Summary
Vi præsenterer en protokol til frysning og cryosectioning gær samfund til at observere interne mønstre af fluorescerende celler. Metoden bygger på methanol-fixing og OLT-indlejring for at bevare den rumlige fordeling af celler uden at inaktivere fluorescerende proteiner inden for et fællesskab.
Abstract
Mikrober bor typisk i fællesskaber. Den rumlige organisation af celler i et samfund menes at påvirke overlevelse og funktion i samfundet 1. Optiske sektionering teknikker, herunder konfokal og to-foton mikroskopi, har vist sig nyttig til at observere rumlig organisering af bakterie-og archaeal fællesskaber 2,3. En kombination af konfokal billeddannelse og fysisk inddeling af gærkolonier har afsløret interne organisation af celler 4. Imidlertid har direkte optisk sektionering med konfokal eller to-foton mikroskopi kun været i stand til at nå et par cellelag dybt ind gærkolonier. Denne begrænsning er sandsynligvis på grund af stærk lysspredning fra gærceller 4.
Her præsenteres en metode baseret på fastsættelse og cryosectioning at opnå rumlige fordeling af fluorescerende celler i Saccharomyces cerevisiae samfund. Vi anvender methanol som fikseringsmiddel middelat bevare den rumlige fordeling af cellerne. Faste samfund er infiltreret med OCT-forbindelse, frosset og cryosectioned i en kryostat. Fluorescensimagografi af sektionerne afslører den interne organisation af fluorescerende celler i samfundet.
Eksempler på gær samfund bestående af stammer, der udtrykker røde og grønne fluorescerende proteiner viser potentialet ved cryosectioning fremgangsmåde til at afsløre den rumlige fordeling af fluorescerende celler og den for genekspression i gærkolonier 2,3. Selvom vores fokus har været på Saccharomyces cerevisiae samfund, kan den samme metode potentielt kan anvendes til at undersøge andre mikrobielle samfund.
Protocol
1. Fastsættelse Gær Fællesskaber
- Dyrke gær samfund på et membranfilter (fx Millipore MF membranfilter, figur 2A). Denne protokol svarer til en typisk samfund på mindre end 2x10 8 celler på en 6 mm diameter membranfilter.
- Bruge et stykke Whatman 541 filterpapir til at dække bunden af en 1 cm diameter godt (figur 2B). Denne Whatman papir vil blive brugt som en bærer til at overføre fællesskabet i senere faser. Der tilsættes 1 ml 100% methanol til brønden, og efterlade brønden i -20 ° C for temperaturen at ækvilibrere.
- Put flydende N2 i en Dewar. Frys samfund i flydende nitrogen ved at dyppe community for mindst 15 sekunder i flydende N 2 ved hjælp af en pincet (figur 2C).
- Overførsel frosne samfund til brønden i -20 ° C methanol (figur 2D). Sørg for, at fællesskabet holdes vandret, når nedsænke det i methanol.Vent 20 min. MF membranfilter begynder at desintegrere i methanol.
- Overfør fællesskab med bæreren Whatman 541 filterpapir fra methanol godt til en kold petriskål holdt ved -20 ° C i methanol fordampning (fig. 2E). Ved overførsel, holde fællesskabet på toppen af luftfartsselskabet Whatman filter og trække væk ekstra dråber methanol ved hjælp af et andet stykke tykt Whatman papir, før du lægger i det kolde petriskål. Dette vil sikre, at fordampningstiden er konsistent fra prøve til prøve.
- Vent 4-6 timer for fordampning, indtil luftfartsselskabet Whatman filter ser tørt. Utilstrækkelig fordampning efterlader resterende methanol som forstyrrer skæring. Over-tørring årsager revner og deformationer i fællesskaber.
- Tag prøven ud af -20 ° C fryser. Skær væk Whatman 541 filterpapir ikke er omfattet af fællesskabet.
- Foretage en rektangulær kubisk aluminium-folie beholder, der er stor nok til, at prøven har mindst ~ 2 mm margin frahver side (fig. 2F). Placer samfund på bundfladen af aluminium-folie beholder straks dække prøven med OLT 3 ~ 4 mm over fællesskabet højde. Hvis vigtig, kan orienteringen af prøven justeres i dette trin med hensyn til beholderens sider. Vent 10 min.
- Placer OLT-indlejrede prøve på en metalplade på tøris til at fryse. Opbevar de frosne samfund på -20 ° C eller -80 ° C fryser.
2. Sektionering Frosne Fællesskaber for Fluorescence Imaging
- Indstil temperaturen af kryosektionen kammer til -25 ° C og henstår prøverne i kammeret, indtil dens temperatur når temperaturen i kammeret.
- Monter prøven på en cryo-mount efter anvendelse en dråbe OLT på bjerget. Spred oktober ensartet på den side af prøven med eksponeret Whatman filtrerpapir (bunden af beholderen), så oktober tykkelse er 2-3 mm. Lad oktober fryse inde i kryostatkammeret før sectioning. Sikring af et OLT-margin på 2-3 mm på alle sider af prøven er med til at bevare integriteten af sektioner.
- Siderne af oktober prøveblokken kan anvendes til at bringe prøven. Hvis prøven ikke er på linie i forhold til bladet, vil skæring starte fra et hjørne eller side af prøven. Juster mount at sikre, at kniven skærer en fuldstændig lodret (eller horisontalt) flade af prøveblokken.
