C. elegans Chemotaxis Assay

Summary

Um método para avaliar quantitativamente a resposta quimiotáctica de

Abstract

Muitos organismos usam a quimiotaxia para buscar fontes de alimentos, evitar substâncias nocivas, e encontrar companheiros. Caenorhabditis elegans tem comportamento quimiotaxia impressionante.

A premissa subjacente testar a resposta dos vermes a um odorante é colocá-los em uma área e observar o movimento evocada em resposta a um odorante. Mesmo com os diversos ensaios disponíveis, optimizando verme localização inicial em relação a ambas as áreas de teste e de controlo, enquanto minimiza a interacção de vermes com o outro, mantendo ao mesmo tempo uma amostra significativa, continua a ser um trabalho em progresso ^1-10. O método descrito aqui pretende abordar estas questões através da modificação do ensaio desenvolvido por Bargmann et al. ^1. A placa de Petri é dividido em quatro quadrantes, dois quadrantes opostos marcados "teste" e dois são designados como "Controle". Anestésico é colocado em todos os testes e os locais de controlo. Os vermes são colocados no centro da placa com uma circle marcados em torno da origem para assegurar que os vermes não-móveis serão ignorados. Utilizando um sistema de quatro quadrantes, em vez de um ou 2 dois elimina uma polarização no movimento dos vermes, como eles são equidistantes a partir de amostras de ensaio e de controlo, independentemente de que lado da origem começaram. Isso contorna o problema de vermes sendo forçados a viajar através de um conjunto de outros vermes para responder a um odorante, o que pode atrasar vermes ou forçá-los a tomar um caminho mais tortuoso, produzindo uma interpretação errada do seu caminho pretendido. Este método também apresenta vantagens práticas por ter um tamanho de amostra maior e permitindo que o pesquisador para executar o ensaio autônoma e marcar os vermes uma vez que o tempo estipulado expirou.

Introduction

Ward desenvolvido pela primeira vez o ensaio de quimiotaxia em 1973 ^5, e desde então tem tido aplicações de longo alcance. Neurobiology é um campo que beneficiou de utilizar uma variedade de ensaios de quimiotaxia. Adaptação olfativo, uma simples forma de aprendizagem e memória, foi demonstrada em C. elegans usando ensaios de quimiotaxia ^6. Eles também têm sido usados ​​para mostrar que a C. elegans pode desenvolver-etanol tolerância resultado demonstra que não só a plasticidade comportamental dos vermes, mas que também mostra que os vermes podem ser muito útil no estudo da dependência do álcool em humanos ^3. Os ensaios têm mesmo sido desenvolvidos para demonstrar a capacidade de C. elegans para armazenar curto e memória de longo prazo, mostrando que as associações são feitas pelos vermes entre chemoattractants e Alimentação (OP50) ^7. Além disso, dada a extensa informação actualmente disponível sobre o C. elegans do genoma, o chemotaxiO comportamento de C. elegans foi alterada várias vezes através da indução de mutações de ^1,8. Isto permite muitas possibilidades interessantes de engenharia, tais como o desenvolvimento de C. elegans como uma ferramenta de biorremediação. Assim, uma vez que o desenvolvimento inicial do ensaio de quimiotaxia, em 1973, tem sido frequentemente alterado e utilizado para elucidar mistérios numa variedade de áreas.

Alguns ensaios teve como objetivo descobrir a rota específica tomada pelos vermes em direção a um alvo. O ensaio protótipo deste tipo foi desenvolvido por Ala ^5. Três vermes foram colocados em agar derretido, durante 15 min. Os seus movimentos foram rastreados pelo cunho eles deixados como explorada a partir da periferia da placa superior de um gradiente de um atraente no centro da placa. Todos os vermes na placa foram presos utilizando clorofórmio no final de cada ensaio. Um descendente deste método de um único sem-fim colocado no meio da placa com o atractivo e a um controlet distâncias iguais e opostas a partir da origem ^2.

