Summary
We presenteren een protocol voor het invriezen en cryosectioning gist gemeenschappen om interne patronen van fluorescerende cellen te observeren. De methode is gebaseerd op methanol-fixing en OCT-inbedding van de ruimtelijke verdeling van cellen te behouden zonder het inactiveren van fluorescerende eiwitten binnen een gemeenschap.
Abstract
Microben typisch leven in gemeenschappen. De ruimtelijke organisatie van cellen in een gemeenschap wordt verondersteld om de overleving en functie van de gemeenschap 1 beïnvloeden. Optische sectie technieken, met inbegrip van confocale en twee-foton microscopie, nuttig zijn gebleken voor het observeren van ruimtelijke organisatie van bacterien en archaea gemeenschappen 2,3. Een combinatie van confocale beeldvorming en fysische snijden van gistkolonies blijkt interne organisatie van cellen 4. Heeft echter directe optische sectie met behulp van confocale of twee-foton microscopie geweest alleen in staat om een paar cellagen diep in gist kolonies te bereiken. Deze beperking is waarschijnlijk vanwege sterke lichtverstrooiing uit gistcellen 4.
Hier presenteren we een methode op basis van de vaststelling en cryosectioning tot ruimtelijke verdeling van fluorescerende cellen te verkrijgen in Saccharomyces cerevisiae gemeenschappen. We gebruiken methanol als fixeermiddel agensde ruimtelijke verdeling van cellen behouden. Vaste gemeenschappen worden geïnfiltreerd met OCT verbinding, bevroren, en cryosectioned in een cryostaat. Fluorescentie beeldvorming van de secties onthult de interne organisatie van fluorescerende cellen binnen de gemeenschap.
Voorbeelden van gist gemeenschappen bestaande uit stammen die rood en groen fluorescerende eiwitten vertonen de potentialen van de cryosectioning methode om de ruimtelijke verdeling van fluorescerende cellen onthullen evenals die van genexpressie in gistkolonies 2,3. Hoewel onze nadruk lag op Saccharomyces cerevisiae Gemeenschappen kan dezelfde werkwijze mogelijk worden toegepast op andere microbiële onderzoeken.
Protocol
1. Bevestiging Gist Gemeenschappen
- Gist gemeenschappen groeien op een membraanfilter (bijvoorbeeld Millipore MF membraanfilter; Figuur 2A). Dit komt overeen met een typische gemeenschap van minder dan 2x10 8 cellen op een 6 mm diameter membraanfilter.
- Gebruik een stuk Whatman 541 filtreerpapier op de bodem van een 1 cm diameter en (Figuur 2B) omvat. Dit Whatman papier gebruikt als drager om de gemeenschap dragen in latere stadia. Voeg 1 ml 100% methanol naar de put, en laat de put -20 ° C voor de temperatuur in evenwicht.
- Zet vloeibare N2 in een Dewar. Bevriezen in vloeibare stikstof door door dompelen de gemeenschap minstens 15 sec in vloeibare N2 met een pincet (Figuur 2C).
- Overdracht bevroren gemeenschap om de put van -20 ° C methanol (figuur 2D). Zorg ervoor dat de gemeenschap horizontaal gehouden wordt wanneer het onder te dompelen in de methanol.Wacht 20 minuten. De MF membraanfilter begint te desintegreren in methanol.
- Overdragen door op de drager 541 Whatman filtreerpapier van methanol en een koude petrischaal bewaard bij -20 ° C methanol verdamping (figuur 2E). Bij het overbrengen van, houden de gemeenschap op de top van drager Whatman filter en weg te trekken extra druppels methanol met behulp van een ander stuk van dik Whatman papier voordat u in de kou petrischaal. Dit zal ervoor zorgen dat de verdamping is consistent van monster tot monster.
- Wacht 4 tot 6 uur voor verdamping, voordat de drager Whatman filter ziet er droog. Onvoldoende verdamping laat resterende methanol die interfereert met het snijden. Over-drogen oorzaken scheuren en vervorming in gemeenschappen.
