Summary
Nous présentons un protocole de congélation et de découpe au cryostat communautés de levure pour observer les modèles internes de cellules fluorescentes. La méthode repose sur la fixation et le méthanol octobre-enrobage à préserver la répartition spatiale des cellules sans inactivation des protéines fluorescentes dans une communauté.
Abstract
Les microbes vivent généralement dans les communautés. L'organisation spatiale des cellules à l'intérieur d'une communauté est censé avoir un impact sur la survie et la fonction de la communauté 1. Techniques optiques de sectionnement, y compris la microscopie confocale et biphotonique, se sont avérées utiles pour observer l'organisation spatiale des communautés bactériennes et Archaea 2,3. Une combinaison de la microscopie confocale et sectionnement physique de colonies de levures a révélé organisation interne des cellules 4. Cependant, directe sectionnement optique en utilisant la microscopie confocale ou à deux photons a été seulement en mesure d'atteindre quelques couches cellulaires profondes dans les colonies de levures. Cette limitation est probablement en raison de forte diffusion de la lumière à partir de 4 cellules de levure.
Ici, nous présentons une méthode basée sur la fixation et découpe au cryostat à obtenir la distribution spatiale des cellules fluorescentes au sein des communautés de Saccharomyces cerevisiae. Nous utilisons le méthanol comme agent fixateurà préserver la répartition spatiale des cellules. Communautés fixes sont infiltrés par composé OCT, congelés et cryosectioned dans un cryostat. L'imagerie par fluorescence des sections révèle l'organisation interne des cellules fluorescentes sein de la communauté.
Des exemples de communautés de levures consistant en souches exprimant rouges et verts protéines fluorescentes en évidence les potentialités du procédé découpe au cryostat pour révéler la distribution spatiale des cellules fluorescentes ainsi que celui de l'expression des gènes dans les colonies de levure 2,3. Même si notre accent a été mis sur les communautés de Saccharomyces cerevisiae, la même méthode peut potentiellement être utilisée pour examiner les autres communautés microbiennes.
Protocol
1. Fixation Communautés de levure
- Cultiver les communautés de levure sur une membrane (par exemple, filtre à membrane Millipore MF; figure 2A) de filtre. Ce protocole correspond à une communauté typique de moins de 2x10 8 cellules sur un filtre à membrane 6 mm de diamètre.
- Utilisez un morceau de papier filtre Whatman 541 pour couvrir le fond d'un 1 cm de diamètre ainsi (figure 2B). Ce papier Whatman sera utilisé comme support pour transférer de la communauté dans les étapes ultérieures. Ajouter 1 ml de méthanol à 100% pour le bien, et laisser le puits dans -20 ° C pour la température de s'équilibrer.
- Mettre N 2 liquide dans un vase de Dewar. Geler la communauté dans l'azote liquide par immersion de la communauté pendant au moins 15 secondes dans de l'azote liquide 2 en utilisant une pince à épiler (figure 2C).
- Transfert communauté congelé pour le bien de -20 ° C méthanol (figure 2D). Assurez-vous que la communauté est maintenu à l'horizontale lorsque l'immerger dans le méthanol.Attendre 20 min. Le MF filtre à membrane commence à se désintégrer dans le méthanol.
- Transfert communauté en utilisant le support papier filtre Whatman 541 du méthanol et d'un plat froid de Pétri conservées à -20 ° C pour l'évaporation du méthanol (figure 2E). Lors du transfert, de tenir la communauté au-dessus du porte-filtre Whatman et attirent des gouttes supplémentaires de méthanol en utilisant un autre morceau de papier Whatman épaisse avant de mettre dans le plat froid de Petri. Cela permettra d'assurer que les temps d'évaporation est constante d'un échantillon à l'.
- Attendez 4-6 heures pour l'évaporation jusqu'à ce que le porte-filtre Whatman paraît sèche. Évaporation insuffisante laisse méthanol résiduel qui interfère avec la coupe. Au cours de séchage des fissures et des déformations des causes dans les communautés.
- Prélever l'échantillon de -20 ° C congélateur. Coupez Whatman 541 papier filtre ne sont pas couverts par la communauté.
- Faire un cube rectangulaire contenant une feuille d'aluminium qui est suffisamment grande de telle sorte que l'échantillon comporte au moins marge ~ 2 mm à partir dechaque côté (figure 2F). Placez la communauté sur la surface inférieure de la feuille d'aluminium contenant; couvrir immédiatement l'échantillon avec OCT pour 3 ~ 4 mm plus haut que communauté. Si importante, l'orientation de l'échantillon peut être ajustée dans cette étape par rapport aux côtés du récipient. Attendre 10 min.
- Placer l'échantillon OCT-embarqué sur une plaque métallique sur la glace sèche à geler. Stocker les communautés congelés à -20 ° C ou -80 ° C congélateur.
2. Sectionnement Communautés surgelés pour imagerie par fluorescence
- Régler la température de la chambre cryosection à -25 ° C et laisser les échantillons dans la chambre jusqu'à ce que sa température atteigne la température de la chambre.
- Monter l'échantillon sur un cryo-fixation après application d'une baisse de l'OCT sur la montagne. Étaler uniformément octobre sur le côté de l'échantillon avec exposés papier filtre Whatman (fond du récipient) de sorte que l'épaisseur OCT est de 2-3 mm. Laissez-gel octobre intérieur de la chambre du cryostat avant soictioning. Assurer une marge PTOM de 2-3 mm sur tous les côtés de l'échantillon permet de préserver l'intégrité des sections.
