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Biology

线虫趋含量的

doi: 10.3791/50069 Published: April 27, 2013

Summary

定量评价的趋化反应的方法

Abstract

许多生物都使用趋化寻求食物来源,避免有毒物质,并寻找配偶。 线虫具有令人印象深刻的趋化行为。

后面测试蠕虫的加臭剂的反应的前提是将它们放置在一个区域,并观察响应的加臭剂诱发的运动。即使有许多可用的检测,优化蜗杆相对于起始位置的控 ​​制和测试区,同时最大限度地减少与对方,同时保持了显着的样本大小的相互作用蠕虫仍然正在进行中的1-10项的工作。这里描述的方法的目的是为解决这些问题,通过修改巴格曼等人开发的测定。甲培养皿分为四个象限,两个相对的象限标记为“测试”和两个被指定为“控制”。麻醉是摆在所有的测试和控制的网站。蠕虫放置在板的中心与精华É围绕原点标记,以确保非能动的蠕虫将被忽略。利用一个四象限系统,而不是一个或两个1消除偏置蠕虫的运动,因为它们是从试验组和对照样品的距离相等,而不管他们开始的哪一侧的起源。这就避免蠕虫被迫穿越其他蠕虫的集群,以应对气味,可延缓蠕虫或迫使他们采取更迂回的路线,其拟定的路径产生一个不正确的解释的问题。这种方法也显示了实用的优点,具有较大样本的大小和允许研究员无人值守运行分析和得分蠕虫一旦在规定的时间已过期。

Introduction

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沃德第一次在1973年5开发的趋化实验,并从那时起,它有深远的应用。神经生物学是一个领域,受惠于使用各种趋化实验。 C.嗅觉适应,学习和记忆的一种简单形式,已被证明在线虫趋化实验6。它们也被用来表明C。线虫可以开发乙醇耐受性的结果不仅展现了蠕虫的行为可塑性,但也表明,蠕虫可以是非常有用的,在研究酒精依赖人类3。检测甚至已经发展到展示的能力C.线虫短期和长期记忆存储协会是由趋化因子之间的蠕虫和食品(OP50)7。此外,由于广泛的信息,目前有关C.线虫基因组,chemotaxiC.行为已经改变了无数次的线虫进行基因突变1,8。这使得许多令人兴奋的工程的可能性,如发展C.线虫作为一个生物修复工具。因此,在1973年以来的初步发展的趋化实验,已经频繁地改变,用来阐明多种学科的奥秘。

某些实验旨在发现蠕虫朝着一个目标所采取的具体路线。这种原型试验是由沃德5。三虫熔化的琼脂上放置15分钟。他们的运动跟踪它们留下的印记,因为他们从一个梯度板在板的中心引诱的周边。盘上的所有蠕虫病毒被逮捕用氯仿在每次试验结束。这种方法的一个后裔在板中间放置一个单一的蠕虫的引诱和控制从原点2吨的距离相等,方向相反。

皮尔斯下村 。开发了一个试验,以观察在趋化9所涉及的移动的确切性质。个人蠕虫放置在9厘米的培养皿中可以含有引诱剂或径向形状的梯度均匀的浓度,最终在源的引诱剂。确认该蠕虫的计算机软件程序,是用来记录所观察到的行为。一种摄像机连接到显微镜一起工作的阶段来调整培养皿中,自动检测运行,以确保保持在视场中的蠕虫。由此看来,更详细的信息被发现的原因所显示的回旋线虫

其他检测,更类似于此处所述,测试一个人口众多的蠕虫病毒测试化合物的反应。二象限趋化实验已经用于探索各种神经细胞,受体和信号转导分子的角色时播放C.线虫暴露于各种化合物1。 20-50之间水洗蠕虫被放置在板的中心附近与引诱剂,麻醉剂,叠氮化钠(NaN 3的)一起在极性端和一个控制。 60分钟后,趋化指数值从-1.0到1.0,产生多少蠕虫贴的引诱剂或控制之间的差异的基础上。类似的趋化指数是用于测定在这篇文章中报道,虽然未能严格评估非能动的蠕虫早期检测。此法进一步趋化测试神经消融的影响。

