Summary
Ödet för en enskild embryonal cell kan påverkas av nedärvda molekyler och / eller av signaler från angränsande celler. Använda öde kartor över klyvning scenen Xenopus embryo kan enstaka blastomerer identifieras för kultur i isolering för att bedöma bidragen från ärvda molekyler jämfört cell-cell interaktioner.
Abstract
Fate kartor, uppbyggda av härstamning spåra alla celler i ett embryo, avslöja vilka vävnader ner från varje cell i embryot. Även öde kartor är mycket användbara för att identifiera föregångarna till ett organ och för att belysa den utvecklingsmässiga vägen genom vilken underordnade celler befolkar den organ i normalt embryo, inte visar de inte den fulla utvecklingspotentialen i en prekursorcell eller identifiera de mekanismer genom vilka dess öde avgörs. För att testa för cell öde engagemang, jämför en en cell normala repertoar av ättlingar i det intakta embryot (öde kartan) med dem som uttrycks efter en experimentell manipulation. Är cellens öde fast (engagerad) oavsett omgivande cellulära miljön eller är det påverkas av yttre faktorer som tillhandahålls av sina grannar? Använda omfattande öde kartor över Xenopus embryot, beskriver vi hur man identifierar, isolera och kultur enstaka klyvning prekursorer steg, som kallas Blastotjärnar. Detta tillvägagångssätt gör att man kan bedöma om dessa tidiga celler är engagerade i öde de får i sin normala miljö i intakta embryot kräver interaktion med sina angränsande celler eller kan påverkas för att uttrycka alternativa öden om de utsätts för andra typer av signaler.
Introduction
Xenopus laevis embryon har använts i stor utsträckning för att identifiera de mekanismer som embryonala celler får sin specifika öden eftersom deras ägg är stora nog för att tillåta mikrokirurgiska metoder. Dessutom utvecklar de externt utan behov av näringstillskott av odlingsmediet, eftersom varje cell innehåller en rik intracellulär tillförsel av äggula blodplättar som ger en inneboende energi butik. En viktig tillgång för att studera de mekanismer som celler öde bestäms är omfattande öde kartor över blastomererna klyvning scenen (från 2 - genom 32-cell steg) 1, 2, 3, 4, 5, 6. Dessa kartor konstruerades genom microinjecting en detekterbar molekyl till en enda, identifierbar blastomer och övervakning senare utveckling där vävnader befolkas av den märkta avkomma. Konsekvent öde kartor är möjligt eftersom de huvudsakliga axlar embryon tillförlitligt kan identifieras i många Embryos. Först, i alla vildtyp embryon djuret halvklotet är pigmenterad, medan vegetabiliskt halvklotet är det inte. Det andra, orsakar inträde av spermier vid befruktningen en sammandragning av djurets halvklotet pigmentering mot framtiden ventrala sidan, i många embryon en pigmentering skillnad kan därför användas för att särskilja mellan dorsala och ventrala sidor. Tredje approximerar den första klyvningen fåra mitten sagittalplan i de flesta embryon, och kan således användas för att identifiera de högra och vänstra sidorna av embryot. Öde kartorna har även åberopat det faktum att naturligt befruktade ägg ofta klyver i regelbundna mönster som gör varje blastomer identifierbar över en stor population av embryon. Även om det finns variationer inom och mellan kopplingar av ägg om pigmentering och klyvning mönster, med urvalsförfaranden som beskrivs häri tillåter celler med föreskrivna öden kan identifieras med ca 90% noggrannhet.
Cell öden kan avskräckabryts under embryogenes genom flera mekanismer. Inneboende faktorer som differentiellt nedärvda cytoplasmiska mRNA eller proteiner, bidrar till flera aspekter av tidig mönstring. Till exempel specifika maternella mRNA bestämmer vilka celler kommer att bidra till könsceller, bli endoderm, eller bidra till rygg kroppen axeln (granskas 7). Yttre faktorer som lokalt av angränsande celler eller mer avlägset från en embryonal signalering centrum, är ansvariga för inducering av specifika vävnadstyper och mönstring nästan alla organsystem. Exempel på signalering centra inkluderar arrangören / nod i gastrula som inducerar neural ektoderm och mönster mesoderm, och zonen för polariserande aktivitet som mönster främre-bakre axeln hos extremiteten knopp. Även öde kartor identifiera prekursorer till de olika organen och avslöja den utvecklingsmässiga väg som deras avkomlingar i normalt embryo, kan de inte skilja mellan inneboendeoch yttre påverkan på dessa celler. De också avslöjar inte hela utvecklingspotentialen i en cell, vars ättlingar differentiera den komplexa signalering miljön av embryot. Två experimentella metoder kan testa om en cells öde bestäms av inneboende faktorer eller därefter påverkas av yttre faktorer: 1) transplantation av cellen till en ny plats i embryot, eller 2) avlägsnande av cellen från embryot följt av kultur i frånvaro av exogena signaler.