- Neem het monster uit van -20 ° C vriezer. Knip Whatman 541 filtreerpapier niet onder gemeenschap.
- Een rechthoekige kubieke aluminium folie container die groot genoeg zodat het monster ten minste 2 mm ~ marge van heeftweerskanten (figuur 2F). Plaats de gemeenschap op de bodem van de aluminium-folie verpakking en onmiddellijk wordt het monster bedekt met OCT tot 3 ~ 4 mm boven de gemeenschap hoogte. Als belangrijk kan de oriëntatie van het monster worden ingesteld in deze stap met betrekking tot de zijkanten van de container. Wacht 10 minuten.
- Plaats de LGO-embedded monster op een metalen plaat op droog ijs te bevriezen. Bewaar de ingevroren gemeenschappen bij -20 ° C of -80 ° C vriezer.
2. Snijden Bevroren Gemeenschappen voor Fluorescence Imaging
- De temperatuur van cryosection kamer tot -25 ° C en laat de monsters in de kamer totdat de temperatuur de temperatuur van de kamer.
- Monteer het monster op een cryo-mount na het aanbrengen van een druppel van de LGO op de berg. Uniform verdeeld oktober aan de kant van het monster met blootgestelde Whatman filtreerpapier (bodem van de container) zodat oktober dikte 2-3 mm. Laat oktober bevriezen in de cryostaatkamer voordat sectioning. Zorgen voor een LGO marge van 2-3 mm aan alle zijden van het monster bijdraagt tot het behoud van de integriteit van secties.
- De zijkanten van de LGO monsterblok kan worden gebruikt om het monster te lijnen. Als het monster niet uitgelijnd ten opzichte van het mes zal snijden starten vanuit een hoek of zijkant van het monster. Stel de constructie te verzekeren dat het blad een perfect verticale (of horizontale) vlak van het monsterblok snijdt.
- Typische profielen voor gist gemeenschappen ~ 14 micrometer dikke. Na het snijden een gedeelte met een microscoop bij kamertemperatuur bewaard het gedeelte verzamelen door langzaam naderen de schuif de doorsnede. De sectie zal smelten en over te dragen aan de microscoop dia. Er kunnen maximaal 18 secties kunnen overgedragen worden op een dia.
- Sla de slides bij lage temperaturen, bij voorkeur -20 ° C, voor imaging. Signaalverlies minimaal wanneer gedurende een week bij 4 ° C. Voor een maximale fluorescentie-signaal, wordt beeldvorming bij voorkeur direct gedaan na het snijden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fluorescentiebeelden verticale dwarsdoorsneden van gist gemeenschappen die rood en groen gelabeld concurrerende populaties 6 worden weergegeven in figuur 3. Deze gemeenschappen bestaan uit twee prototrofe stammen van gist en hun concurrentie voor gedeelde bronnen, waaronder ruimte tot zuilvormige patronen 7, zoals weergegeven in de verticale doorsneden. Resoluties tot een cel kunnen worden opgelost in dwarsdoorsneden. Figuur 3 vergelijkt dwarsdoorsneden van herhaalde gemeenschappen verkregen met (onder) en zonder (top) methanol-bevestiging na de protocollen in figuur 1. Voor cryosectioning gist gemeenschappen zonder bevestiging, wordt het protocol gevolgd vanaf stap 1.8. De fluorescentie-signaal wordt bewaard in de gemeenschap secties zonder vaststelling, maar de integriteit van de gemeenschap in het gedrang komt. Dientengevolge: (1) een aantal cellen wegdrijven rond de rand van het profiel, en (2) de totale yield (dat wil zeggen, fractie van secties niet verstoord door artefacten van het snijden procedure) is lager in vergelijking met vaste gemeenschappen.
