Summary
אנו מציגים פרוטוקול להקפאה וcryosectioning קהילות שמרים להתבונן דפוסים הפנימיים של תאי ניאון. השיטה מסתמכת על מתנול, תיקון ואוקטובר הטבעה-לשמר את הפיזור המרחבי של תאים ללא inactivating חלבוני ניאון בתוך קהילה.
Abstract
חיידקים בדרך כלל לגור ביישובים. הארגון המרחבי של תאים בתוך קהילה הוא האמין כדי להשפיע על ההישרדות והתפקוד של הקהילה 1. שיטות אופטיות, כולל חתך מיקרוסקופיה confocal ושני פוטונים, הוכיחו שימושיות להתבוננות ארגון המרחבי של קהילות חיידקים וarchaeal 2,3. שילוב של הדמית confocal וחתך פיזי של מושבות שמרים חשף ארגון הפנימי של תאים 4. עם זאת, חתך אופטי ישיר באמצעות מיקרוסקופיה confocal או שני פוטונים הצליח רק להגיע לכמה שכבות תאים עמוקים לתוך מושבות שמרים. מגבלה זו עשויה בגלל פיזור אור חזק מתאי שמרים 4.
כאן, אנו מציגים שיטה המבוססת על התיקון וcryosectioning להשיג פיזור המרחבי של תאי ניאון בתוך קהילות cerevisiae Saccharomyces. אנו משתמשים במתנול כסוכן מקבעכדי לשמר את הפריסה המרחבית של תאים. קהילות קבועות הם הסתננו עם מתחם אוקטובר, קפוא, וcryosectioned בcryostat. דימות פלואורסצנטי מהסעיפים חושפת את הארגון הפנימי של תאי ניאון בקהילה.
דוגמאות לקהילות שמרים הכוללות זנים המבטאים חלבוני ניאון אדומים וירוקים מדגימות את הפוטנציאל של שיטת cryosectioning כדי לחשוף את הפיזור המרחבי של תאי ניאון כמו גם זה של ביטוי גנים במושבות שמרים 2,3. למרות ההתמקדות שלנו הייתה בקהילות cerevisiae Saccharomyces, באותה השיטה יכולה באופן פוטנציאלי להיות מיושמת לבחון קהילות חיידקים אחרות.
Protocol
1. תיקון קהילות שמרים
- לגדול קהילות שמרים על קרום מסנן (למשל, Millipore MF קרום מסנן; 2A איור). פרוטוקול זה מתאים לקהילה טיפוסית של פחות מ 2x10 8 תאים במסנן 6 מ"מ בקוטר הממברנה.
- השתמש בפיסת נייר סינון Whatman 541 כדי לכסות את תחתית סנטימטר בקוטר 1 היטב (איור 2 ב '). נייר Whatman זה ישמש כנישא להעברת הקהילה בשלבים מאוחר יותר. הוסף 1 המ"ל מתנול 100% לטובים, ולהשאיר גם ב-20 ° C לטמפרטורה לאזן.
- שים נוזל N 2 בדיואר. הקפא קהילה בחנקן נוזלי על ידי טבילת הקהילה במשך לפחות 15 שניות בנוזל N 2 באמצעות פינצטה (האיור 2C).
- להעביר את הקהילה קפוא לטוב של מתנול -20 מעלות צלזיוס (האיור 2D). להבטיח שהקהילה נשמרת אופקי כאשר השקיע אותה במתנול.חכה 20 דקות. MF קרום המסנן מתחיל להתפורר במתנול.
- להעביר את הקהילה באמצעות מוביל נייר סינון Whatman 541 ממתנול גם לצלחת פטרי קרה כל זמן ב -20 ° C לאידוי מתנול (2E איור). בעת ההעברה, לשמור על הקהילה על גבי מנשא Whatman מסנן ולהתרחק טיפין נוספות של מתנול באמצעות פיסת נייר אחר Whatman עבה לפני לשים בצלחת פטרי הקרה. זה יבטיח כי זמן האידוי הוא עקבי ממדגם למדגם.
- חכה 4-6 שעות עד לאידוי מנשא Whatman המסנן נראה יבש. האידוי משאיר מספיק מתנול שיורים אשר מפריע לחתך. במהלך ייבוש סדקים ועיוות גורמת בקהילות.