Både experimentella tillvägagångssätt har varit möjlig i Xenopus eftersom cellerna är stora nog att manuellt separeras. Exempelvis har flera studier bort enstaka celler från embryon (att förändra cell-cell interaktioner) eller transplanterade celler till nya platser i värd embryon att testa för öde förändringar (granskats i 7, 8, 9). Dessutom, det andra tillvägagångssättet för explantation små antal celler från olika regioner av embryot Into kultur att belysa induktiva vävnad interaktioner i frånvaro av exogena faktorer är möjlig eftersom cellerna i Xenopus embryon är fyllda med en intracellulär näringsämne lager, äggula blodplättar. Därför, kan de odlas under ett par dagar i ett definierat salt-medium utan näringsmässig eller tillväxtfaktor komplettering av odlingsmediet. Vi har använt denna metod för att visa att dorsala djur blastomerer har en autonom förmåga att producera neurala och dorsala mesodermala vävnader på grund av maternellt ärvd mRNA 10, 11, och andra visade att mesoderm specificering av 32-cell blastomerer bygger på både inre och yttre information 12 . En fördel med att odla celler som explantat är att mediet också kan kompletteras med definierade signalering faktorer för att avgöra vilken cell till cell kommunikation väg kan påverka ödet för den explanterade cellen 12, 13, 14. Dessutom kan man injicera blastomer prior till kultur med mRNA att överuttrycka en gen, eller med anti-sense-oligonukleotider för att förhindra translation av endogena mRNA. Dessa, vinst-och förlust-av-funktion analyser kan identifiera vilka molekyler krävs för en självständigt uttryckt öde. För att analysera öde explantatet kan identifiera specifika celltyper utföras av vanlig genuttryck (t.ex. in situ hybridisering, RT-PCR) och immunocytokemiska analyser. Detta protokoll ger en enkel, men ändå kraftfull, sätt att skilja mellan inre och yttre mekanismer som reglerar hur en embryonal cell utvecklas till specifika vävnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av Instrument, kultur Media och rätter
- Slipa fyra tång med aluminiumoxidslipmedel film. Gör detta under ett dissektionsmikroskop för att övervaka spetsen storlek. En pincett fungerar som en back-up ifall en spets skadas under förfarandet. Autoklavera alla fyra tång och lagra i en steril behållare.
- Gör 500 ml vardera av 0,1 X och 1,0 X odlingsmedium (antingen Marcs modifierade Ringers [MMR] eller Modifierat Barths Saline [MBS], recept i 15) och filter sterilisera. Vi använder rutinmässigt MBS (1X = 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM CaCla 2, 1 mM MgSO 4, 5 mM HEPES [pH 7,8], 2,5 mM NaHCOa 3). Förvaras vid 14-18 ° C för månader.
- Gör en 2% agaroslösning i odlingsmedium (2 g elektrofores grad agaros i 100 ml 1X odlingsmedium i ett skruvlock glasflaska). Autoklav att upplösa agaros. Detta kan förvaras vid 4 ° C i månader, och microwaved att smälta agarosen när den nästa behövs.
- Medan agaros är flytande, häll ca 0,5 ml på botten av varje brunn i en steril 24-brunnars odlingsplatta. Detta kommer att förhindra explantaten från fastnar på plasten.
- Medan agarosen är flytande, häll ca 2-3 ml på botten av 02:58 60 mm petriskålar, och snurra försiktigt för att se till att botten är täckt. Dessa kommer att fungera som dissekering rätter och agarosen förhindrar embryon fastnar i plasten när deras membran tas bort.
- När agarosen har svalnat och hårdnat, låga spetsen på en 6 "pastörpipett tills det smälter till en boll, och lätt röra den på ytan av agarosen i varje brunn i odlingsplattan. Detta skapar en grund fördjupning i vilken explantatet placeras.
- Fyll varje brunn i odlingsplattan med 1X sterilt odlingsmedium.