Pierce-Shimomura et al. desenvolvido um ensaio para observar a natureza exacta do movimento envolvidos na quimiotaxia ^9. Vermes individuais foram colocados em placas de Petri de 9 centímetros, quer contendo uma concentração uniforme do atraidor ou um gradiente de forma radial, que culminou com a fonte do atraidor. Um programa de computador que reconhece o worm foi usado para registrar o comportamento observado. Uma câmara de vídeo acoplada a um microscópio trabalhadas em conjunto com a fase de ajustar a placa de Petri automaticamente como o ensaio correu para assegurar o verme permaneceu no campo de visão. A partir daí, a informação mais detalhada foi descoberto em relação à causa de pirueta indicadas por C. elegans.

Outros ensaios, mais semelhantes ao descrito aqui, testou a resposta de uma grande população de vermes para compostos de teste. Dois quadrantes ensaios de quimiotaxia foramutilizada para explorar as funções que vários receptores, neurónios, e as moléculas de transdução de sinal quando reproduzido C. elegans foi exposto a vários compostos ^1. Entre 20-50 vermes lavados foram colocados perto do centro da placa com um atraente e um controle nas extremidades polares, juntamente com o anestésico, azida de sódio _(NaN3). Após 60 min, um índice quimiotáctico com valores a partir de -1,0 a +1,0 foi gerado com base na diferença entre o número de vermes foram afixadas no atractivo ou o controlo. Um índice quimiotáctico semelhante foi usada no ensaio relatado neste artigo, embora o ensaio anterior falhou para avaliar rigorosamente vermes não-móveis. Este ensaio foi posteriormente aplicada a testar os efeitos de ablação neuronal em quimiotaxia.

Outra variação do ensaio acima mencionado foi realizada 100-200 vermes onde foram colocados no centro de uma placa contendo quatro quadrantes ^3. Quadrantes adjacentes ou o teste, ou contidocontrolar a substância. Tal como nos ensaios anteriores, os vermes foram imobilizadas por acção de azida de sódio, antes de serem marcados. Um método semelhante é descrito aqui como uma forma de avaliar a resposta de C. elegans para vários compostos. No entanto, o método abaixo tem a vantagem de apenas avaliar vermes que passaram uma distância limite que separa móvel de vermes imóveis.

Outros ensaios incorporaram diretrizes semelhantes para ignorar vermes imóveis. Frøkjær-Jensen et ai. desenvolvido um ensaio versátil que pode ser usado para testar os compostos solúveis tanto voláteis e água ^10. A placa de Petri foi dividida em quatro quadrantes. Os quadrantes superior e inferior não contêm solventes. O quadrante esquerdo continha água, eo direito continha o atrativo. Ao testar odorantes voláteis, o analito foi colocado sobre a tampa da cápsula, ao longo do quadrante correcto, enquanto que os compostos solúveis em água, foram colocadas directamente no agar.

Os métodos actualmente existentes para avaliar a resposta quimiotáctica de C. elegans estão constantemente a ser refinado para optimizar a sua facilidade de uso, a eficiência e precisão. Assim, enquanto que o ensaio aqui descrito tem a capacidade de avaliar um maior número de vermes (máximo rendimento:. Vermes 250 / hora por placa, um pouco maior do que a taxa de transferência demonstrada por Lee et al, ^3), a força real deste método é o sucinta culminar de muitos dos atributos dos ensaios anteriores (Tabela 1).

