complexo do intestino humano, onde uma variedade de interações ocorrem. Homeostase adequada depende directamente estas interacções, visto que todo modelar uma resposta imunológica induzir tolerância contra os antigénios dos alimentos, enquanto ao mesmo tempo de montagem respostas imunes eficazes contra micróbios patogénicos acidentalmente ingeridas com alimentos.
Homeostase intestinal também é preservada através de várias interacções complexas entre a microbiota (incluindo as estirpes bacterianas benéficas associadas ao alimento) e do hospedeiro, que regulam a fixação / degradação do muco, da produção dos péptidos antimicrobianos, através da barreira epitelial, e a "formação" do células epiteliais ", que controla o fenótipo tolerogenic ou imunogênica de únicas, gut-residentes células linfóides das populações. Estas interacções têm sido muito difíceis de reproduzir com ensaios in vitroutilizando quer linhas de células cultivadas ou de células mononucleares do sangue periférico. Além disso, os modelos de rato diferem substancialmente em componentes da mucosa intestinal (organização da camada de muco, a comunidade de bactérias comensais) com respeito ao intestino humano. Assim, os estudos de uma grande variedade de tratamentos para ser interpostos nas clínicas para as condições relacionadas com o stress ou patológicos importantes, tais como a síndrome do intestino irritável, doença inflamatória do intestino ou o cancro colo-rectal têm sido difíceis de realizar.
Para tratar dessas questões, foi desenvolvido um novo sistema que nos permite estimular explantes de mucosa intestinal humana, que mantêm o seu in situ condicionado pela microbiota de acolhimento e resposta imune, de forma polarizada. Estimulação apical polarizada é de grande importância para o resultado da resposta imunitária induzida. Tem sido repetidamente demonstrado que os mesmos estímulos podem produzir respostas completamente diferentes quando ignorar a cara apical do epi intestinalthelium, estimulando as células epiteliais basolateralmente ou entrar em contato direto com os componentes da lâmina própria, mudando o fenótipo de tolerogenic para imunogênica e causando inflamação excessiva e desnecessária na área.
Conseguimos estimulação polarizada por colagem de um cilindro caverna que a área delimitada da estimulação na cara apical da mucosa, como será descrito no protocolo. Nós usamos este modelo para examinar, entre outros, os efeitos diferenciais de três estirpes diferentes de bactérias lácticas. Mostramos que este modelo de sistema é muito poderoso para avaliar as propriedades imunomoduladoras de probióticos em condições saudáveis e doença.
Protocol
1. Obtenção e Preparação do tecido
- Tissue (saudável ou IBD mucosa) é obtido durante a cirurgia. Quando a amostra é excisada transferência para o laboratório, logo que possível, mantendo-o em Ca + + / Mg + + tampão HBSS suplementado com Pen / Strep a 4 ° C ou sobre gelo.
* O tamanho da amostra depende da disponibilidade do tecido: a parte do tecido obtido, é que não é estritamente necessária para o diagnóstico e pode variar bastante entre indivíduos saudáveis e IBD. Tecido sadio é retirado de pacientes submetidos à cirurgia de câncer de cólon.
- Lave o tecido com cuidado e limpe-o de todo o material mesentérica. Separa-se a camada mucosa a partir da submucosa utilizando tesouras e pinças esterilizadas, mantendo o tecido em tampão HBSS numa placa de Petri (não necessariamente imersas). Tocar a superfície da mucosa com a pinça tão pouco quanto possível.
- Corte mucosa em listras pelo menos um cm de largura e tanto tempo quanto possível. Utilize dois bisturis estéreis, tanto quanto se estivesse cortando seu alimento.
- Lavar limpar suavemente mucosa em HBSS e estendê-la numa placa de Petri, com o lado apical voltada para cima.
2. Montagem do Tissue
- Prepare meio fresco (tisDMEM). Use DMEM suplementado com glutamina (2 mM) e de NaPyr (1 mM), e adicionar 15% de FBS-Na (Fetal Bovine Serum - norte-americana), 1% de ITS-X e de 200 ng / ml de EGF, no momento da utilização.