- När agarosen har svalnat och hårdnat, fyll dissektion skålen med utspädd odlingsmedium (0,1 X MMR eller 0,1 x MBS) för att underlätta blastomer separation.
2. Val av embryon
- Skaffa befruktade ägg och ta bort gelé rockar enligt standardprotokoll 15. Överföra dem till 0,5 X odlingsmedium i en 100 mm petriskål.
- När embryona når 2-cellstadiet, sortera dem i vilka den första klyvningen fåra bisects lätt pigmenterade området i djuret halvklotet (figur 1) till en separat skål. Dessa kommer att vara givarna för explantaten. Håll de återstående 2-cellembryon i en separat skål bredvid givare embryon hela proceduren för att tjäna som syskon kontroller för att arrangera explantaten.
3. Framställning av Explantat
- Placera 5-10 embryon i en dissektion maträtt, men fungerar bara på ett embryo i taget.
- Placera den första embryot så transparenta vitellinmembranet kan ses, det separeras genom ett fritt utrymme (perivitelline utrymme) ovanför ytan av djuret polen av embryot. Använda en vass kraftps i sitt subdominant handen (vänster om en rätt lämnas), ta tag i vitellinmembranet ovanför perivitelline utrymmet. Använda en vass tång i den andra handen, ta tag i membranet nära den första pincett spetsen, och dra försiktigt i motsatt riktning för att skala membranet bort. Göra den initiala grepp på ett avstånd från cellen som skall dissekeras, så att målcellen inte skadas under avlägsnandet av membranet. Man kan säga att membranet har tagits bort eftersom embryot planar.
- Grab en angränsande cell med tången i subdominant handen och använda denna cell som en "handtag", så att cellen kan dissekeras inte direkt berörs. Med tången i den andra handen, försiktigt dra de återstående angränsande celler från önskad blastomer. Om mittlinjen celler, som delar samma öde, är riktade kan de tas bort tillsammans som ett par. Slutligen, dissekera bort "handtag"-cellen.
- Ta upp blastomer (eller blastomer par), med en steril, Glas Pasteurpipett, undvika luftbubblor och överdriven sug. Pipetten kan brand-polerad för att avlägsna skarpa kanter som kan skada cellen, men vi vill inte rutinmässigt gör detta. Placera spetsen på pasteurpipett under ytan av odlingsmediet i en brunn av explantat odlingsskålen, och försiktigt utvisa blastomer. Det bör glida in i grunda fördjupningen av tyngdkraften. Samma blastomer från mer än ett embryo kan kombineras till en enda explantat.
- Upprepa denna procedur med de återstående embryona i dissektion maträtt, en efter en. Efter ca 10 embryon kommer dissektion skålen fyllas med cellrester. När detta inträffar, byt till en ny dissektion maträtt.
- När alla dissektioner är klar, kontrollera om explantaten är i grunda fördjupningar. Om inte, kan de försiktigt tryckas in i fördjupningen med en hår slinga som har steriliserats i 70% etanol och lufttorkades.
- Ungefär en timme efter den sista dissektion, ta bort skräp surrounding de läkta explantaten med en steril, glas pasteurpipett.
- Kultur plattan explantat vid 14-20 ° C bredvid petriskål som innehåller syskon, kontroll embryon. Syskon embryon kommer att indikera hur långt utvecklingen av blastomer explantaten.
4. Skörd Explantat för analys
- Skörda explantaten när syskonen når den önskade utvecklingsstadiet. Dessa explantat överlever ganska bra även om några av cellerna sönderdelas. Därför, om det finns en grumlig massa i odlingsbrunn, utforska den med en hår slinga eller pincett för att bestämma om en frisk explantat är begravd inuti.
- Plocka upp explantat i en liten volym av kultur lösning med en glas Pasteurpipett, och försiktigt utvisa dem i en fixativ eller lysisbuffert lämplig för analysen som skall utföras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Förmågan hos denna analys att exakt bedöma den utvecklingspotential av cellen är beroende dissekera ut rätt blastomer baserad på öde kartorna 1, 2, 3, 4, 5, 6. Därför är det viktigt att välja embryon med rätt pigmentering mönstret vid 2-cellstadiet, såsom illustreras i figur 1, som därefter följer vanliga klyvningsmönster, såsom visas i figur 2. Om en iakttar de sorterade embryon når önskad klyvning scenen och skiljer ut de embryon som visar oregelbundna klyvningar med noggrannhet förbättras avsevärt. Såsom illustreras i figur 2, regelbundna klyftor uppstår ofta endast på ena sidan av embryot. Dessa embryon kan användas som givare om donatorcellen härstammar från den "vanliga" sidan. Eftersom vanliga klyvningsmönster finns i färre embryon som fortsätter celldelning, sortera ungefär fem gånger så många embryon som du tänker dissekera. Naturligtvis fertilized ägg tenderar att ha mer regelbundna klyftor än in vitro befruktade ägg. Även klyvningsmönster varierar mycket inom en och samma koppling av ägg, kan man förvänta sig minst 10-20% för att vara användbar för denna typ av manipulation.
