Summary
Um método para avaliar quantitativamente a resposta quimiotáctica de<em> Caenorhabditis elegans</em> É descrito. Um índice quimiotáctico (Cl) foi utilizada como uma forma de avaliar precisamente a resposta de minhocas, para determinados objectivos, e servir como uma plataforma de comparação entre estirpes e os compostos de interesse.
Abstract
Muitos organismos usam a quimiotaxia para buscar fontes de alimentos, evitar substâncias nocivas, e encontrar companheiros. Caenorhabditis elegans tem comportamento quimiotaxia impressionante.
A premissa subjacente testar a resposta dos vermes a um odorante é colocá-los em uma área e observar o movimento evocada em resposta a um odorante. Mesmo com os diversos ensaios disponíveis, optimizando verme localização inicial em relação a ambas as áreas de teste e de controlo, enquanto minimiza a interacção de vermes com o outro, mantendo ao mesmo tempo uma amostra significativa, continua a ser um trabalho em progresso 1-10. O método descrito aqui pretende abordar estas questões através da modificação do ensaio desenvolvido por Bargmann et al. 1. A placa de Petri é dividido em quatro quadrantes, dois quadrantes opostos marcados "teste" e dois são designados como "Controle". Anestésico é colocado em todos os testes e os locais de controlo. Os vermes são colocados no centro da placa com uma circle marcados em torno da origem para assegurar que os vermes não-móveis serão ignorados. Utilizando um sistema de quatro quadrantes, em vez de um ou 2 dois elimina uma polarização no movimento dos vermes, como eles são equidistantes a partir de amostras de ensaio e de controlo, independentemente de que lado da origem começaram. Isso contorna o problema de vermes sendo forçados a viajar através de um conjunto de outros vermes para responder a um odorante, o que pode atrasar vermes ou forçá-los a tomar um caminho mais tortuoso, produzindo uma interpretação errada do seu caminho pretendido. Este método também apresenta vantagens práticas por ter um tamanho de amostra maior e permitindo que o pesquisador para executar o ensaio autônoma e marcar os vermes uma vez que o tempo estipulado expirou.
Introduction
Ward desenvolvido pela primeira vez o ensaio de quimiotaxia em 1973 5, e desde então tem tido aplicações de longo alcance. Neurobiology é um campo que beneficiou de utilizar uma variedade de ensaios de quimiotaxia. Adaptação olfativo, uma simples forma de aprendizagem e memória, foi demonstrada em C. elegans usando ensaios de quimiotaxia 6. Eles também têm sido usados para mostrar que a C. elegans pode desenvolver-etanol tolerância resultado demonstra que não só a plasticidade comportamental dos vermes, mas que também mostra que os vermes podem ser muito útil no estudo da dependência do álcool em humanos 3. Os ensaios têm mesmo sido desenvolvidos para demonstrar a capacidade de C. elegans para armazenar curto e memória de longo prazo, mostrando que as associações são feitas pelos vermes entre chemoattractants e Alimentação (OP50) 7. Além disso, dada a extensa informação actualmente disponível sobre o C. elegans do genoma, o chemotaxiO comportamento de C. elegans foi alterada várias vezes através da indução de mutações de 1,8. Isto permite muitas possibilidades interessantes de engenharia, tais como o desenvolvimento de C. elegans como uma ferramenta de biorremediação. Assim, uma vez que o desenvolvimento inicial do ensaio de quimiotaxia, em 1973, tem sido frequentemente alterado e utilizado para elucidar mistérios numa variedade de áreas.
Alguns ensaios teve como objetivo descobrir a rota específica tomada pelos vermes em direção a um alvo. O ensaio protótipo deste tipo foi desenvolvido por Ala 5. Três vermes foram colocados em agar derretido, durante 15 min. Os seus movimentos foram rastreados pelo cunho eles deixados como explorada a partir da periferia da placa superior de um gradiente de um atraente no centro da placa. Todos os vermes na placa foram presos utilizando clorofórmio no final de cada ensaio. Um descendente deste método de um único sem-fim colocado no meio da placa com o atractivo e a um controlet distâncias iguais e opostas a partir da origem 2.
Pierce-Shimomura et al. desenvolvido um ensaio para observar a natureza exacta do movimento envolvidos na quimiotaxia 9. Vermes individuais foram colocados em placas de Petri de 9 centímetros, quer contendo uma concentração uniforme do atraidor ou um gradiente de forma radial, que culminou com a fonte do atraidor. Um programa de computador que reconhece o worm foi usado para registrar o comportamento observado. Uma câmara de vídeo acoplada a um microscópio trabalhadas em conjunto com a fase de ajustar a placa de Petri automaticamente como o ensaio correu para assegurar o verme permaneceu no campo de visão. A partir daí, a informação mais detalhada foi descoberto em relação à causa de pirueta indicadas por C. elegans.