- Encha de 10 cm de uma placa de Petri com o resto da SBF-Na (cerca de 30 ml de utilizar de modo a que as redes de metal será completamente submersa) e submergir as grelhas de metal. Mantenha a placa de abrir e apoiar os cilindros de plástico em sua torneira.
* As grades de metal são feitos de ferro. A malha é de forma quadrada com um lado de 0,5 mm.
- Aqui 3 ul de cola cirúrgica com uma pipeta de 10 ou 20 ul. Aplique-o cuidadosamente a uma das fronteiras de um cilindro de plástico, mantendo-fIRM com a pinça.
- Suavemente colocar o cilindro no lado apical da mucosa, tal como próximo de uma das bordas da tira possível.
- Para se obter o tempo de cola para fixar firmemente o cilindro sobre o tecido, se preparar a placa de cultura de órgãos de centro bem: Pipetar 850 mL-1 ul do meio no centro do poço e apoiar a grade de metal nas bordas da cavidade central da placa.
- Corte o excesso de tecido das bordas do cilindro usando dois bisturis estéreis como antes.
- Suavemente levantar o cilindro com o tecido ligado e colocar o lado basolateral da grelha de metal no centro do prato.
3. Estimulação
- Use os estímulos de sua escolha em sua concentração preferido.
- Aplicar volume apropriado no centro do cilindro de plástico, sem perturbar o cilindro ou a superfície da mucosa com a ponta da pipeta. Verifique se o seu volume de escolhido cobre uniformemente a superfície interna do cilindro. Emvolumes dicated:
Cilindro de plástico grande: 200 ul
Médio plástico do cilindro: 100 mL
Cilindro de plástico de pequeno porte: 50 ul - Incubar por até 3 horas em uma incubadora convencional.
* Se você deseja incubar por momentos mais longos, certifique-se de usar um volume muito menor de estímulos (10-20 mL) e coloque diretamente no tecido em uma atmosfera de 100% O 2 na pressão de 1 atm (ver 3.5) .
- Tome o meio com os estímulos fora da superfície apical do tecido e não substitui com meio fresco, porque o tecido não se cansa O 2 se uma espessa camada de meio na face apical impede a troca gasosa. Cubra o prato.
- Colocar o tecido numa atmosfera de 100% de O2 na pressão de 1 atm.
4. Colheita
- Depois de 24 horas de tempo de cultivo total (± 2,5 hr) retire cuidadosamente o cilindro a partir de diade tecido e com a ajuda de um escalpelo cola raspando suavemente e armazená-lo em função da análise desejada (corrigir para imuno-histoquímica e / ou ensaios de imunofluorescência, encaixe ou por congelamento em N2 líquido para purificação de RNA e de perfis de expressão de genes ou a purificação de proteínas e ensaios de Western blot ).
- Colha o meio basolateral para o perfil de secreção de citocinas. Centrifugar a 8000 rpm durante 7 min para detritos da pelota, transferir o sobrenadante num tubo Eppendorf (alternativamente aliquota) imediatamente e armazenar a -20 ° C.
* Se você quiser manter sobrenadantes por mais tempo, armazená-los à temperatura de -80 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Conseguimos manter a mucosa intestinal humana saudável e IBD em cultura por pelo menos 24 horas preservando o bem-estar do tecido. Em conformidade com as observações anteriores 1, isto foi apenas possível se a maior parte do tempo de cultura (de pelo menos 85% do total) foi realizada em O 2, tal como o tecido não sobreviveram durante 24 horas em incubadoras convencionais (Figura 2). Mostramos também que as diferentes respostas de explantes pode ser observado neste modelo, dependendo da polaridade da estimulação (apical vs basolateral) e a imunogenicidade dos estímulos 2,3.