Blastomerer kan odlas ensam eller i små grupper. När blastomerer först dissekeras (figur 3A), och överfördes till odlingsbrunn (Figur 3B, C) är de mjuka och sköra. I vår erfarenhet, djur och ekvatoriella blastomerer är mycket lättare att dissekera och kultur än vegetabiliska blastomerer (Figur 3C). Kanske för att de är mindre, de är lättare att överföra. De verkar också läka snabbare när nicked med pincett. Vegetabiliska celler verkar ofta för att slutföra cytokines långsammare och därmed behålla cytoplasmiska broar med syster celler, vilket gör dem mer "läckande" när dissekeras, och deras cellmembran är mer bräcklig och lättare att skada.Efter ca 1-2 timmar i kultur, kommer den explanterade blastomer (er) har delat ungefär 4 gånger och sloughed bort det mesta av skräpet kvar från skadade angränsande celler (Figur 3D). Efter 20 timmar, bildar de små robusta bollar av celler (Figur 3E). Medan vissa kan vara begravda i skräp, ofta en frisk massa kan hittas (fig 3E, vänster).
Även explantaten är små, överlever de bearbetning för in situ hybridisering, liksom de mer vanligt använda djur explantat cap, vilket gör att man kan övervaka senare genuttryck. I experimentet som visas i figur 4A, har två dorsala blastomerer (D1.1) eller två ventrala blastomerer (V1.1) dissekerades vid 16-cellstadiet och odlades i 1X MBS vid 14 ° C tills syskon embryon nådde tidigt neurala plattan steg (ST12-13, cirka 20-22 timmar efter dissekera). Varje prov analyserades med avseende på expression av en zygotiska neurala plattan genen (Sox2 </ Em>) genom in situ hybridisering (den blå reaktionsprodukt). Denna analys visar att majoriteten av dorsala djur blastomerer, vilka är prekursorer av neurala plattan, kan uttrycka Sox2 självständigt, dvs utan ytterligare signalering från andra regioner i embryot. De explantat som inte uttrycker Sox2 kan ha blivit felaktigt identifierade vid dissekering. I motsats, ingen av de ventrala djur blastomerer, vilka är prekursorer av den ventrala epidermis, uttrycka Sox2. Således drar vi slutsatsen att dorsala djur blastomer har en inneboende förmåga att bilda nervvävnad, medan de ventrala djur blastomerer inte. Notera att en del av de D1.1 explantat har också eIongated, en morfologi indikerar dorsalt mesoderm-bildning, dessa blastomererna också är förutbestämt att bilda notokorden i intakt embryot 3, och i explantat kultur uttrycker en notokord markörprotein 10. Blastomer inneboende öden kan Ältere d genom tidigare mikroinjektion av mRNA (vinst-of-funktion) eller anti-sense morfolino oligonukleotider (MOS, förlust av funktion). I figur 4B är effekten av att ändra de endogena nivåerna av en modern uttryckt neural gen, foxD5 16, 17, testade. När den endogena nivån av FoxD5 ökades genom att injicera foxD5 mRNA i de 8-cells prekursorer blastomerer i V1.1 (nedre raden) uttryckte majoriteten av V1.1 explantaten (odlade till st 12-13) Sox2. Omvänt, när den endogena nivån av FoxD5 reducerades genom injektion av MOS till de 8-cell prekursor blastomerer av D 1.1 (översta raden), uttrycks endast några D1.1 explantat (odlades till st 12-13) Sox2 (jämför översta raden i Figur 4A). Dessa experiment indikerar att den moderliga expressionen av foxD5 spelar en roll i den inneboende förmågan hos dorsala blastomerer att förvärva en neural öde.
