Summary
私たちは、少なくとも24時間以上の刺激の様々なタイプに対応しての文化やモニタリングにおけるヒト腸粘膜の維持のための新規な方法をご紹介します。我々の方法では、組織の極性が尖経路で生理的刺激を可能にし、維持されている。
Abstract
いくつかのモデルは、現在現実的に相互作用の様々な場所を取る複雑な人間の腸内の微小環境をシミュレートするために存在します。誤って食物と一緒に摂取した病原性微生物に対して効果的な免疫応答をマウントすると同時に、彼らは食物抗原に対する全体の免疫応答誘導耐性を形作るように適切な恒常性を直接、これらの相互作用に依存する。
腸の恒常性は粘液のアタッチメント/劣化を規制する微生物（食品関連の有益な細菌株を含む）とホストの間の様々な複雑な相互作用を介しても保存され、上皮バリアによって抗菌ペプチドの産生、および "教育"集団 'ユニーク、腸常駐リンパ系細胞の免疫寛容や免疫表現型を制御する'を上皮細胞。これらの相互作用は、in vitroアッセイを再現するこれまでのところ非常に困難であった培養された細胞系または末梢血単核細胞のいずれかを使用して。また、マウスモデルは、ヒトの腸に関して腸粘膜（粘液層の組織、共生細菌のコミュニティ）の構成成分で大きく異なる。したがって、このような過敏性腸症候群、炎症性腸疾患または結腸直腸癌などの重要なストレス関連または病理学的状態のために診療所に持ち込まれる治療の様々な研究が行うことが困難であった。
これらの問題に対処するために、我々は我々が分極方法で、ホストの細菌叢と免疫応答によりその場コンディショニングで自分を維持する人間の腸粘膜の外植片を刺激することができた新規のシステムを開発しました。偏尖刺激の結果のために非常に重要である免疫応答を誘発した。これを繰り返し、それらが腸エピの先端面をバイパスするときに、同じ刺激が全く異なる応答を生成できることが示されている乳房、免疫原性への寛容原性の表現型をスイッチング領域に不要な過剰な炎症を引き起こし、基底外側上皮細胞を刺激または粘膜固有層コンポーネントと直接接触する。
私たちは、接着することで、プロトコルに記載されるように粘膜の頂端面上に区切られた刺激の面積洞窟シリンダーを分極刺激を達成しました。我々は他の人、三つの異なる乳酸菌株の差の影響の中で、検討するために、このモデルを使用していました。我々はこのモデルシステムは、健康と病気の条件でプロバイオティクスの免疫調節特性を評価することは非常に強力であることを示している。
Protocol
1。入手とティッシュの準備
- 組織（健康またはIBD粘膜）が手術中に得られる。一度試料を4℃または氷上でペニシリン/ストレプトマイシンを補充したのCa + + / Mg + +を含まフリーHBSSバッファにそれを維持、できるだけ早く研究室に転送を切除されています。
*試料の大きさは、組織の可用性に依存します。得られた組織の一部は、診断のために必要とされておらず、健康でIBDの被験者間で大きく異なることがあります何厳密です。健康な組織は、大腸癌の手術を受けた患者から切除されています。
- そっとティッシュを洗って、すべての腸間膜の材料でそれをきれいに。ペトリ皿（必ずしも漬せず）内にHBSSバッファで組織を維持しながら、滅菌ハサミとピンセットを用いて粘膜から粘膜層を分離する。できるだけ少ないようにピンセットで粘膜表面をタッチします。
- 少なくとも1 cがストライプ状に粘膜をカットメートル幅とできるだけ長く。あなたは食品を切断されたかのように多く、2滅菌メスを使用してください。
- HBSSに優しくクリーンな粘膜を洗浄し、上向きに直面している頂端側をシャーレの上に広げる。
2。ティッシュの取り付け
- 新鮮な培地（tisDMEM）を準備。 DMEMはグルタミン（2 mM）をとNaPyr（1mMの）を補充し使用し、FBS - Naは15％を追加（ウシ胎児血清 - 北米）、1％ITS-Xおよび使用時の200 ngの/ mlのEGF。
- FBS-ナ（金属グリッドが完全に水没されるように約30mlを使用してください）と水没金属グリッドの残りの部分と10センチメートルシャーレを埋める。プレートを開いたままにし、そのタップのプラスチック製のシリンダーをサポートしています。
*金属グリッドは、鉄で作られている。メッシュは0.5mmの辺を有する正方形である。
- 10または20μlのピペットを用いて外科的接着剤の3μLを取る。 fは、それを保持しながら、プラスチックシリンダーの境界のいずれかに慎重にそれを適用します鉗子でIRM。
- 静かにできるだけ近いストリップの境界のいずれかに、粘膜の頂端側にシリンダーを配置。
- しっかりと組織上のシリンダーを接続するために接着剤の時間を与えるために、センターウェル器官培養プレートを準備：よく中央に培地850μL-1ミリリットルを分注し、ウェルプレートの中央の端に金属グリッドをサポートしています。
- 前のように2つの滅菌メスを使用してシリンダーの境界線から余分な組織を切り取る。
- 優しく添付組織とシリンダーを持ち上げ、プレートの中央に金属グリッドに基底側に置く。
3。刺激
- お好みの濃度でお好みの刺激を使用してください。
- ピペットチップでシリンダや粘膜表面を乱すことなく、プラスチックシリンダーの中心に適切な音量を適用します。選択したボリュームが均一にシリンダ内表面を覆っていることを確認してください。でdicatedボリューム：
大型プラスチックシリンダー：200μlの
ミディアムプラスチックシリンダー：100μlの
小さなプラスチック製のシリンダー：50μlの - アップ従来のインキュベーター内で3時間までインキュベートする。
*あなたが長い時点インキュベートしたい場合は、（3.5を参照）を使用すると、刺激のはるかに小さい音量（10〜20μL）を使用していることを確認し、直接、1気圧の圧力では100％O 2雰囲気中で組織を配置。
- 頂端面上の媒体の厚い層がガス交換ができない場合、組織が2 O十分に取得していないので、組織の先端面からの刺激と培地を取り、新鮮な培地と交換しないでください。 プレートをカバーしています。
- 1気圧の圧力では100％O 2雰囲気中で組織を置きます。
4。収穫