- Les côtés du bloc échantillon OCT peut être utilisée pour aligner l'échantillon. Si l'échantillon n'est pas alignée par rapport à la lame, la coupe commence à partir d'un coin ou un côté de l'échantillon. Régler le montage de sorte que la lame coupe une parfaitement vertical (ou horizontal) de la surface du bloc à échantillons.
- Sections typiques pour les communautés de levure sont ~ 14 um d'épaisseur. Après avoir coupé une section, utilisez une lame de microscope conservé à température ambiante pour collecter le texte, par approchant lentement le curseur vers la section de coupe. La section va fondre et transférer à la lame de microscope. Jusqu'à 18 articles peuvent être transférés sur une glissière.
- Stocker les diapositives à des températures froides, de préférence à -20 ° C, avant d'imagerie. Perte de signal est minime lorsqu'il est conservé pendant une semaine à 4 ° C. Pour le signal de fluorescence maximale, l'imagerie est de préférence effectuée immédiatement après la coupe.
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Representative Results
Images de fluorescence des coupes verticales des communautés de levure contenant rouges et verts marqués populations compétitifs 6 sont représentés à la figure 3. Ces communautés sont constituées de deux souches de levure prototrophes et leur concurrence pour les ressources partagées, y compris l'espace, conduit à colonnes modèles 7, tel qu'il apparaît dans les coupes verticales. Résolutions allant jusqu'à une seule cellule peut être résolu en sections. Figure 3 compare les sections des communautés répétés obtenus avec (en bas) et sans (en haut) méthanol de fixation, suivant les protocoles de la figure 1. Pour découpe au cryostat communautés de levure sans fixation, le protocole est respecté partir de l'étape 1.8. Le signal de fluorescence est conservé dans les sections de la communauté sans fixer, mais l'intégrité de la communauté est compromise. En conséquence: (1) des cellules flotter autour du bord de la section, et (2) l'ensemble yichamp (c.-à-fraction de sections non perturbé par des artefacts de la procédure de coupe) est inférieur à celui des collectivités fixes.
La figure 4 montre représentatives champ clair et fluorescence coupes verticales d'une communauté levure. Cellules sur le haut de la forme la communauté d'une couronne qui semble distincte des autres cellules caractérisées par une forte diffusion de la fluorescence à champ clair et lumineux. Ces tendances sont conformes aux modèles présentés dans la différenciation des colonies de levure 4.
Figure 1. Organigramme de la procédure typique pour découpe au cryostat communautés levure avec (à gauche) et sans (à droite) de fixation.
Figure 2.
Figure 3. Représentant images de fluorescence de coupe verticale de replicate communautés de levures cultivées dans des conditions identiques sont montrées sans (en haut) et avec (en bas) en méthanol de fixation. La communauté se compose de deux souches de S. cerevisiae prototrophes taggés avec mCherry et yEGFP protéines fluorescentes 7. Sans fixation, les cellules ne sont pas liés entre eux et peut flotter dans les airs ou réorganiser pendant la coupe. Le méthanol de fixation maintient les cellules de la communauté ensemble, mais entraîne une contraction observée dans la différence entre la communauté hauteurs (% en moyenne).
Figure 4. Représentant champ lumineux (en haut) et de fluorescence (en bas) des images de coupe transversale verticale d'une communauté de levures sont affichés. La communauté se compose de deux souches de S. cerevisiae prototrophes taggés avec dsRED et YFP protéines fluorescentes 7.
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Discussion
La procédure présentée ici offre un moyen d'inspecter la structure interne des communautés de levure. L'étape de fixation méthanol rend la colonie de levure rigide 8 et préserve l'intégrité de la colonie, mais il provoque aussi le point 8 de retrait qui doit être pris en compte dans l'interprétation des résultats. Nous observons habituellement autour de 30% de rétrécissement dans la hauteur de colonies de levures, par rapport aux colonies directement intégrés dans un PTOM, sans fixer de 9.
Pour éviter le rétrécissement, une approche alternative pour découpe au cryostat est d'intégrer directement les communautés dans les PTOM et les congeler. La fluorescence est conservé dans la méthode basée sur l'encastrement direct, mais l'inconvénient est que les cellules au sein de chaque section ne sont pas liés entre eux. En conséquence, certaines des cellules sur les bords du flotteur section de suite, et les sections sont plus susceptibles de subir des perturbations dans le processus de coupe (figure 4). Bien que n'étant pas porté sur luire, champ clair des images de sections transversales de communautés de levure peut aussi nous donner des informations utiles sur l'état des cellules au sein de la communauté 9. Que ce soit ou non la propriété d'intérêt est affectée par l'étape de fixation doit être examiné au cas par cas.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Jonathan Cooper Lab au Fred Hutchinson Cancer Research Center for la permission d'utiliser leur cryostat. Ce travail a été soutenu par le NIH et la WM Keck Foundation. BM est un garçon Gordon et Betty Moore Foundation de la recherche Sciences de la Vie. Nous sommes reconnaissants à Daniel Gottschling pour avoir partagé son protocole de fixation avec nous.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Methanol | J.T. Baker | 9070-01 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Andwin Scientific | 4583 | |
| Whatman Grade No. 541 Quantitative Filter Paper | Whatman | 1541-047 | |
| Millipore-MF Membrane Filter | Millipore | HAWP04700 | |
| Cryostat | Leica | CM 1510 S |
References
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