ftp_upload/4458/4458fig1.jpg "alt =" Bild 1 "/>
Figur 1. Pigmentering mönster i 2-cellembryon från naturligt befruktade ägg. Den första klyvningen fåra indikeras med en pil. A) Ett exempel på ett embryo som inte bör användas för att identifiera blastomerer i senare skeden eftersom den lätt pigmenterade regionen av djurets halvsfären av embryot finns mestadels i en cell (till vänster). Sedan den första klyvningen fåra förutsäger mitten sagittalplan av embryot, kommer det lätt pigmenterade regionen av detta embryo inte identifiera dorsala. B) Två exempel på embryon som ska sorteras för explantation kulturer. I båda, är det lätt pigmenterade regionen av djurets halvklotet (*) genomskärs av den första klyvning fåra. Embryot till vänster är tidigt i den första cellcykeln, och den lätt pigmenterade regionen är endast synlig i cirka 25% av cellens yta. Embryot till höger närmar sig slutet av den första cellcykeln, och pigmentet har flyttat ventrally så de dorsala halvorna av de två cellerna är lättare. Som ett resultat, i senare skeden de lätt pigmenterade djurceller kommer att förutsäga dorsala (d) och mörkt pigmenterade djurceller kommer att förutsäga ventrala (v).
Figur 2. Exempel på embryon klyvning scenen från naturligt befruktade ägg. Alla embryon är orienterade med djuret polen är vänd mot läsaren, dorsala till toppen. A) 4-cellembryon. Embryot till vänster har just gått in i den andra cellen cykeln så klyvningen fåror är grunda. Embryot till höger har nästan slutfört den andra cellcykeln så klyvning fåror är djupare och cellerna verkar mer rundade. Svarta pilar pekar på den första klyvningen fåra och röda pilarna pekar på den andra klyvningen fåra. B) 8-cellembryon. Embryot till vänster tidigt är den tredje cellcykeln och embryot till höger är närautgången av den tredje cellcykeln. C) 16-cellembryon. C är ett exempel på oregelbundna klyftor undvikas. C "är ett exempel på regelbundna klyvningar på den ventrala sidan, men oregelbundna på ryggsidan. K'' 'är ett exempel på mer regelbundna klyvningar på den dorsala sidan, men inte på buksidan. K'''' är ett exempel regelbundna klyvningar vid mittlinjen, men inte i sidled. D) 32-cellembryon. D 'är ett exempel på regelbundna klyvningar på den ventrala sidan, men oregelbundna på ryggsidan. D'' är ett exempel av regelbundna klyvningar på den dorsala sida, men inte på buksidan. D'' 'är ett exempel på regelbundna skiljelinjer på höger sida, men mer oregelbundna klyftor på vänster sida. E) 64-cells embryo. För en schematisk bild av dessa steg, se den Nieuwkoop och Faber iscensättning serien, som finns on-line ( http://www.xenbase.org/anatomy/alldev.do ).
Figur 3. Explantat från 16-cellembryon från naturligt befruktade ägg. A) En ventrala djur blastomer strax efter dissekering. Pil betecknar resterna av "handtag" cellen. B) En ventrala djur blastomer överförs till en kultur väl som delat en gång. C) En ventrala vegetabiliskt blastomer strax efter dissekering. Jämfört med djur blastomerer, dessa är större och svårare att manipulera. D) Två ventrala djur blastomer explantaten, 2 tim efter dissekering, har delat ungefär fyra gånger. Den vänstra explantat betraktas från originalet, pigmenterade ytteryta blastomer, den högra explantatet betraktas från originalet, opigmenterade inneryta blastomer. E) Två ventrala djur blastomer explantat odlades under 24 timmar. Den vänstra explantatet sitter i en bädd av cellulära skräp (pilar) medan den högra explantatet är fri från detritus. Alla bilder är på 50X Magnificatjon.
