Summary
हम ठंड और cryosectioning खमीर फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के आंतरिक पैटर्न का पालन समुदायों के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित. मेथनॉल फिक्सिंग विधि पर निर्भर करता है और एक समुदाय के भीतर फ्लोरोसेंट प्रोटीन निष्क्रिय बिना कोशिकाओं के स्थानिक वितरण की रक्षा अक्टूबर - embedding.
Abstract
रोगाणुओं समुदायों में आम तौर पर रहते हैं. एक समुदाय के भीतर कोशिकाओं के स्थानिक संगठन और एक समुदाय के अस्तित्व समारोह को प्रभावित करने के लिए माना जाता है. Confocal और दो photon माइक्रोस्कोपी सहित ऑप्टिकल सेक्शनिंग तकनीक, बैक्टीरियल और archaeal 2,3 समुदायों के स्थानिक संगठन के अवलोकन के लिए उपयोगी साबित किया है. Confocal इमेजिंग और खमीर कालोनियों के शारीरिक सेक्शनिंग का एक संयोजन 4 कोशिकाओं के आंतरिक संगठन से पता चला है. हालांकि, प्रत्यक्ष ऑप्टिकल Sectioning confocal या दो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग केवल कुछ सेल खमीर कालोनियों में गहरी परतों तक पहुँचने में सक्षम किया गया है. यह सीमा 4 खमीर कोशिकाओं से प्रकाश की मजबूत बिखरने की वजह से होने की संभावना है.
यहाँ, हम एक फिक्सिंग और Saccharomyces cerevisiae समुदायों के भीतर फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के स्थानिक वितरण प्राप्त cryosectioning के आधार पर विधि प्रस्तुत करते हैं. हम लगानेवाला एजेंट के रूप में मेथनॉल का उपयोग करेंकोशिकाओं के स्थानिक वितरण की रक्षा के लिए. फिक्स्ड समुदायों अक्टूबर यौगिक, जमे हुए, और एक cryostat में cryosectioned के साथ घुसपैठ कर रहे हैं. अनुभागों प्रतिदीप्ति इमेजिंग समुदाय के भीतर फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के आंतरिक संगठन का पता चलता है.
खमीर उपभेदों के लाल और हरे रंग का फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त मिलकर समुदायों के उदाहरण विधि cryosectioning फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के स्थानिक वितरण के रूप में कि खमीर 2,3 कालोनियों के भीतर जीन की अभिव्यक्ति के रूप में अच्छी तरह से को उजागर करने की क्षमता को प्रदर्शित करता है. हालांकि हमारे Saccharomyces cerevisiae समुदायों पर ध्यान केंद्रित किया गया है, एक ही विधि का संभावित अन्य माइक्रोबियल समुदायों की जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है.
Protocol
1. खमीर समुदाय फिक्सिंग
- एक झिल्ली फिल्टर (चित्रा 2A उदाहरण के लिए, Millipore एमएफ झिल्ली फिल्टर) पर खमीर समुदायों आगे बढ़ें. इस प्रोटोकॉल एक 6 मिमी व्यास झिल्ली फिल्टर पर कम से कम 8 2x10 कोशिकाओं का एक विशिष्ट समुदाय से मेल खाती है.
- वाटमान 541 फिल्टर पेपर के एक टुकड़े का उपयोग करने के लिए एक अच्छी तरह से 1 सेमी व्यास (चित्रा 2B) के नीचे कवर. इस वाटमान कागज एक के बाद के चरणों में समुदाय हस्तांतरण के वाहक के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा. अच्छी तरह से करने के लिए 1 मिलीग्राम 100% मेथनॉल जोड़ें, और समभार बनाना तापमान -20 डिग्री सेल्सियस में अच्छी तरह से छोड़.
- N 2 में एक देवर तरल रखो. तरल में कम से कम 15 सेकंड के लिए समुदाय N की सूई 2 एक मोचनी (चित्रा 2C) का उपयोग करके रुक तरल नाइट्रोजन में समुदाय.