Figuur 4 toont representatieve bright-field en fluorescentie verticale doorsneden van een gist gemeenschap. Cellen bovenop de gemeenschap vormen een kroon die wordt weergegeven onderscheidt van andere cellen gekenmerkt worden door sterkere verstrooiing in bright-field en helderder fluorescentie. Deze patronen zijn consistent met gerapporteerde patronen van differentiatie in gistkolonies 4.
Figuur 1. Stroomschema van de standaardprocedure voor het cryosectioning gist gemeenschappen met (links) en zonder (rechts) bevestiging.
Figuur 2.
Figuur 3. Representatieve fluorescentiebeelden verticale doorsnede van repvoud gist gemeenschappen gekweekt onder identieke omstandigheden worden getoond zonder (boven) en met (onder) methanol-bevestiging. De gemeenschap bestaat uit twee prototrofe stammen van S. cerevisiae getagd met mCherry en yEGFP fluorescerende eiwitten 7. Zonder bevestiging worden de cellen niet met elkaar verbonden en kunnen wegdrijven of herschikken tijdens het snijden. Methanol-fixing houdt gemeenschap cellen samen, maar veroorzaakt krimp zoals waargenomen in het verschil tussen gemeenschap hoogtes (% gemiddeld).
Figuur 4. Representatieve bright-field (boven) en fluorescentie (onder) beelden verticale doorsnede van een gist gemeenschap getoond. De gemeenschap bestaat uit twee prototrofe stammen van S. cerevisiae getagd met DsRed en YFP fluorescerende eiwitten 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De procedure hier gepresenteerde biedt een manier om de interne structuur van gist gemeenschappen te inspecteren. De methanol fixeerstap maakt de gistkolonie starre 8 en bewaart de integriteit van de kolonie, maar veroorzaakt ook krimp 8 die moet worden gehouden bij het interpreteren van de resultaten. We meestal zien rond de 30% krimp in de hoogte van gist kolonies, in vergelijking met kolonies rechtstreeks ingebed in OCT zonder bevestiging 9.
Om te voorkomen dat krimp, een alternatieve benadering voor cryosectioning is om direct insluiten van de gemeenschappen in LGO en ze bevriezen. Fluorescentie wordt bewaard in de methode gebaseerd op direct inbedding, maar het nadeel is dat de cellen in elke sectie niet met elkaar verbonden. Dientengevolge sommige cellen aan de randen van de sectie float weg en de secties vaker verstoringen in het snijden (figuur 4) lijden. Hoewel niet gericht op dat hijre, kan bright-field afbeeldingen van dwarsdoorsneden van gist gemeenschappen geven ons ook nuttige informatie over de toestand van de cellen binnen de gemeenschap 9. Of het eigendom van belang wordt beïnvloed door de vaststelling stap moet worden onderzocht op een case-by-case basis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij willen Jonathan Cooper Lab bij Fred Hutchinson Cancer Research Center bedanken voor de toestemming om hun cryostaat te gebruiken. Dit werk werd ondersteund door NIH en de WM Keck Foundation. BM is een Gordon en Betty Moore fellow van Life Science Research Foundation. We zijn dankbaar voor Daniel Gottschling voor het delen van zijn bevestiging protocol met ons op.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Methanol | J.T. Baker | 9070-01 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Andwin Scientific | 4583 | |
| Whatman Grade No. 541 Quantitative Filter Paper | Whatman | 1541-047 | |
| Millipore-MF Membrane Filter | Millipore | HAWP04700 | |
| Cryostat | Leica | CM 1510 S |
References
- Tolker-Nielsen, T., Molin, S. Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities. Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).
- Moller, S., et al. In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members. Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).
- Lepp, P. W., et al. Methanogenic Archaea and human periodontal disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).
- Váchová, L., et al. Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter. Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).
- Mináriková, L., et al. Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies. Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).
- Shou, W., et al. Synthetic cooperation in engineered yeast populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).
- Momeni, B., et al. Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities. , Submitted (2012).
- Kiernan, J. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice. ed, , 4th, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 4 (2008).
- Piccirillo, S., et al. The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies. Genetics. 184 (3), 707-716 (2010).