Figur 4. In situ-hybridisering analys av genuttryck i explantat härledda från 16-cell blastomerer dissekerade från naturligt befruktade ägg. A. 16-celler embryot vid vänster illustrerar den dorsala blastomeren paret (D1.1) som explanterades för resultaten i den översta raden och den ventrala blastomeren paret (V1.1) som explanterades för resultaten i den nedre raden. Dissekerade blastomer par från oinjicerade embryon placerades i 0,1 x MBS i odlingsbrunnar och inkuberades vid 14 ° C under ca 20 timmar. De samlades i tuber med fixativ och bearbetas av in situ hybridisering för expression av en zygotiska neural gen, Sox2. B. blastomerer av 8-cell stadium embryon injiceras bilateralt antingenmed foxD5 Mos, för att minska endogen uttryck i rygg blastomerer eller med foxD5 mRNA för att öka endogen uttryck i ventrala blastomerer. När de injicerade embryona nådde 16-cellstadiet (20-30 min senare), har blastomer par dissekerades, odlades och analyserades genom hybridisering in situ som i A. Antalet explantat som uttrycker Sox2 avsevärt reduceras i D1.1 explantat som injicerades med foxD5 MOS (jämför med översta raden i A). Antalet explantat som uttrycker Sox2 signifikant ökat i V1.1 explantat som injicerades med foxD5 mRNA (jämför med nedersta raden i A). Klicka här för att se större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mest kritiska stegen för lyckad odling av enskilda blastomerer är: 1) korrekt identifiera blastomer av intresse, 2) att upprätthålla en steril, hälsosam kultur, 3) dissekera celler vid rätt del av cellcykeln, och 4) att utveckla den nödvändiga manuella fingerfärdighet för att undvika skador vid dissekering och överföra till kulturen väl.
Att manipulera specifika blastomerer, är det viktigt att kunna identifiera de huvudsakliga axlarna. I Xenopus embryon, kan den dorsala sidan identifieras genom tre metoder: (1) märkning av spermier ingångspunkten med ett vitalt färgämne 18, 19, (2) deponering provrörsbefruktade ägg och märkning en sida 18, 19, eller (3) välja embryon under 2-cellstadiet i vilket den första klyvningen fåra bisects lätt pigmenterade regionen hos djuret halvklotet 20, 21. Vi använder den tredje metoden, som exakt identifierar blastomerer från naturligt konstgödseled 16-cellembryon i ca 90% av fallen 20, 21. Vid befruktning, börjar djuret halvklotet pigmentering till uppdraget mot sperma ingångspunkt på den ventrala sidan, orsakar den dorsala regionen djuret att bli mindre pigmenterade i en majoritet av embryon (figur 1). Det finns en betydande variation i omfattningen av denna lätt pigmenterade området mellan kopplingar och även inom klor Xenopus ägg. Om den första klyvningen fåra skär detta ljusare område lika mellan de två dottercellerna, då ljusare område kan användas som indikator på den dorsala sidan, och den första klyvningen fåra indikerar mitten sagittalplanet. Om den första klyvningen fåra separerar döttrarna till en mörk cell och en ljus cell du inte använda det för explantatet eftersom pigmentering i senare skeden inte exakt identifiera ryggsidan. Tidigare studier har visat att den här typen av embryon den första klyvningen fåra förblev en markör för tHan mitten sagittalplan medan lätt pigmenterade området inte längre angav ryggsidan 20, 21. Embryon kan också väljas på den tidiga delen av 4-cells klyvning (vänster embryo i figur 2B), när den första och den andra fåror i den vegetativa polen kan fortfarande särskiljas, den första fåran ska vara komplett och det andra fåran inte ännu inte avslutad. Om emellertid, väntar en till slutet av den 4-cellstadiet för att välja embryon (höger embryo i figur 2B), fåror den första och andra klyvning kan inte längre urskiljas, och de lätt pigmenterade cellerna kan vara dorsala sådana i endast ca 70% av embryon 20, 21. Detta kommer att göra riktade mot särskilda blastomerer mycket mindre exakt. Det bör noteras att andelen embryon i vilka den första klyvningen fåra bisects lätt pigmenterad regionen varierar mycket mellan kopplingar. I vår erfarenhet kan de stå för <50% av äggen i en koppling till> 80% Av äggen i en koppling. Oavsett, det nästan alltid är tillräckligt med ägg i en koppling av friska ägg som uppfyller detta kriterium för att stödja ett explantat experiment.
De två rekommenderade odlingsmedier (MMR, MBS) är praktiskt taget utbytbara, preferenser olika laboratorier är mestadels historiska. MMR kan lagras som en 10X lösning för ett år eller mer. MBS har en kortare hållbarhetstid eftersom den är buffrad med bikarbonat. Eftersom embryon och explantat kan duka under för bakteriell infektion utan skyddande gelé och vitelline membran bör pincett och media kultur vara sterila. Om explantat inte överlever väl, kan antibiotikum sättas till odlingsmediet (t.ex. 0,1% gentamicin). Lösningar innehållande gentamicin har en kort lagringstid, och därför bör göras färskt på dagen de skall användas. Cellrester innehåller proteaser som skadar oskyddade explantaten och främjar bakterietillväxt. Därför bör det vara removed från odlingsbrunnarna efter explantaten har haft en chans att läka.