- Typiske sektioner for gær samfund er ~ 14 um tyk. Efter skæring af en sektion, anvende et objektglas opbevares ved stuetemperatur til opsamling af sektionen, ved langsomt nærmer slæden til snitfelt. Sektionen vil smelte og overføres til objektglas. Op til 18 sektioner kan overføres til et objektglas.
- Opbevar dias ved kolde temperaturer, fortrinsvis -20 ° C, før billeddannelse. Signaltab er minimal, når det opbevares i en uge ved 4 ° C. For maksimal fluorescenssignal, er billeddiagnostik fortrinsvis ske umiddelbart efter sektionering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fluorescensbilleder af vertikale tværsnit af gær communities indeholdende rød-og grøn-mærkede konkurrerende populationer 6 er vist i figur 3.. Disse samfund består af to prototrofe stammer af gær og deres konkurrence om delte ressourcer, herunder rum, fører til søjleformet mønstre 7, som vises i deres vertikale tværsnit. Opløsninger ned til en enkelt celle kan løses i tværsnit. Figur 3 sammenligner tværsnit af gentagne samfund opnået med (bund) og uden (top) methanol-fixing, efter protokollerne i fig. 1. For cryosectioning gær samfund uden fastsættelse er protokollen følges fra trin 1,8. Fluorescenssignalet er bevaret i lokalsamfundet sektioner uden fastsættelse, men integriteten af fællesskabet er kompromitteret. Som følge: (1) nogle celler flyde væk omkring kanten af afsnittet, og (2) det samlede yiELD (dvs. fraktion af sektioner ikke forstyrres af artefakter for sektionering procedure) er lavere i forhold til faste fællesskaber.
Figur 4 viser repræsentative lys-felt og fluorescens vertikale tværsnit af en gær community. Celler på toppen af samfundet danner en krone, der vises adskiller sig fra andre celler kendetegnet ved en stærkere spredning i lyse-field og lysere fluorescens. Disse mønstre er konsistent med rapporterede mønstre af differentiering i gærkolonier 4.
Figur 1. Flowchart af det typiske forløb for cryosectioning gær samfund med (venstre) og uden (til højre) fastsættelse.
Figur 2.
Figur 3. Repræsentative fluorescensbilleder af lodret tværsnit af replicate gær samfund dyrket under identiske betingelser er vist uden (øverst) og med (bund) methanol-fixing. Samfundet består af to prototrofe stammer af S. cerevisiae markeret med mCherry og yEGFP fluorescerende protein 7. Uden fastsættelse celler ikke bundet sammen, og kan flyde væk eller omarrangere under skæring. Methanol-fixing holder community celler sammen, men forårsager krympning som observeret i forskellen mellem fællesskabet højder (% i gennemsnit).
Figur 4. Repræsentant lys-felt (øverst) og fluorescens-(bund) billeder af lodret tværsnit af en gær samfund er vist. Samfundet består af to prototrofe stammer af S. cerevisiae markeret med dsRed og YFP fluorescerende proteiner 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den procedure, der præsenteres her giver en måde at inspicere den interne struktur i gær samfund. The methanol fastsættelse trin gør gær koloni stift 8 og bevarer integriteten af kolonien, men det medfører også krympning 8, der bør tages i betragtning ved fortolkningen af resultaterne. Vi typisk ser omkring 30% krympning i højden af gærkolonier, sammenlignet med kolonier direkte indlejret i OLT uden fastsættelse af 9.
For at undgå svind, en alternativ fremgangsmåde for cryosectioning er at direkte integrere de forskellige befolkningsgrupper i OLT og fryse dem. Fluorescens er bevaret i fremgangsmåden baseret på direkte forankring, men ulempen er, at cellerne i hver sektion ikke er bundet sammen. Som følge heraf er nogle af cellerne ved kanterne af afsnittet flyde væk, og sektionerne mere tilbøjelige til at lide under forstyrrelser i skæreprocessen (figur 4). Selvom det ikke er fokuseret på hanre, kan lyse-field billeder af tværsnit af gær samfund også give os nyttige oplysninger om tilstanden af celler i samfundet 9. Hvorvidt egenskaben af interesse påvirkes af fastsættelse skridt skal undersøges fra sag til sag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Jonathan Cooper Lab på Fred Hutchinson Cancer Research Center for tilladelse til at bruge deres kryostat. Dette arbejde blev støttet af NIH og WM Keck Foundation. BM er en Gordon og Betty Moore stipendiat of Life Science Research Foundation. Vi er taknemmelige for Daniel Gottschling for at dele sine fastsættelse protokol med os.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Methanol | J.T. Baker | 9070-01 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Andwin Scientific | 4583 | |
| Whatman Grade No. 541 Quantitative Filter Paper | Whatman | 1541-047 | |
| Millipore-MF Membrane Filter | Millipore | HAWP04700 | |
| Cryostat | Leica | CM 1510 S |
References
- Tolker-Nielsen, T., Molin, S. Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities. Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).
- Moller, S., et al. In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members. Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).
- Lepp, P. W., et al. Methanogenic Archaea and human periodontal disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).
- Váchová, L., et al. Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter. Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).
- Mináriková, L., et al. Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies. Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).
- Shou, W., et al. Synthetic cooperation in engineered yeast populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).
- Momeni, B., et al. Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities. , Submitted (2012).
- Kiernan, J. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice. ed, , 4th, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 4 (2008).
- Piccirillo, S., et al. The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies. Genetics. 184 (3), 707-716 (2010).