进行上述测定法的另一种变化,其中含有四个象限3的板的中心被放置在100-200蠕虫。相邻象限包含测试或控制物质。在以前的实验中,蠕虫叠氮化钠的作用被固定之前被拿下。这里描述的类似的方法作为一种评价的反应C.线虫的各种化合物。但是,下面的方法有额外的好处,仅评估已通过阈值距离分离手机动的蠕虫蠕虫。

其他实验已纳入忽略不动的蠕虫类似指引。 frøkjær-Jensen 。开发出一种通用的检测,可以用来测试易失性和水溶性化合物10。培养皿分为四个象限。顶部和底部的象限内不含有溶剂。左象限包含水,以及所载的权利,引诱剂。测试时,挥发性的气味中,分析物被放置在盖子上的菜,在适当的象限,而水溶性化合物被直接放置在琼脂糖河

目前存在一种方法,用于评估的趋化反应线虫正在不断地被改进,以优化其便于使用,效率和准确性。所以,虽然这里描述的检测有能力评估的最大数量的蠕虫(最大吞吐量:250的蠕虫/小时每板,略大于由Lee 等人表现出的吞吐量);这种方法是真正的实力简洁的高潮许多早期检测( 表1)的属性。

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Protocol

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1。准备/洗涤蠕虫

  1. 同步蠕虫年轻成人11。
  2. 吸取2毫升到5厘米的趋化板的S基础上演OP50 E.刚刚清除草坪蠕虫大肠杆菌 。倾斜板,根据需要,以确保到缓冲区中的板面从洗涤蠕虫。
  3. 吸取1毫升离心管蠕虫-S基础的解决方案。
  4. ,持续10秒使用PicoFuge,在6,600 rpm转速下离心。
  5. 吸的S基础,离开颗粒蠕虫不受干扰的。
  6. ML小号基础的解决方案添加到离心管中,颠倒几次洗蠕虫。
  7. 重复步骤1.4〜1.6另外三次。
  8. 离心的第五时间,这段时间吸取上清液,至终体积为约10秒。 100微升。
  9. 取2微升到NGM板,以确保各2微升样品中,有50和250之间的蠕虫的蠕虫。调整根据需要通过重悬体积更小或更大的S基底中的蠕虫的蠕虫在S基底的浓度。
  10. 使用后立即洗了长达1小时的蠕虫蠕虫检测。

2。准备测试板

  1. 标志着一个5厘米的板的底面,分为4象限划分的菜。趋化琼脂或NGM的也可使用。需要最少3个试验正在测试每遗传应变。
  2. 马克的圆的半径为0.5厘米的原点周围( 图1)。
  3. 使用一个“T”为“测试”或“C”为“控制”,确保该网站是等距离的起源和相互点标记在每个象限。点必须远离原点至少2厘米。马克左上角和右下角的象限作为测试象限的右上方和左下象限作为对照( 图1)。

3。运行试验

  • 相结合的试验化合物和0.5M磷酰基叠氮化物(麻醉剂使用逮捕的蠕虫在到达一个象限)的等体积混合供试品溶液。混合控制解决方案相结合,所用的溶剂稀释试验化合物用0.5 M的叠氮化物。
  • 吸取2μl的蠕虫溶液(1.8)编制沉淀到原点(两线相交)。
  • 紧接着吸管2微升的两个“T”网站上的测试解决方案。同样地,移液管的控制解决方案的相同数量的两个“C”的网站上。
  • 一旦蠕虫和嗅觉下降已在琼脂吸收,更换盖子,翻转板。
  • 60分钟后,将蠕虫病毒在4℃培养箱。只有从孵化器中取出板时,它可以算作。离开蠕虫在室温下,可能让他们再次动员。
  • 记录每一个象限中的蠕虫数目,完全越过内保监会文件中。
  • 重复使用控制解决方案在测试和控制象限步骤3.2至3.6。这将作为控制板。三板应该和运行服务作为一个适当的控制。
  • 4。解读比分/确定趋化指数

