Summary
Vi presenterar ett protokoll för frysning och cryosectioning jäst samhällen att observera inre mönster av fluorescerande celler. Metoden bygger på metanol fastställande av priser och oktober-inbäddning för att bevara den rumsliga fördelningen av celler utan att inaktivera fluorescerande proteiner i en gemenskap.
Abstract
Mikrober bor vanligtvis i samhällen. Den rumsliga organisation av celler i ett samhälle tros påverka överlevnad och funktion i samhället 1. Optiska sektioneringspunkter tekniker, inklusive konfokala och två-foton mikroskopi, har visat sig användbara för observation fysisk planering av bakterie-och archaeal gemenskapernas 2,3. En kombination av konfokal avbildning och fysisk sektionering av jästkolonier har avslöjat interna organisation celler 4. Dock har direkt optisk sektionering med konfokal eller två-foton mikroskopi bara kunnat nå några cellager djupt in jästkolonier. Denna begränsning är sannolikt på grund av en stark spridning av ljus från jästceller 4.
Här presenterar vi en metod som baseras på fastställande och cryosectioning få rumsliga fördelningen av fluorescerande celler i Saccharomyces cerevisiae samhällen. Vi använder metanol som fixativ medletatt bevara den rumsliga fördelningen av celler. Fasta samhällen infiltrerats med oktober förening, fryst och cryosectioned i en kryostat. Fluorescens avbildning av sektionerna visar den interna organisationen av fluorescerande celler i samhället.
Exempel på jäst samhällen bestående av stammar som uttrycker röda och gröna fluorescerande proteiner visar potentialerna hos cryosectioning metoden att avslöja den spatiala fördelningen av fluorescerande celler såväl som för genuttryck i jästkolonier 2,3. Även om vårt fokus har legat på Saccharomyces cerevisiae samhällen kan samma metod eventuellt användas för att undersöka andra mikrobiella samhällen.
Protocol
1. Fastställande Jäst gemenskaperna
- Väx jäst samhällen på ett membranfilter (t.ex. Millipore MF membranfilter, Figur 2A). Detta protokoll motsvarar en typisk gemenskap på mindre än 2x10 8 celler på en 6 mm diameter membranfilter.
- Använd en bit av Whatman 541 filterpapper för att täcka botten av en 1 cm diameter väl (Figur 2B). Detta Whatmanpapper kommer att användas som en bärare för att överföra samhället i senare skeden. Tillsätt 1 ml 100% metanol till brunnen, och lämna brunnen i -20 ° C för temperaturen att anta jämvikt.
- Sätt vätska N 2 i en Dewar. Frys gemenskap i flytande kväve genom att doppa gemenskapen under minst 15 sekunder i flytande N 2 med hjälp av en pincett (Figur 2C).
- Överför frysta samfundet att brunnen -20 ° C metanol (Figur 2D). Säkerställa att gemenskapen hålls horisontellt när dränka den i metanol.Vänta 20 minuter. MF membranfilter börjar sönderdelas i metanol.
- Överför gemenskap med bäraren Whatman 541 filterpapper från metanol väl till en kall Petriskål hölls vid -20 ° C för förångning metanol (figur 2E). Vid överföring, håll samhället ovanpå bärare Whatman filter och dra bort extra droppar metanol med en annan bit av tjockt Whatman papper innan i kylan petriskål. Detta kommer att säkerställa att avdunstningen är konsekvent från prov till prov.
- Vänta 4-6 timmar för indunstning till bäraren Whatman-filter ser torr. Otillräcklig avdunstning lämnar kvarvarande metanol som stör snittning. Över-torkning orsakar sprickor och deformation i samhällen.
- Ta provet från -20 ° C frys. Skär bort Whatman 541 filterpapper som inte omfattas av gemenskap.
- Gör en rektangulär kubisk aluminium-folie behållare som är tillräckligt stor så att provet har åtminstone ~ 2 mm marginal frånvarje sida (figur 2F). Placera community på bottenytan av aluminium-folie behållare, omedelbart täcka provet med oktober till 3 ~ 4 mm ovanför samhället höjd. Om viktig, kan orienteringen av provet justeras i detta steg med avseende på behållarens sidor. Vänta 10 minuter.
- Placera oktober-Embedded prov på en metallplatta på torris att frysa. Förvara frysta samhällen vid -20 ° C eller -80 ° C frys.
2. Sektionering Frysta gemenskapernas fluorescens avbildning
- Ställ in temperaturen på kryosnittet kammare till -25 ° C och låt proven i kammaren tills dess temperatur når temperaturen i kammaren.
- Montera provet på en kryo-fäste efter applicering en droppe oktober på fästet. Sprid oktober likformigt på den sida av provet med exponerade Whatman filterpapper (botten av behållaren), så att de senare tjocklek är 2-3 mm. Låt oktober frysa inuti kryostaten kammaren före sigctioning. Säkerställa en oktober marginal på 2-3 mm på alla sidor av provet bidrar till att bevara integriteten i sektioner.
- Sidorna av oktober provblocket kan användas för att rikta provet. Om provet inte är i linje med avseende på bladet, kommer sektionering startar från ett hörn eller sida av provet. Monteringen för att säkerställa att bladet skär en perfekt vertikal (eller horisontell) ytan av provblocket.