- קח דוגמה מ-20 ° C במקפיא. לחתוך נייר סינון Whatman 541 אינן מכוסה על ידי קהילה.
- הפוך מכל מעוקב מלבני אלומיניום רדיד שהוא גדול מספיק כך שהמדגם יש לפחות ~ שולי מ"מ 2 מכל צד (האיור 2F). הנח את הקהילה על המשטח התחתון של מכל אלומיניום הרדיד; לכסות את המדגם עם אוקטובר עד 3 ~ 4 מ"מ מעל גובה הקהילה באופן מיידי. אם חשוב, הנטייה של המדגם יכולה להיות מותאמת בשלב זה בכל הנוגע לצדדים של המכל. חכה 10 דקות.
- הנח את דוגמא אוקטובר-מוטבע על צלחת מתכתית בקרח יבש להקפאה. אחסן את הקהילות קפואות ב -20 ° C או C ° מקפיא -80.
2. קטגוריות קיימים קהילות קפואות לדימות פלואורסצנטי
- הגדר את הטמפרטורה של חדר cryosection ל-25 ° C ולהשאיר את הדגימות בחדר עד שהטמפרטורה שלו מגיעה לטמפרטורה של החדר.
- הר המדגם על cryo-Mount לאחר החלת ירידה של אוקטובר בהר. מורח אוקטובר אחיד בצד של מדגם בנייר נחשף Whatman מסנן (חלק תחתון של המכל) כך שעובי אוקטובר הוא 2-3 מ"מ. בואו הקפאת אוקטובר בתוך חדר cryostat לפני sectioning. הבטחת רווחיות אוקטובר של 2-3 מ"מ על כל הצדדים של המדגם עוזרת לשמור על שלמות חלקים.
- הדפנות של בלוק מדגם אוקטובר ניתן להשתמש כדי ליישר את המדגם. אם המדגם אינו מיושר ביחס ללהב, חתך יתחיל מפינה או בצד של המדגם. התאם את ההר כדי להבטיח שהלהב חותך להפליא את פנים אנכיות (או אופקי) של גוש המדגם.
- חלקים אופייניים עבור קהילות שמרים הם ~ 14 מיקרומטר בעובי. לאחר חיתוך מקטע, להשתמש שקופית מיקרוסקופ נשמר בטמפרטורת חדר כדי לאסוף את הסעיף, על ידי התקרבות לשקופית לאט לסעיף הקיצוץ. הסעיף יתמוסס ולהעביר לשקופית מיקרוסקופ. עד 18 סעיפים ניתן להעביר על גבי שקופית אחת.
- אחסן את השקופיות בטמפרטורות קרות, רצוי -20 ° C, לפני ההדמיה. אובדן האות הוא מינימאלי כאשר שמרו במשך שבוע אחד ב 4 ° C. לאות פלואורסצנציה מרבית, הדמיה נעשתה רצוי מייד לאחר החתך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תמונות פלואורסצנציה של חתכים אנכיים של קהילות שמרים המכילות אוכלוסיות לאדומות וירוק מתויגות תחרותיות 6 מוצגות באיור 3. קהילות אלה מורכבות משני זני prototrophic של שמרים והתחרות שלהם למשאבים משותפים, כולל שטח, מובילות לעמודי 7 דפוסים, כפי שהיא מוצגות בחתכים האנכיים שלהם. החלטות עד לתא בודד ניתן לפתור בחתכים. איור 3 משווה חתכי רוחב של קהילות לשכפל הושגו עם (תחתון) וללא מתנול-קיבוע (למעלה), בעקבות הפרוטוקולים באיור 1. לcryosectioning קהילות שמרים בלי תיקון, הפרוטוקול ואחריו החל מהצעד 1.8. אות פלואורסצנציה נשמרה בסעיפים קהילתיים ללא תיקון, אך היושרה של הקהילה נמצאת בסיכון. כתוצאה מכך: (1) כמה תאים לצוף משם מסביב לקצו של הסעיף, ו( 2) יי הכלליישן (כלומר, חלק קטן של קטעים שלא הוטרד מן הממצאים של הליך החתך) נמוך בהשוואה ליישובים קבועים.