    1. 使用公式1计算趋化指数。这将产生一个趋化指数-1.0和+1.0之间。

    (1)

    趋化指数=(#蠕虫在两个测试象限 - #蠕虫两个控制象限)/(总进球蠕虫)

    1.0的比分实现的目标,并表示最大的吸引力,蠕虫抵达含有化学目标象限代表100%。指数-1.0最大排斥的证据。类似的检测方法已经被聘用3名( 见表1)。

    1. 报告平均ChemotaxiS指数(CI)和标准误差(SEM)。执行一个Student T检验比较的数据,从试验组和对照板。

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    Representative Results

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    比较野生型(N2)C. ODR-10(KY10)突变的线虫

    我们使用的丁二酮,公知的C。线虫趋化双乙酰1,12缺乏受体的突变,比较野生型蠕虫。对于野生型(N2)蠕虫的趋化指数为(0.100±0.066)乙醇和0.839±0.031至0.5%的二乙酰。正如预期的那样,二乙酰引出一个显着chemoattractive的野生型蠕虫(P <0.003)的响应。与此相反,在ODR-10(KY10)突变体缺乏二乙酰基受体有二乙酰CI,没有显着不同( 图3)的控制。

    作者 #蠕虫/板 时间(min) 1小时吞吐量(最大#蠕虫) 优点 缺点
    沃德5 3 15 12 •轨道运动
    •帐户不动的蠕虫通过清晰的观察
    依赖研究员受累在短的时间间隔(15分钟)
    巴格曼霍维茨2 1 60 1 •低吞吐量
    •引诱扩散12-24小时
    巴格曼,Hartwieg,霍维茨1次 20-50 60 50 •最小的研究员参与(NaN 3的使用)
    •中度#蠕虫
    没有谨慎的不动的评分方法
    •不跟踪运动
    李,JEE,麦金太尔3 100-200 60 200 •最小的研究员参与(NaN 3的使用)
    •高#蠕虫
    皮尔斯下村,莫尔斯,Lockery 9 1 20(或直到蠕虫命中板块边缘) 3 •轨道运动
    •帐户不动的蠕虫通过清晰的观察
    •详细,永久记录蠕虫运动
    需要先进的电脑跟踪系统
    玛吉,帕尔默,金桑(这个方法) 50-250 60 250 •最小的研究员参与(NaN 3的使用)
    •高#蠕虫占动的蠕虫
    •不跟踪运动

    表1中。测定方法的比较说明。


    图1。分为四个象限,无论是作为测试(“T”)或控制区域(“C”)的每一个被指定的5厘米的陪替氏培养皿。内圆描绘的地方运动,没有进球。从倾斜的数据,这可以防止不动的蠕虫。象限创建一个交替模式试验和控制,以防止可能发生从最初的安置蠕虫任何偏见。

    图2
    图2。改编自Lee 等人 (2009)的检测示意图板分为象限两个测试(A&B)和两个对照组(C&D)。叠氮化钠还包括测试和控制点,以瘫痪蠕虫。蠕虫都放置在板的中心,并在60分钟后的蠕虫计数在每个QUADRANT。个人认为没有交叉的内圈都没有进球。中性及诱食原理的例子表示。的趋化指数(CI)的计算如下所示。

    图3
    图3。产生的趋化指数与野生型(WT)ODR-10(KY10)蠕虫病毒,可以使用双乙酰作为测试引诱或乙醇(控制板)进行检测。价值观是平均至少有3个独立的实验(N> 200蠕虫)为每个条件。误差棒反映均值的标准误差(SEM)* = P <0.003学生T检验。