Outros ensaios, mais semelhantes ao descrito aqui, testou a resposta de uma grande população de vermes para compostos de teste. Dois quadrantes ensaios de quimiotaxia foramutilizada para explorar as funções que vários receptores, neurónios, e as moléculas de transdução de sinal quando reproduzido C. elegans foi exposto a vários compostos 1. Entre 20-50 vermes lavados foram colocados perto do centro da placa com um atraente e um controle nas extremidades polares, juntamente com o anestésico, azida de sódio (NaN3). Após 60 min, um índice quimiotáctico com valores a partir de -1,0 a +1,0 foi gerado com base na diferença entre o número de vermes foram afixadas no atractivo ou o controlo. Um índice quimiotáctico semelhante foi usada no ensaio relatado neste artigo, embora o ensaio anterior falhou para avaliar rigorosamente vermes não-móveis. Este ensaio foi posteriormente aplicada a testar os efeitos de ablação neuronal em quimiotaxia.
Outra variação do ensaio acima mencionado foi realizada 100-200 vermes onde foram colocados no centro de uma placa contendo quatro quadrantes 3. Quadrantes adjacentes ou o teste, ou contidocontrolar a substância. Tal como nos ensaios anteriores, os vermes foram imobilizadas por acção de azida de sódio, antes de serem marcados. Um método semelhante é descrito aqui como uma forma de avaliar a resposta de C. elegans para vários compostos. No entanto, o método abaixo tem a vantagem de apenas avaliar vermes que passaram uma distância limite que separa móvel de vermes imóveis.
Outros ensaios incorporaram diretrizes semelhantes para ignorar vermes imóveis. Frøkjær-Jensen et ai. desenvolvido um ensaio versátil que pode ser usado para testar os compostos solúveis tanto voláteis e água 10. A placa de Petri foi dividida em quatro quadrantes. Os quadrantes superior e inferior não contêm solventes. O quadrante esquerdo continha água, eo direito continha o atrativo. Ao testar odorantes voláteis, o analito foi colocado sobre a tampa da cápsula, ao longo do quadrante correcto, enquanto que os compostos solúveis em água, foram colocadas directamente no agar.
Os métodos actualmente existentes para avaliar a resposta quimiotáctica de C. elegans estão constantemente a ser refinado para optimizar a sua facilidade de uso, a eficiência e precisão. Assim, enquanto que o ensaio aqui descrito tem a capacidade de avaliar um maior número de vermes (máximo rendimento:. Vermes 250 / hora por placa, um pouco maior do que a taxa de transferência demonstrada por Lee et al, 3), a força real deste método é o sucinta culminar de muitos dos atributos dos ensaios anteriores (Tabela 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Quimiotaxia, embora controladas por um conjunto complexo de mecanismos neuronais e celulares, pode ser facilmente e objectivamente quantificada usando ensaios de quimiotaxia. Para obter os melhores resultados a partir dos ensaios, devem ser tomadas determinadas etapas críticas. Em primeiro lugar, encenando os vermes é essencial para dar resultados experimentais consistentes. Worms em diferentes fases da vida se comportam de forma diferente 13; vermes estágio tão misturada pode distorcer os resultados expe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Ciências da Vida e da Faculdade de Artes e Ciências da Universidade de Queen para financiar este trabalho. Assim, agradecemos o laboratório Chin-Sang para fornecer os reagentes necessários, equipamentos e suporte técnico. Agradecemos também QGEM 2011, especialmente Tony Ele, por sua contribuição para a discussão.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| S Basal (- cholesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K phosphate buffer, pH 6.0; dH2O to 1 liter.] Autoclave | |||
| PicoFuge | Stratagene | 400552 | |
| Microscopes | Leica | ||
| Dissecting | Leica | ||
| P1000 Pipette | Gilson | ||
| P10 Pipette | Gilson | ||
| 0.5 M Sodium Azide | |||
| Chemotaxis Agar [1.6% BBL-agar (Benton-Dickinson) or 2% Difco-agar. Autoclave. Add 5 mM potassium phosphate, pH 6.0; 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4] | |||
| Ethanol/Distilled Water | |||
| Test Compounds (eg. 0.5% diacetyl) | |||
| Agar | Bio-Rad | 166-0600 | |
| NH4Cl | Amresco | CA97062-046 | |
| MOPS | VWR | CA12001-120 | |
| NH4OH | BDH | CABDH8641-2 | |
| 0.25% Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 |
References
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74, 515-527 (1993).
- Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans. Neuron. 7, 729-742 (1991).
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