Usando este protocolo, vamos mostrar que diferentes cepas probióticas pode provocar diferentes respostas por parte do tecido. Lactobacillus plantarum NCIMB8826 provou ser surpreendentemente imunogênica em tecido saudável. Ao contrário do que as outras duas estirpes de lactobacilos, não só é induzir a migração de células linfóides para o alas da superfície superior da mucosa, mas também significativamente regulada positivamente uma quimioquina relevantes para esta migração, CCL4, bem como a IL-1b, uma citocina, tradicionalmente, relacionada com a actividade pró-inflamatória. Para nossa surpresa, embora tivéssemos observado anteriormente uma ação preventiva de L. paracasei em um modelo do rato de colite 4, isso não se traduziu de um efeito curativo quando bactérias vivas desta estirpe foram aplicadas sobre o tecido inflamado IBD. Pelo contrário, todas as três estirpes mostrou-se prejudicial quando usado em IBD mucosas na fase aguda da doença 2.
Além disso, mostrámos que o produto metabólico de um probiótico, chamado postbiotic, é capaz de proteger o epitélio saudável contra uma estirpe de Salmonella bastante invasiva (FB62), enquanto ao mesmo tempo melhora significativamente a inflamação, quando aplicados na mucosa IBD 2.
_upload/4368/4368fig1.jpg "fo: content-width =" 5 polegadas "fo: src =" / files/ftp_upload/4368/4368fig1hires.jpg "/>
Figura 1. Representação esquemática da configuração e fotografias. Uma. Representação esquemática do conjunto se visto de lado, b. Representação esquemática do conjunto se visto de cima, c. Foto da grade de metal usado como suporte para o explante. Quando corretamente colocado, apenas o lado basolateral entra em contato com a câmara de médio central, d. Foto de todo o conjunto. Clique aqui para ver a figura maior .
Figura 2. O tecido só sobrevive cultura em O 2. Um tecido. Inculto, fixada no momento da chegada da sala de operações,
Figura 3 O efeito de um estímulo pró-inflamatória nos explantes C-: tecido não estimulados cultivados para os pontos de tempo indicados; Sal:.. Tissue desafiados com Salmonella e cultivados para os pontos de tempo indicados. A destruição da camada superior do epitélio é já visível a 2 horas. O explante apresenta grande degeneração após 24 hr. Ampliação Original: 10X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A necessidade de modelos fisiologicamente relevantes em que os tratamentos para mucosa intestinal humana pode ser validamente testados tem sido enfatizada. Muitos pesquisadores têm identificado potenciais artefatos e defeitos tanto na célula 5 e 6 modelos de mouse usado até agora para esse fim. Na verdade, mesmo que os dados pré-clínicos promissores é muitas vezes obtido, estes raramente se traduzem em benefícios clínicos significativos.
O método descrito neste trabalho, apresenta uma adaptação relativamente simples, mas eficaz e inovador para os protocolos existentes, 7, 8, para a cultura de explantes e estimulação da mucosa intestinal humana de uma forma polarizada.
Esse modelo poderia proporcionar uma excelente abordagem complementar para a geração de dados pré-clínicos válidos antes de tomar um potencial tratamento de qualquer tipo para as clínicas. Assim, os resultados clínicos infelizes nove poderiam ser evitados e pesquisadores poderia maispromover segurança tratamentos para as clínicas para o tratamento de condições inflamatórias agudas.
As principais vantagens do modelo são a possibilidade de comparar estimulação versus não polarizado e para seguir a resposta do tecido ao longo de um período de tempo de 24 horas. Um parâmetro muito importante é que em todas as experiências, os diferentes tratamentos são aplicados a partir de explantes provenientes do mesmo paciente, que permite ter em conta a variabilidade entre doentes. O facto de os explantes são de um tamanho relativamente grande em comparação com biópsias significa também que uma variedade de análises podem ser realizadas no mesmo explante, confirmando os resultados de muitas maneiras diferentes (testes ELISA, rtPCRs quantitativos, análises de microarray, imuno-histoquímica e / ou imunofluorescência dados). Além disso, outros tipos de análises podem ser optimizados no futuro, tais como a purificação de populações de células de interesse a partir de explantes estimuladas e avaliação do seu fenótipo de citometria de fluxo por anásis.