איור 4 מראה חתכים מייצגים בהיר שדה ופלואורסצנטי אנכיים של קהילת שמרים. תאים בחלק העליון של טופס קהילת כתר שמופיע נבדלים מתאים אחרים המאופיינים בפיזור חזק יותר באור ניאון בוהק שדה ובהיר. דפוסים אלה עולים בקנה אחד עם דפוסים מדווחים של בידול במושבות שמרים 4.
איור 1. תרשים זרימה של ההליך הטיפוסי לcryosectioning קהילות שמרים עם (משמאל) וללא תיקון (מימין).
איור 2.
איור 3. תמונות פלואורסצנציה יציגות של חתך האנכי של נציגlicate קהילות שמרים גודלו בתנאים זהים מוצגים ללא (למעלה) ועם מתנול-תיקון (למטה). הקהילה מורכבת משני זנים של prototrophic cerevisiae ס מתויגים עם חלבוני yEGFP ניאון mCherry ו7. ללא תיקון, תאים אינם כרוכים יחד ויכולים לצוף משם או לארגן מחדש במהלך החתך. מתנול-קיבוע שומר תאים קהילתיים ביחד, אבל גורם להתכווצות כפי שנצפה בהבדל בין קהילת גבהים (ממוצע%).
איור 4. נציג תמונות פלואורסצנציה (תחתון) של חתך האנכי של קהילת שמרים בהירי שדה (למעלה) ומוצגים. הקהילה מורכבת משני זנים של prototrophic cerevisiae ס מתויגים עם חלבונים וdsRed YFP ניאון 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההליך שהוצג כאן מציע דרך כדי להתבונן במבנה הפנימי של קהילות שמרים. צעד קיבוע מתנול הופך את מושבת השמרים נוקשה 8 ושומר על שלמותה של המושבה, ואולם, הוא גם גורם להתכווצות 8 שצריכים להילקח בחשבון בלפרש את התוצאות. אנחנו בדרך כלל רואים סביב 30% התכווצות בגובה של מושבות שמרים, בהשוואה למושבות משובצות ישירות באוקטובר ללא תיקון 9.
כדי למנוע התכווצות, גישה חלופית לcryosectioning היא ישירות להטביע הקהילות באוקטובר ולהקפיא אותם. פלואורסצנטי נשמר בשיטה המבוססת על הטבעה ישירה, אבל החסרון הוא שהתאים בתוך כל מקטע אינם כרוכים יחד. כתוצאה מכך, חלק מהתאים בשולי הסעיף לצוף משם, ושהקטעים שנוטים יותר לסבול הפרעות בתהליך החתך (איור 4). למרות שלא התמקדו במחדש, תמונות בהירות שדה של חתכים של קהילות שמרים יכולים גם לתת לנו מידע שימושי על המצב של תאים בתוך הקהילה 9. בין אם רכושו של עניין מושפע מצעד התיקון יש לבחון על בסיס מקרה לפי מקרה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
אנו רוצים להודות ליונתן קופר מעבדה בפרד האצ'ינסון לחקר הסרטן לרשות להשתמש cryostat. עבודה זו נתמכה על ידי NIH וקק WM קרן. BM הוא עמית גורדון ובטי מור של קרן לחקר מדעי חיים. אנו מודים לדניאל Gottschling הפרוטוקול לשיתוף קיבועו איתנו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Methanol | J.T. Baker | 9070-01 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Andwin Scientific | 4583 | |
| Whatman Grade No. 541 Quantitative Filter Paper | Whatman | 1541-047 | |
| Millipore-MF Membrane Filter | Millipore | HAWP04700 | |
| Cryostat | Leica | CM 1510 S |
References
- Tolker-Nielsen, T., Molin, S. Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities. Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).
- Moller, S., et al. In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members. Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).
- Lepp, P. W., et al. Methanogenic Archaea and human periodontal disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).
- Váchová, L., et al. Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter. Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).
- Mináriková, L., et al. Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies. Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).
- Shou, W., et al. Synthetic cooperation in engineered yeast populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).
- Momeni, B., et al. Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities. , Submitted (2012).
- Kiernan, J. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice. ed, , 4th, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 4 (2008).
- Piccirillo, S., et al. The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies. Genetics. 184 (3), 707-716 (2010).