- 総培養時間（±2.5時間）の24時間後、注意深く番目からシリンダーを取り外すメス優しくこするグルーオフの助けを借りて、電子ティッシュ、それは希望の解析（RNAの精製および遺伝子発現プロファイリングやタンパク質精製およびウェスタンブロットアッセイのための液体窒素中で免疫組織化学、および/または免疫蛍光アッセイの修正、またはスナップ凍結に応じて保管）。
- サイトカイン分泌プロファイリングのための基底培地を収穫。ペレット破片〜7分間8,000 rpmで遠心分離し、エッペンドルフチューブ（あるいはアリコート）で上清を転送し、直ちに-20℃で保存し
*あなたが長い上清を維持したい場合には、-80℃で保管し℃まで
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
私たちは、組織の健康を維持し、少なくとも24時間、文化の中で、健康でIBD人間の腸粘膜を維持することに成功しました。組織は、従来のインキュベータで24時間（ 図2）が生存しなかったとして、培養時間の大部分（全体の少なくとも85％）は、O 2で行われた場合、以前の観測値1によれば、これは可能であった。また、外植片の異なる応答を刺激（頂端対側底）と刺激2,3の免疫原性の極性に応じて、このモデルで観察することができることを示している。
このプロトコルを使用して、我々は別のプロバイオティック株は、組織の一部に異なる応答を誘発できることを示す。 ラクトバチルス·プランタラムNCIMB8826は、健康な組織に対する驚くべきことに、免疫原性であることが判明した。他の二つの乳酸菌株に反して、それはにリンパ系細胞の遊走を誘導しなかっただけで病棟粘膜の最表面が、それはまた、大幅にこの移行、CCL4ならびにIL-1bは、伝統的に炎症誘発性の活性に関連するサイトカインに関連するケモカインをレギュレート。驚いたことに、にもかかわらず、我々は以前にLの予防行動を観察していたこの株の生菌が炎症IBD組織に適用されたとき炎4のマウスモデルにおけるパラカゼイ 、これは治療効果に変換されていませんでした。病気2の急性期におけるIBD粘膜に使用した場合ではなく、すべての3つの株が有害を証明した。
さらに、我々は、IBD粘膜2上に塗布する際に同時に大幅に炎症を改善しながらpostbioticと呼ばれるプロバイオティクスの代謝生成物は、むしろ、侵襲性サルモネラ株 （FB62）に対して健康な上皮を遮蔽することが可能であることを示した。
_upload/4368/4368fig1.jpg "FO：コンテンツ幅=" 5インチ "のfo：SRC =" / files/ftp_upload/4368/4368fig1hires.jpg "/>
図1の支持体として使用される金属格子のセットアップや写真の模式図。アップ側から見たセットの概略図、B。アップトップ、Cから見たセットの概略図。写真植。正しく配置された場合、唯一の基底側は、中央メディア室、dで接触して取得します。全体のアンサンブルの写真は大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2組織だけO 2の文化を存続。手術室からの到着時に修正されました。教養のない組織では、
図3外植片に炎症誘発刺激の影響C-：示した時点培養非刺激組織、 サル：。組織はサルモネラでチャレンジし、指示された時点で培養。上皮の上位層の破壊は、すでに2時間で表示されます。外植片は、24時間後に大規模な退化を提示します。オリジナル倍率：10X。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ヒト腸粘膜の治療が正当に試験することができるれた生理学的に関連するモデルの必要性が強調されている長い。多くの研究者がその目的のためにこれまで使用されるセル5及び6マウスモデルの両方で潜在的なアーティファクトや欠陥を同定した。有望な前臨床データは、多くの場合、取得されていても実際、これらはほとんど重要な臨床的利益のために翻訳しません。
この作品に記載されている方法は、偏光方式で人間の腸粘膜植の文化と刺激のための既存のプロトコル7、8、比較的シンプルでありながら効果的かつ斬新な適応を提示します。
このモデルでは、診療所にどのような種類の潜在的な処置を取る前に有効な前臨床データを生成するための優れた補完的なアプローチを提供することができます。このように、不幸な臨床転帰9は、潜在的に避けることができると研究者たちは、より可能性安全に急性の炎症状態の処理のためにクリニックに治療を推進しています。
モデルの主な利点は、偏光と非偏光の刺激を比較すると、24時間の時間枠にわたって組織の応答に従うことが可能です。非常に重要なパラメータは、すべての実験では、別の治療が患者との間でアカウント変動を考慮でき、同じ患者からの外植片に適用されるということです。外植片は、生検と比較して相対的に大きいサイズであるという事実はまた、さまざまな方法で結果を確認し、様々な分析を同じ外植片を行うことができることを意味する（ELISAアッセイ、定量rtPCRs、マイクロアレイ解析、免疫組織化学および/または免疫蛍光データ）。また、分析の他のタイプの細胞蛍光析によって、このような刺激植片から目的の細胞集団の精製およびそれらの表現型の評価として、将来的に最適化することができるSIS。
しかしながら、考慮されるべき重要な制約もある。それは、組織の可用性に依存するように、本形態では、このモデルは、治療の多数のハイスループットスクリーニングには適していない。我々は説明したモデルをより効率的に診療所に入る前に、候補治療の端試験として使用されるのに対し、それらが10で刺激を多数処理し、実行しやすいように細胞培養モデルは、おそらく、その目的に適している。また、我々は、組織の生存能力を維持することに成功したれる時間枠は、このようなRNA干渉であれば、監視期間を必要とする実験のために許可されていない。最後に、細菌の刺激は、通常のインキュベーター中で行われ、嫌気性細菌の効果を維持するか、またはテストを可能にしない。これは、将来的にはこれらの問題に取り組むための我々の意図である。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