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    Discussion

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    趋化,虽然控制的一组复杂的神经元和细胞机制,能够容易且客观的定量使用趋化实验。为了获得最佳的检测结果,必须采取某些关键步骤。首先,举办蠕虫产生一致的实验结果是必不可少的。蠕虫在不同的人生阶段有不同的行为13,所以混合阶段蠕虫可能会歪斜实验结果。其次,确保所有E.大肠杆菌洗掉的蠕虫是至关重要的,因为残留的细菌可能会干扰检测。同样重要的是,要注意的是0.5-1 M-叠氮钠,麻醉剂,将抓蠕虫于1厘米的半径,它被放置的地方。鉴于此,它是最重要的,叠氮化物被放置至少2厘米,从原点。如果叠氮化物被发现从原点1.5厘米或以下的蠕虫将瘫痪的小圈子内,没有人会被拿下。进一步叠氮化物的放置位置,再装入象限蠕虫可以移动。板也应保持水平,以确保一致性试验,以确保结果不会混淆引力偏差。此外,应不超过250个蠕虫在实验中使用。拥挤可能会阻碍蜗杆的运动有很多原因。我们发现,集群蠕虫往往放在一起,赞成象限旅行。最后,在4℃下60分钟后,将测定板保持蠕虫的移动,使研究者保持板的状态,直到它能够被计数。板可以储存在4℃,并在不影响结果的情况下拿下了几天后。

    几个程序的修改,可以进一步增强系统的效用,此协议。至于,这个协议可以作为单独的试验测试各种表型的方法。理想的情况下,突变体试验的结果应当在相同条件下进行比较。使用菌株表达fluoresc耳鼻喉科蛋白如GFP或RFP会做到这一点。这种修改将使研究员更大的实验的一致性,通过将不同菌株在相同的实验板和受益的一个板块,而不是得分打进测试与控制板。

    趋化实验,也可使用基因工程线虫的趋化行为的特征。这允许进行测试,考虑来自其他物种的受体的结合亲和力。如果这些受体表达的趋化或chemorepulsive的蠕虫的神经元,以兼容的方式,应观察到预期的趋化结果8。

    此协议可再作调整,以适应其他的需要,以及。目前,这种方法不容许,研究者跟踪运动的蠕虫。 5厘米的板,因为用于这些检测方法是可以接受的,视频摄像机可以有效地连接到在立体显微镜拍摄的运动的蠕虫向一个象限的测定不使用电动载物台和蠕虫跟踪软件。最后,虽然趋化因子主要是指在协议中,作为供试化合物,chemorepellents可能还可以使用。该协议或修改,是简单而有效的,可以作为一个有效的工具,量化的趋化行为C.线虫 ,或在高中或本科层次的学生展示的行为。

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    Disclosures

    我们什么都没有透露。

    Acknowledgments

    我们感谢生命科学与艺术和科学学院在皇后大学为这项工作提供资金。同时,我们感谢钦生实验室提供必要的试剂,设备和技术支持。我们也感谢2011年QGEM,尤其是托尼,他为他的贡献的讨论。

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    S Basal (- cholesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K phosphate buffer, pH 6.0; dH2O to 1 liter.] Autoclave
    PicoFuge Stratagene 400552
    Microscopes Leica
    Dissecting Leica
    P1000 Pipette Gilson
    P10 Pipette Gilson
    0.5 M Sodium Azide
    Chemotaxis Agar [1.6% BBL-agar (Benton-Dickinson) or 2% Difco-agar. Autoclave. Add 5 mM potassium phosphate, pH 6.0; 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4]
    Ethanol/Distilled Water
    Test Compounds (eg. 0.5% diacetyl)
    Agar Bio-Rad 166-0600
    NH4Cl Amresco CA97062-046
    MOPS VWR CA12001-120
    NH4OH BDH CABDH8641-2
    0.25% Tween 20 Bio-Rad 170-6531

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    Cite this Article

    Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. elegans Chemotaxis Assay. J. Vis. Exp. (74), e50069, doi:10.3791/50069 (2013).More

    Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. elegans Chemotaxis Assay. J. Vis. Exp. (74), e50069, doi:10.3791/50069 (2013).

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