Protocol

1. Preparação / lavar os Worms

1. Sincronizar vermes adultos jovens ^11.
2. Pipetar 2 ml da Basal S em uma placa de 5 cm de Chemotaxis encenado vermes que só limpou o gramado do OP50 E. coli. Incline a placa conforme necessário para garantir que os vermes são lavados da superfície da placa para o buffer.
3. Pipete 1 mL de solução de Basal verme-S para um tubo de microcentrífuga.
4. Centrifugar durante 10 segundos usando um PicoFuge em 6600 rpm.
5. Aspirar o Basal S, deixando a pelota de vermes não perturbadas.
6. Adicionar 1 ml de solução de S basal ao tubo de microcentrífuga, invertido várias vezes para lavar os vermes.
7. Repita os passos 1.4 a 1.6 mais três vezes.
8. Centrifugue durante 10 segundos a quinta vez, desta vez aspirando o sobrenadante para um volume final de ca. 100 ul.
9. Pipeta 2 ul dos vermes numa placa NGM para garantir que há entre 50 e 250 vermes em cada amostra de 2 ul. Ajustara concentração de vermes no basal S conforme necessário por ressuspensão dos vermes em um volume maior ou menor de S basal.
10. Usar os vermes no ensaio imediatamente após a lavagem dos vermes para até 1 hora.

2. Preparar as placas de teste

1. Marcando o lado de baixo de uma placa de 5 cm, dividir o prato em quatro quadrantes iguais. Pode ser utilizado ou ágar Quimiotaxia NGM. Um mínimo de três ensaios são necessários por estirpe genética a ser testado.
2. Marque um círculo com um raio de 0,5 centímetros em torno da origem (figura 1).
3. Marcar um ponto em cada quadrante com qualquer um "T" para "Test" ou "C" para "Control", garantindo que os sites estão equidistantes da origem e outro. Os pontos devem ser pelo menos 2 cm de distância da origem. Marcar o canto superior esquerdo e inferior direito quadrantes como quadrantes teste e no canto superior direito e inferior esquerdo quadrantes como controles (Figura 1).

3. A execução do ensaio

Misturar a solução de ensaio através da combinação de volumes iguais de o composto de teste e 0,5 M azida (um anestésico usado para prender os vermes ao atingir um quadrante). Misturar a solução de controlo, combinando o solvente utilizado para diluir o composto de teste, com 0,5 M de azida.

Pipeta 2 ul da solução de verme (preparado em 1.8) a partir da pelota para a origem (onde as duas linhas se cruzam).

Imediatamente depois, pipeta 2 mL da solução de ensaio para os dois locais de "T". Da mesma forma, pipetar a mesma quantidade da solução de controlo para os dois locais de "C".

Uma vez que os vermes e odorante gotas foram absorvidas no agar, substituir as tampas e inverter as placas.

Após 60 min, coloque os vermes numa incubadora de 4 ° C. Apenas remover uma placa da incubadora, quando pode ser contado. Partindo vermes, à temperatura ambiente, pode permitir a mobilização de novo.

Anote o número de vermes em cada quadrante que cruzou completamente a circ interiorle.

Repita os passos 3.2 a 3.6, utilizando a solução de controlo em ambos os quadrantes de ensaio e de controlo. Isto servirá como a placa de controlo. Três dessas placas devem ser feitas e correr para servir como um controle adequado.

4. Interpretando os Scores / determinação do índice de quimiotaxia

1. Calcular o índice de quimiotaxia usando a Equação 1. Isso vai render um índice quimiotático entre -1,0 e 1,0.

(1)

Quimiotaxia Index = (# Worms em ambos os quadrantes do teste - # Worms em ambos os quadrantes Controle) / (N º total de gols Worms)

Uma pontuação de 1,0 indica atracção máxima em direcção ao alvo e representa 100% dos vermes que chegam nos quadrantes contendo o alvo química. Um índice de -1,0 evidência de repulsão máxima. Métodos de ensaio semelhantes foram já empregues ³ (Tabela 1).

2. Indicar a média Chemotaxis Index (CI) e erro padrão da média (SEM). Realizar o t-teste de Student comparando os dados a partir das placas de ensaio e de controlo.

Representative Results

Comparando-se o tipo selvagem (N2) C. elegans para o ODR-10 (KY10) mutante.