利害の衝突は宣言されていない。
Acknowledgments
我々は酸素室を提供するための優れた技術サポートと博士はアントニオ·ディ·サバティーノのためエリカMiletiに感謝します。
資金調達 ：MRへとFondazione Cariploとマリーキュリー国際トレーニングモビリティネットワーク（クロストーク、グラント契約番号：21553から2）による支援へ：この作品は、第7回EUフレームワークプログラム（Dendroworld IBDase、ERC）からの補助金によって支えられてKT。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 10X HBSS | Eurocalne | ECM4006XL | |
| Peni/Strepto | Lonza | DE17602E | |
| Gentamycin | Gibco | 15750-037 | |
| DMEM | Lonza | BE12614 | |
| FBS-Na | Gibco | 16000-044 | |
| 100X ITS-X | Gibco | 51500-056 | |
| EGF | Tebu-bio | 100-15 | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17605E | |
| Non essential aminoacids 100X | Gibco | 11140-035 | |
| NaPyr | Gibco | 11360-039 | |
| Materials | |||
| Cloning cylinders 6x8 mm | BellCo | 2090-00608 | |
| Cloning cylinders 8x8 mm | BellCo | 2090-0080 | |
| Cloning cylinders 10x10 mm | BellCo | 2090-01010 | |
| Metal grids | Home made | ||
| Centre well organ culture plate | BD Falcon | 353037 | |
| Surgical glue (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Oxygen Jars | Home made | ||
| Oxygen tanks | Air Liquid Sanità | ||
References
- Schuller, S., Lucas, M., Kaper, J. B., Giron, J. A., Phillips, A. D. The ex vivo response of human intestinal mucosa to enteropathogenic Escherichia coli infection. Cell. Microbiol. 11, 521-530 (2009).
- Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. , (2012).
- Tsilingiri, K., Rescigno, M. Should probiotics be tested on ex vivo organ culture models? Gut Microbes. , Manuscript in preparation (2012).
- Mileti, E., Matteoli, G., Iliev, I. D., Rescigno, M. Comparison of the immunomodulatory properties of three probiotic strains of Lactobacilli using complex culture systems: prediction for in vivo efficacy. PLoS One. 4, e7056 (2009).
- Cencic, A., Langerholc, T. Functional cell models of the gut and their applications in food microbiology--a review. Int. J. Food Microbiol. 141, Suppl 1. S4-S14 (2010).
- te Velde, A. A., Verstege, M. A., Hommes, D. W. Critical appraisal of the current practice in murine TNBS-induced colitis. Inflamm. Bowel Dis. 12, 995-999 (2006).
- Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture. J. Anat. 134, 459-469 (1982).
- Browning, T. H., Trier, J. S. Organ culture of mucosal biopsies of human small intestine. J. Clin. Invest. 48, 1423-1432 (1969).
- Besselink, M. G., et al. Probiotic prophylaxis in predicted severe acute pancreatitis: a randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 371, 651-659 (2008).
- Lakhdari, O., et al. Identification of NF-kappaB modulation capabilities within human intestinal commensal bacteria. J. Biomed. Biotechnol. 2011, 282356 (2011).