Blastomer dissektioner utförs i utspädd odlingsmedium (0,1 x MBS eller 0,1 X MMR) för att minska styrkan av cell-till-cell-adhesioner. Under Xenopus klyvning stadier, är celladhesion oftast uppnås genom calcium-/magnesium-dependent cadheriner. Därför är det inte nödvändigt att använda enzymatisk dissociation, i själva verket detta bör undvikas eftersom det tar bort ytproteiner som kan vara viktiga i händelser öde bestämning. Eftersom embryonala celler från olika satser av ägg följa med olika styrkor, kan utspädningen av dissekering mediet behöva justeras på ad hoc-basis. Om cellerna är alltför vidhäftande att dissekera utan att riva dem, sänker koncentrationen av dissekering mediet stegvis från 0,1 X. Omvänt, om cellerna faller isär när vitellinmembranet avlägsnas och är mycket läckande, öka koncentrationen av dissectioN-medium stegvis. Men använd inte calcium-/magnesium-free medier eftersom cellerna blir för skör för att överföra till odlingsbrunnarna. Framgångsrik separation av blastomerer beror också på när under cellcykeln en utför dissektion. Såsom visas i figur 2, tidigt i cellcykeln klyvning fåror är grunda och blastomererna är tillplattade. Senare i cykeln klyvning fåror är djupare och cellerna är mer rundade. Tidigt i cellcykeln finns cytoplasmiska broar som kommer att orsaka cytoplasmisk läckage om bruten. Därför celler lättare dissekerades sent i cellcykeln. 4-cells embryon, 8-cells embryon och vegetabiliska celler i alla led är svårare att dissekera eftersom cytoplasmiska broarna kvarstå längre. Man kan förutse en hög dödlighet för dessa explantat, vilket innebär ett behov att utföra fler dissektioner att återställa en rimlig urval. Man kan vänta tills början av nästa klyvning fåra att börja disseInsatser av dessa celler för att säkerställa att de cytoplasmiska broar har stängt. Medan enstaka blastomerer tas från 8 - och 16-cellembryon överlever väl i kultur, i vår erfarenhet äldre blastomerer klarar mindre och enskilda celler. Även om vi inte vet orsaken till detta kan överlevnad av äldre blastomer explantat förbättras genom att dissekera flera (2-6) i samma blastomer från olika embryon och odling ihop dem till en enda kultur väl 10, 13, 14.
Denna procedur kräver övning och några fingerfärdighet. Eftersom tiden mellan klyvningar är temperaturberoende, är det lämpligt att lagra embryon vid 14-16 ° C för att bromsa klyvning och ge mer tid för att utföra dissektioner. Kommer dock embryon tolererar inte temperaturer lägre än 14 ° C. Den första utmaningen i detta förfarande att ta bort vitellinmembranet. Det är bäst att inte gå vidare till blastomer dissekering tills detta första steg behärskas. När dissekeraut blastomer är "handtag" cell risk för läckage och falla sönder. Detta är inte ett problem eftersom när alla de andra cellerna skalas bort från den önskade cellen, kan den "handtag"-cell tas bort med pincett. Handtaget cell rester liksom annat skräp faller vanligtvis bort när blastomer överförs till odlingsbrunn (figur 3B). Blastomerer håller glupskt till plast, så använd bara glaspipetter att överföra dem. Använd minsta sugande tryck på cellen, eftersom det kan upplösas från de skjuvkrafter i pipetten. Också undvika luftbubblor i pipetten och kontrollera att pipettspetsen är under ytan av odlingsmediet när explantatet utdrives eftersom cellerna kommer explodera om de rör en luft-vatten gränsytan.