Usamos diacetil, um conhecido C. elegans quimioatractor, para comparar os vermes de tipo selvagem para o de um mutante que carece do receptor para diacetil ^1,12. Por tipo selvagem (N2), o índice quimiotáctico vermes era de 0,100 ± 0,066 para o etanol, e 0,839 ± 0,031-0,5% de diacetil. Como esperado, diacetil provoca uma resposta significativa quimioatratante de vermes de tipo selvagem (P <0,003). Em contraste com o ODR-10 (KY10) mutantes que faltam os receptores diacetil tinha um IC de diacetilo, que não foi significativamente diferente dos controlos (Figura 3).

Autor	# Vermes / placa	Duração (min)	1 hr de transferência (Max # vermes)	Prós	Contras
Ward 5	3	15	12	• movimento pista • conta para vermes imóveis por observação clara	dependente de envolvimento pesquisador @ curtos intervalos de tempo (15 min)
Bargmann Horvitz & 2	1	60	1		• baixo rendimento • difunde atrativo para 12-24 hr
Bargmann, Hartwieg, Horvitz 1	20-50	60	50	• envolvimento pesquisador mínima (NaN 3 usado) • moderados # vermes	• nenhum método de pontuação imóvel discreto • não acompanhar o movimento
Lee, Jee, McIntire 3	100-200	60	200	• envolvimento pesquisador mínima (NaN 3 usado) • alta #vermes
Pierce-Shimomura, Morse, Lockery 9	1	20 (ou até a ponta do sem-fim de acessos de placa)	3	• movimento pista • conta para vermes imóveis por observação clara • detalhado, registro permanente de movimento sem-fim	requer avançado sistema de rastreamento de computador
Margie, Palmer, Chin-Sang (este método)	50-250	60	250	• envolvimento pesquisador mínima (NaN 3 usado) • HIGH # vermes • contas para vermes imóveis	• não acompanhar o movimento

Tabela 1. Comparação dos métodos de ensaio descritos.

Figura 1. A placa de Petri de cinco centímetros é dividido em quatro quadrantes, cada um designado, quer como teste ("T") ou de controlo ("C"), a área de. O círculo interno delimita uma área onde o movimento não é marcado. Isso evita vermes imóveis de distorcer os dados. Os quadrantes criar um padrão alternado de teste e controle para evitar qualquer viés que pode ocorrer a partir da colocação inicial dos vermes.

Figura 2. Um diagrama esquemático do ensaio adaptado a partir de Lee et al. (2009). Placas estão divididas em dois quadrantes de ensaio (A e B) e dois controlos (C e D). A azida de sódio também está incluído com os pontos de teste e de controle para paralisar vermes. Worms são colocados no centro do prato e após 60 minutos os vermes são contadas em cada quadrant. Indivíduos que não atravessam o círculo interno não são pontuados. São indicados exemplos esquemáticos de neutro e atractivo. O cálculo do Índice Quimiotáticos (Cl) é apresentado abaixo.

Figura 3. Índices Quimiotáticos gerados a partir de ensaios realizados com vermes de tipo selvagem (wt) e odr-10 (KY10) utilizando quer diacetil como um teste de atracção ou de etanol (placas de controlo). Valores apresentados são médias de pelo menos três experiências independentes (n> 200 vermes) para cada condição. As barras de erro refletem o erro padrão da média (EPM) * = P <0,003 teste t de Student.