- -20 डिग्री सेल्सियस मेथनॉल (चित्रा 2 डी) की अच्छी तरह से करने के लिए जमे हुए समुदाय स्थानांतरण. सुनिश्चित करें कि समुदाय क्षैतिज रखा जाता है जब यह मिथेनॉल में submerging.20 मिनट रुको. एमएफ झिल्ली फिल्टर मेथनॉल में बिखर शुरू होता है.
- मेथनॉल से मेथनॉल वाष्पीकरण (चित्रा 2 ई) के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा एक ठंड पेट्री डिश के लिए अच्छी तरह से समुदाय वाहक का उपयोग वाटमान 541 फिल्टर पेपर स्थानांतरण. जब हस्तांतरण, वाहक वाटमान फिल्टर के शीर्ष पर समुदाय रखने के लिए और आकर्षित दूर मेथनॉल के अतिरिक्त बूँदें ठंड पेट्री डिश में डालने से पहले मोटी वाटमान कागज का एक और टुकड़ा का उपयोग. इससे यह सुनिश्चित होगा है कि वाष्पीकरण समय नमूना से नमूना अनुरूप है.
- वाष्पीकरण के लिए 4-6 घंटे रुको जब तक वाहक वाटमान फिल्टर सूखा लग रहा है. अपर्याप्त वाष्पीकरण अवशिष्ट मेथनॉल जो सेक्शनिंग साथ हस्तक्षेप छोड़ देता है. कारण समुदायों में दरारें और विरूपण अधिक सुखाने.
- नमूना -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर के बाहर ले जाओ. दूर वाटमान 541 फिल्टर कागज समुदाय द्वारा कवर नहीं काटें.
- एक आयताकार घन एल्यूमीनियम पन्नी कंटेनर जो इतना बड़ा है कि इस तरह के नमूना ~ 2 मिमी कम से कम मार्जिन से हैप्रत्येक पक्ष (चित्रा 2 एफ). एल्यूमीनियम पन्नी कंटेनर के नीचे की सतह पर समुदाय प्लेस, तुरंत अक्टूबर के साथ 3 से नमूना ~ समुदाय की ऊंचाई से ऊपर 4 मिमी को कवर. महत्वपूर्ण अगर नमूना के उन्मुखीकरण कंटेनर के पक्ष के संबंध के साथ इस कदम में समायोजित किया जा सकता है. 10 मिनट रुको.
- सूखी बर्फ पर फ्रीज करने के लिए एक धातु की थाली पर अक्टूबर - एम्बेडेड नमूना रखें. -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में जमे हुए समुदायों स्टोर.
2. प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए जमे हुए समुदाय सेक्शनिंग
- Cryosection कक्ष का तापमान -25 डिग्री सेल्सियस सेट और चैम्बर में नमूने छोड़ जब तक इसके तापमान चैम्बर के तापमान तक पहुँचता है.
- एक क्रायो माउंट पर माउंट पर अक्टूबर की एक बूंद को लागू करने के बाद नमूना माउंट. अक्टूबर कि अक्टूबर 2-3 मिमी मोटाई है तो समान रूप से उजागर वाटमान फिल्टर पेपर (कंटेनर के नीचे) के साथ नमूना के पक्ष पर बिखरा हुआ है. अक्टूबर से पहले cryostat कक्ष के अंदर फ्रीज चलोctioning. 2-3 मिमी के एक नमूने के सभी पक्षों पर अक्टूबर मार्जिन सुनिश्चित वर्गों की अखंडता को बनाए रखने में मदद करता है.
- अक्टूबर नमूना ब्लॉक के पक्ष नमूना संरेखित करें करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अगर नमूना ब्लेड के लिए सम्मान के साथ गठबंधन नहीं है, सेक्शनिंग या नमूना के कोने की ओर से शुरू कर देंगे. माउंट समायोजित करने के लिए सुनिश्चित करें कि ब्लेड एक पूरी तरह से खड़ी नमूना ब्लॉक के चेहरे (क्षैतिज) में कटौती.