- Typiska sektioner för jäst samhällen är ~ 14 um tjock. Efter skärning en avsnittet använder ett mikroskopobjektglas som hölls vid rumstemperatur för att samla avsnittet, genom att långsamt närma sliden till den skurna sektionen. Avsnittet kommer att smälta och överföra till objektglas. Upp till 18 sektioner kan överföras till en bild.
- Förvara glasen vid låga temperaturer, företrädesvis -20 ° C, innan avbildning. Signalförlust är minimal när de hålls under en vecka vid 4 ° C. För maximal fluorescenssignal är avbildning helst görs omedelbart efter snittning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fluorescensbilder av vertikala tvärsnitt av jäst samhällen innehållande röd-och grön-märkta konkurrerande populationer 6 visas i figur 3. Dessa samhällen består av två prototrofa stammar av jäst och deras konkurrens om delade resurser, inklusive utrymme leder till kolumner mönster 7, som visas i deras vertikala tvärsnitt. Beslut ner till en enskild cell kan lösas på tvärsnitt. Jämför tvärsnitt av upprepade samfund erhållits med (botten) och utan (överst) metanol-fixering, efter protokollen i Figur 1 Figur 3. För cryosectioning jäst samhällen utan fixering är det protokoll som följer från steg 1,8. Fluorescenssignalen bevaras i samhället avsnitt utan att fastställa, men integritet samhället äventyras. Som ett resultat av: (1) en del celler flyta bort runt kanten av sektionen, och (2) den totala yiELD (dvs. andelen sektioner inte störs av artefakter i sektionering förfarandet) är lägre än fasta samhällen.
Figur 4 visar representativa ljus-fält och fluorescens vertikala tvärsnitt av en jäst gemenskap. Celler ovanpå samhället bildar en krona som visas skiljer sig från andra celler som kännetecknas av en starkare spridning i ljusa fält och ljusare fluorescens. Dessa mönster överensstämmer med rapporterade mönster av differentiering i jästkolonier 4.
Figur 1. Flödesschema av den typiska förfarandet för cryosectioning jäst samhällen med (vänster) och utan (höger) fastställande.
Figur 2.
Figur 3. Representativa fluorescensbilder av vertikalt tvärsnitt av replicate jäst samhällen som odlats under identiska förhållanden visas utan (överst) och med (nederst) metanol-fixering. Samhället består av två prototrofa stammar av S. cerevisiae med etiketten mCherry och yEGFP fluorescerande proteiner 7. Utan fastställande celler hopbundet och kan flyta bort eller ordna vid snittning. Metanol uppgjorda håller samhället celler tillsammans, men orsakar krympning som observerades i skillnaden mellan gemenskapens höjder (% i genomsnitt).
Figur 4. Representativa ljus-fält (överst) och fluorescens (botten) bilder av vertikalt tvärsnitt av en jäst gemenskap visas. Samhället består av två prototrofa stammar av S. cerevisiae med etiketten dsRed och YFP fluorescerande proteiner 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förfarandet som presenteras här erbjuder ett sätt att inspektera den inre strukturen av jäst samhällen. Metanol fixeringssteg gör jästkolonin stela 8 och bevarar integriteten av kolonin, men det orsakar också krympning 8 som bör beaktas vid tolkning av resultaten. Vi ser vanligtvis runt 30% krympning i höjd jästkolonier, jämfört med kolonier direkt inbäddade i oktober utan att fastställa 9.
För att undvika krympning, är ett alternativt tillvägagångssätt för cryosectioning att direkt bädda in samhällen i oktober och frysa dem. Fluorescens bevaras i metoden baserad på direkt inbäddning, men nackdelen är att cellerna i varje sektion inte binds samman. Som ett resultat, några av cellerna vid kanterna av sektionen flottören bort, och sektionerna är mer benägna att drabbas störningar i snittningen processen (figur 4). Även om det inte fokuserade på hanre kan ljus-fält bilder av tvärsnitt av jäst samhällen ger oss också värdefull information om tillståndet för celler i samhället 9. Huruvida egendom intresse påverkas av fixeringssteget måste undersökas från fall till fall.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi vill tacka Jonathan Cooper Lab vid Fred Hutchinson Cancer Research Center för tillstånd att använda deras kryostat. Detta arbete stöddes av NIH och WM Keck stiftelsen. BM är en Gordon och Betty Moore kamrat av Life Science Research Foundation. Vi är tacksamma för Daniel Gottschling för att dela hans fixering protokoll med oss.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Methanol | J.T. Baker | 9070-01 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Andwin Scientific | 4583 | |
| Whatman Grade No. 541 Quantitative Filter Paper | Whatman | 1541-047 | |
| Millipore-MF Membrane Filter | Millipore | HAWP04700 | |
| Cryostat | Leica | CM 1510 S |
References
- Tolker-Nielsen, T., Molin, S. Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities. Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).
- Moller, S., et al. In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members. Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).
- Lepp, P. W., et al. Methanogenic Archaea and human periodontal disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).
- Váchová, L., et al. Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter. Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).
- Mináriková, L., et al. Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies. Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).
- Shou, W., et al. Synthetic cooperation in engineered yeast populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).
- Momeni, B., et al. Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities. , Submitted (2012).
- Kiernan, J. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice. ed, , 4th, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 4 (2008).
- Piccirillo, S., et al. The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies. Genetics. 184 (3), 707-716 (2010).