Protokollet som beskrivs här använder obehandlade embryon som givare för explantaten och enkla medier salt för odling. Dessa tillåter en att testa inneboende förmågan hos explantatet till exprESS särskilda öden. Denna metod kan expanderas experimentellt på två sätt. Först, kan odlingsmediet kompletteras med signalering / tillväxtfaktorer för att testa huruvida dessa molekyler kan orsaka explantatet att uttrycka alternativa öden. Det andra, kan genuttrycket av donator embryona ändras genom injicering antingen mRNA (förstärkning-av-funktion) eller anti-sense-oligonukleotider morfolino (förlust-av-funktion) till specifika prekursorer före blastomeren dissektion. Detta kan göras på 1-cellstadiet, eller på ett mer målinriktat sätt vid 1-2 celldelningar före dissektion. Med dessa metoder kan man testa om en viss exogent tillhandahålls gen orsakar en blastomer att förvärva en alternativ öde, eller huruvida en särskild endogen gen är nödvändig för blastomer att uttrycka sin autonoma öde (t.ex. fig. 4B). Dessa är kraftfulla experimentella metoder, eftersom de eliminerar confounding inflytandet av de andra cellerna och signalering centers finns i den intakta embryot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna GWU Harlan Fellowship för att stödja Paaqua Grant och GWU Luther Rice Fellowship för att stödja Mona Herold. Detta arbete stöddes av National Science Foundation MCB-1.121.711.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-38 | Course (12 μm), for major repairs of forceps tips |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-46 | Medium (3 μm), for fine sharpening of forceps tips |
| Alumina abrasive film | Thomas Scientific | #6775E-54 | Fine (0.3 μm), for polishing of forceps tips |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | #11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. Corrosive resistant so they can be autoclaved. |
| Gentamicin solution | Sigma | G1397 | Add to medium on same day as use |
References
- Dale, L., Slack, J. M. Fate map of the 32-cell stage of Xenopus laevis. Development. 100, 279-295 (1987).
- Masho, R., Kubota, H. Y. Developmental fates of blastomeres of the eight-cell stage Xenopus embryo. Dev. Growth, Diff. 30, 347-359 (1988).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 119, 560-578 (1987).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 122, 300-319 (1987).
- Moody, S. A., Kline, M. J. Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres. Anat. Embryol. 182, 347-362 (1990).
- Takasaki, H. Fates and roles of the presumptive organizer region in the 32-cell embryos in normal development of Xenopus laevis. Dev. Growth, Diff. 29, 141-152 (1987).
- Sullivan, S. A., Moore, K. B., Moody, S. A. Chapter 20 Early events in frog blastomere fate determination. Cell Fate and Lineage Determination. Moody, S. A. , Academic Press. 297-321 (1999).
- Moore, K. B., Moody, S. A. Animal-vegetal asymmetries influence the earliest steps in retinal fate commitment in Xenopus. Dev. Biol. 212, 25-41 (1999).
- Yan, B., Moody, S. A. The competence of Xenopus blastomeres to produce neural and retinal progeny is repressed by two endo-mesoderm promoting pathways. Dev. Biol. 305, 103-119 (2007).
- Gallagher, B. C., Hainski, A. M., Moody, S. A. Autonomous differentiation of dorsal axial structures from an animal cap cleavage stage blastomere in Xenopus. Development. 112, 1103-1114 (1991).
- Hainski, A. M., Moody, S. A. Xenopus maternal mRNAs from a dorsal animal blastomere induce a secondary axis in host embryos. Development. 116, 347-3345 (1992).
- Godsave, S. F., Slack, J. M. Single cell analysis of mesoderm formation in the Xenopus embryo. Development. 111, 523-530 (1991).
- Hainski, A. M., Moody, S. A. An activin-like signal activates a dorsal-specifying RNA between the 8- and 16-cell stages of Xenopus. Dev. Genetics. 19, 210-221 (1996).
- Pandur, P. D., Moody, S. A. Multiple maternal influences on dorsal-ventral fate of Xenopus animal blastomeres. Dev. Dyn. 225, 581-587 (2002).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
- Sullivan, S. A., Akers, L., Moody, S. A. foxD5a, a Xenopus winged helix gene, maintains an immature neural ectoderm via transcriptional repression that is dependent upon the C-terminal domain. Dev. Biol. 232, 439-457 (2001).
- Yan, B., Neilson, K. M., Moody, S. A. FoxD5 plays a critical upstream role in regulating neural fate and onset of differentiation. Dev. Biol. 329, 80-95 (2009).
- Vincent, J. -P., Gerhart, J. C. Subcortical rotation in Xenopus eggs: an early step in embryonic axis specification. Dev. Biol. 123, 526-539 (1987).
- Peng, H. B. Appendix A: Solutions and Protocols. Methods in Cell Biology. 36, 657-662 (1991).
- Klein, S. L. The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos. Dev. Biol. 120, 299-304 (1987).
- Masho, R. Close correlation between the first cleavage plane and the body axis in early Xenopus embryos. Dev. Growth Diff. 32, 57-64 (1990).