- खमीर समुदायों के लिए विशिष्ट वर्गों ~ 14 सुक्ष्ममापी मोटी हैं. एक अनुभाग काटने के बाद, एक खुर्दबीन स्लाइड कमरे के तापमान पर रखा धीरे धीरे कटौती अनुभाग स्लाइड आ अनुभाग, एकत्र का उपयोग करें. अनुभाग पिघल और खुर्दबीन स्लाइड स्थानांतरण होगा. 18 वर्गों के लिए एक स्लाइड पर स्थानांतरित किया जा सकता है.
- ठंडे तापमान, अधिमानतः -20 ° इमेजिंग से पहले सी, पर स्लाइड की दुकान. संकेत के नुकसान कम है जब 4 डिग्री सेल्सियस से कम एक सप्ताह के लिए रखा अधिकतम प्रतिदीप्ति संकेत के लिए, इमेजिंग अधिमानतः सेक्शनिंग के बाद तुरंत किया.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ऊर्ध्वाधर खमीर युक्त लाल और हरे रंग का टैग प्रतिस्पर्धी आबादी 6 समुदायों के वर्गों के प्रतिदीप्ति छवियों 3 चित्र में दिखाया जाता है. इन समुदायों के दो खमीर और अंतरिक्ष सहित साझा संसाधनों के लिए अपने प्रतियोगिता prototrophic उपभेदों के मिलकर बनता है, खानेदार 7 पैटर्न, के रूप में उनके ऊर्ध्वाधर वर्गों में प्रदर्शित करने के लिए होता है. एक एकल कोशिका से नीचे संकल्पों वर्गों में हल किया जा सकता है चित्रा 3. दोहराने (नीचे) और (ऊपर) मेथनॉल फिक्सिंग बिना प्राप्त चित्रा 1 में प्रोटोकॉल का पालन समुदायों के पार वर्गों की तुलना. फिक्सिंग बिना खमीर समुदायों cryosectioning लिए, प्रोटोकॉल 1.8 कदम से शुरू पीछा किया जाता है. प्रतिदीप्ति संकेत फिक्सिंग के बिना समुदाय के वर्गों में संरक्षित है, लेकिन समुदाय की अखंडता के साथ समझौता है. एक परिणाम के रूप में: (1) कुछ कोशिकाओं अनुभाग के किनारे के आसपास दूर तैरने लगते हैं, और (2) समग्र यीवृद्धावस्था (यानी, वर्गों के अंश सेक्शनिंग प्रक्रिया की कलाकृतियों के द्वारा परेशान नहीं) निश्चित समुदायों की तुलना में कम है.
चित्रा 4 प्रतिनिधि उज्ज्वल मैदान और प्रतिदीप्ति ऊर्ध्वाधर एक खमीर समुदाय के पार वर्गों से पता चलता है. समुदाय फार्म का एक मुकुट है कि अन्य उज्ज्वल मैदान और उज्जवल प्रतिदीप्ति में मजबूत बिखरने द्वारा विशेषता कोशिकाओं से अलग दिखाई देता है के शीर्ष पर कक्ष. इन नमूनों खमीर 4 कालोनियों में भेदभाव के पैटर्न के साथ संगत कर रहे हैं.
चित्रा 1 (बाएं) और फिक्सिंग (दाएं) के बिना खमीर समुदायों cryosectioning के लिए विशिष्ट प्रक्रिया का फ़्लोचार्ट.
चित्रा 2.
चित्रा 3. ऊर्ध्वाधर प्रतिनिधि के पार अनुभाग के प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति छवियोंखमीर समान शर्तों के तहत विकसित समुदायों licate (ऊपर) के बिना और मेथनॉल (नीचे) फिक्सिंग के साथ दिखाया. समुदाय के दो एस cerevisiae prototrophic उपभेदों mCherry और yEGFP फ्लोरोसेंट प्रोटीन 7 के साथ टैग के होते हैं. फिक्सिंग के बिना, कोशिकाओं को एक साथ बाध्य नहीं कर रहे हैं और दूर नाव या सेक्शनिंग दौरान को पुनर्व्यवस्थित. मेथनॉल फिक्सिंग समुदाय कोशिकाओं के साथ रहता है, लेकिन संकोचन का कारण बनता है के रूप में समुदाय हाइट्स (% औसत) के बीच अंतर में मनाया.