No entanto, também existem limitações importantes a serem levados em conta. Na sua forma actual, este modelo não é adequado para o rastreio de alto rendimento de um grande número de tratamentos, uma vez que depende da disponibilidade do tecido. Modelos de cultura de células são provavelmente mais adequada para o efeito porque são mais fáceis de manipular e realizar um grande número de estímulos em 10 ao passo que o modelo que descrevem de forma mais eficiente seria usado como o teste de tratamentos candidatos final antes de entrar nas clínicas. Além disso, o período de tempo durante o qual conseguimos preservar a viabilidade do tecido não permite experimentos que requerem longos períodos de monitoramento, tais como interferência de RNA. Por último, a estimulação bacteriana é realizada numa incubadora regular e não permite a preservação ou testando o efeito de bactérias anaeróbicas. É nossa intenção de trabalhar sobre estas questões no futuro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos Erika Mileti para excelente suporte técnico e Dr. Antonio Di Sabatino para fornecer as câmaras de oxigênio.
Financiamento: Este trabalho foi financiado por doações do sétimo programa-quadro da UE (IBDase, ERC: Dendroworld) e Fundação Cariplo para MR e suporte por um Curie rede de mobilidade internacional de formação Marie (Cross-Talk, subvenção No: 21553-2) para KT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 10X HBSS | Eurocalne | ECM4006XL | |
| Peni/Strepto | Lonza | DE17602E | |
| Gentamycin | Gibco | 15750-037 | |
| DMEM | Lonza | BE12614 | |
| FBS-Na | Gibco | 16000-044 | |
| 100X ITS-X | Gibco | 51500-056 | |
| EGF | Tebu-bio | 100-15 | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17605E | |
| Non essential aminoacids 100X | Gibco | 11140-035 | |
| NaPyr | Gibco | 11360-039 | |
| Materials | |||
| Cloning cylinders 6x8 mm | BellCo | 2090-00608 | |
| Cloning cylinders 8x8 mm | BellCo | 2090-0080 | |
| Cloning cylinders 10x10 mm | BellCo | 2090-01010 | |
| Metal grids | Home made | ||
| Centre well organ culture plate | BD Falcon | 353037 | |
| Surgical glue (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Oxygen Jars | Home made | ||
| Oxygen tanks | Air Liquid Sanità | ||
References
- Schuller, S., Lucas, M., Kaper, J. B., Giron, J. A., Phillips, A. D. The ex vivo response of human intestinal mucosa to enteropathogenic Escherichia coli infection. Cell. Microbiol. 11, 521-530 (2009).
- Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. , (2012).
- Tsilingiri, K., Rescigno, M. Should probiotics be tested on ex vivo organ culture models? Gut Microbes. , Manuscript in preparation (2012).
- Mileti, E., Matteoli, G., Iliev, I. D., Rescigno, M. Comparison of the immunomodulatory properties of three probiotic strains of Lactobacilli using complex culture systems: prediction for in vivo efficacy. PLoS One. 4, e7056 (2009).
- Cencic, A., Langerholc, T. Functional cell models of the gut and their applications in food microbiology--a review. Int. J. Food Microbiol. 141, Suppl 1. S4-S14 (2010).
- te Velde, A. A., Verstege, M. A., Hommes, D. W. Critical appraisal of the current practice in murine TNBS-induced colitis. Inflamm. Bowel Dis. 12, 995-999 (2006).
- Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture. J. Anat. 134, 459-469 (1982).
- Browning, T. H., Trier, J. S. Organ culture of mucosal biopsies of human small intestine. J. Clin. Invest. 48, 1423-1432 (1969).
- Besselink, M. G., et al. Probiotic prophylaxis in predicted severe acute pancreatitis: a randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 371, 651-659 (2008).
- Lakhdari, O., et al. Identification of NF-kappaB modulation capabilities within human intestinal commensal bacteria. J. Biomed. Biotechnol. 2011, 282356 (2011).