Discussion

Quimiotaxia, embora controladas por um conjunto complexo de mecanismos neuronais e celulares, pode ser facilmente e objectivamente quantificada usando ensaios de quimiotaxia. Para obter os melhores resultados a partir dos ensaios, devem ser tomadas determinadas etapas críticas. Em primeiro lugar, encenando os vermes é essencial para dar resultados experimentais consistentes. Worms em diferentes fases da vida se comportam de forma diferente ^13; vermes estágio tão misturada pode distorcer os resultados experimentais. Em segundo lugar, assegurar todas as E. coli é lavado dos vermes é crucial, dado que as bactérias residuais podem interferir com o ensaio. É também importante notar que o anestésico, 0,5-1 M de azida de sódio, vai prender vermes dentro de um raio de um centímetro em que foi colocada. Dado isto, é fundamental que a azida de ser colocado em pelo menos 2 cm a partir da origem. Se a azida é manchado ou menos 1,5 cm a origem dos vermes será paralisado dentro do círculo interno e nenhum será pontuada. A continuação da azida é colocado, o mais para oquadrantes os vermes podem se mover. Placas também devem ser mantidos nível para garantir a consistência entre os ensaios e para garantir os resultados não são confundidos por preconceitos gravitacionais. Além disso, não mais do que 250 vermes deve ser utilizada na experiência. A aglomeração pode impedir o movimento sem-fim por um número de razões. Descobrimos que os vermes cluster tendem a permanecer juntos, em favor de viajar para um quadrante. Finalmente, a colocação das placas de ensaio a 4 ° C, após 60 min a mantém os vermes de movimento, permitindo que o investigador para preservar o estado da placa até que ele é capaz de ser contado. As placas podem armazenada a 4 ° C e teve vários dias mais tarde, sem afectar os resultados.

Algumas modificações processuais podem aumentar ainda mais a utilidade do presente protocolo. Como é, este protocolo pode servir como um método para testar uma variedade de fenótipos em ensaios separados. Idealmente, os resultados dos ensaios do mutante deve ser comparado, nas mesmas condições. Utilizando cepas que expressam fluoresrentes proteínas, como GFP ou RFP que fazer isso. Esta modificação daria ao investigador uma maior consistência experimental, colocando as várias estirpes na mesma placa de ensaio e o benefício de conseguir uma placa, em vez de causar placas de teste versus controlo.

Os ensaios de quimiotaxia podem também ser utilizados para caracterizar o comportamento quimiotáctica de vermes nematóides geneticamente modificadas. Isto permite que a afinidade de ligação de receptores de tomadas a partir de outras espécies a serem testados. Se estes receptores são expressos nos neurónios quimioatratantes ou chemorepulsive do verme de uma forma compatível, os resultados esperados quimiotáticos deve ser observada ^8.

Este protocolo pode ainda ser adaptado para atender outras necessidades também. Atualmente, este método não permite que o investigador para acompanhar o movimento de vermes. Porque 5 placas cm são aceitáveis ​​para estes ensaios, uma câmera de vídeo acoplada a um estereomicroscópio pode efetivamente filmar o movimentodos vermes em relação a um quadrante do ensaio, sem a utilização de uma platina motorizada e software de rastreamento verme. Finalmente, embora quimioatractores são referidos principalmente como os compostos de teste do protocolo, podem também ser utilizados chemorepellents. Este protocolo, como está ou modificado, é simples e eficiente e pode servir como uma ferramenta eficaz para quantificar o comportamento quimiotático de C. elegans, ou para demonstrar o comportamento de estudantes no ensino médio ou nível de graduação.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
S Basal (- cholesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K phosphate buffer, pH 6.0; dH2O to 1 liter.] Autoclave
PicoFuge	Stratagene	400552
Microscopes	Leica
Dissecting	Leica
P1000 Pipette	Gilson
P10 Pipette	Gilson
0.5 M Sodium Azide
Chemotaxis Agar [1.6% BBL-agar (Benton-Dickinson) or 2% Difco-agar. Autoclave. Add 5 mM potassium phosphate, pH 6.0; 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4]
Ethanol/Distilled Water
Test Compounds (eg. 0.5% diacetyl)
Agar	Bio-Rad	166-0600
NH4Cl	Amresco	CA97062-046
MOPS	VWR	CA12001-120
NH4OH	BDH	CABDH8641-2
0.25% Tween 20	Bio-Rad	170-6531