चित्रा 4 प्रतिनिधि उज्ज्वल मैदान (ऊपर) और ऊर्ध्वाधर एक खमीर समुदाय के पार अनुभाग के प्रतिदीप्ति छवियों (नीचे) दिखाए जाते हैं. समुदाय के दो एस cerevisiae prototrophic उपभेदों dsRed और YFP फ्लोरोसेंट 7 प्रोटीन के साथ टैग के होते हैं.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
यहाँ प्रस्तुत की प्रक्रिया खमीर समुदायों की आंतरिक संरचना का निरीक्षण करने के लिए एक रास्ता प्रदान करता है. मेथनॉल फिक्सिंग खमीर कॉलोनी 8 कठोर कदम बनाता है और कॉलोनी की अखंडता को बरकरार रखता है, लेकिन यह भी संकोचन 8 का कारण बनता है कि परिणामों की व्याख्या में खाते में लिया जाना चाहिए. हम आम तौर पर खमीर कालोनियों की ऊंचाई में लगभग 30% संकोचन कालोनियों की तुलना में सीधे 9 फिक्सिंग के बिना अक्टूबर में एम्बेडेड है, देखते हैं.
संकोचन से बचने के लिए, cryosectioning के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण सीधे एम्बेड अक्टूबर में समुदायों और उन्हें रोक है. प्रतिदीप्ति प्रत्यक्ष embedding पर आधारित पद्धति में संरक्षित है, लेकिन दोष यह है कि प्रत्येक अनुभाग के भीतर कोशिकाओं के साथ बाध्य नहीं हैं. नतीजतन, अनुभाग दूर नाव और वर्गों के किनारों पर कोशिकाओं के कुछ अधिक सेक्शनिंग प्रक्रिया में गड़बड़ी (4 चित्रा) ग्रस्त होने की संभावना हैं. हालांकि वह पर ध्यान केंद्रित नहींफिर से, खमीर समुदायों के वर्गों के उज्ज्वल क्षेत्र छवियों भी हमें नौ समुदाय के भीतर कोशिकाओं की स्थिति के बारे में उपयोगी जानकारी दे सकता है. चाहे या नहीं ब्याज की संपत्ति फिक्सिंग कदम से प्रभावित है एक मामले दर मामले के आधार पर जांच की जानी है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम उनके cryostat का उपयोग करने की अनुमति के लिए फ्रेड हचिंसन कैंसर रिसर्च सेंटर में जोनाथन कूपर लैब का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. यह काम NIH और WM उबकना फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया. बी.एम. लाइफ साइंस रिसर्च फाउंडेशन के एक गॉर्डन और बेट्टी मूर साथी है. हम हमारे साथ अपने फिक्सिंग प्रोटोकॉल साझा के लिए डैनियल Gottschling आभारी हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Methanol | J.T. Baker | 9070-01 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Andwin Scientific | 4583 | |
| Whatman Grade No. 541 Quantitative Filter Paper | Whatman | 1541-047 | |
| Millipore-MF Membrane Filter | Millipore | HAWP04700 | |
| Cryostat | Leica | CM 1510 S |
References
- Tolker-Nielsen, T., Molin, S. Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities. Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).
- Moller, S., et al. In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members. Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).
- Lepp, P. W., et al. Methanogenic Archaea and human periodontal disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).
- Váchová, L., et al. Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter. Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).
- Mináriková, L., et al. Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies. Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).
- Shou, W., et al. Synthetic cooperation in engineered yeast populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).
- Momeni, B., et al. Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities. , Submitted (2012).
- Kiernan, J. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice. ed, , 4th, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 4 (2008).
- Piccirillo, S., et al. The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies. Genetics. 184 (3), 707-716 (2010).
