Summary
Determinando o enxerto de células do doador representa um desafio em ratinho ósseas modelos de transplante de medula que carecem bem definidos marcadores fenotípicos. Nós descrevemos uma metodologia para quantificar o enxerto de células de doadores do sexo masculino em camundongos fêmeas receptoras de transplante. Este método pode ser utilizado em todas as estirpes de ratinho para o estudo de funções HSC.
Abstract
Murinos osso modelos de transplante de medula fornecer uma ferramenta importante na medição de células-tronco hematopoiéticas (HSC) funções e os genes que determinam / moléculas que regulam HSCs. Nestes sistemas modelo de transplante, a função de HSCs é determinada pela capacidade destas células para enxertar e reconstituir ratinhos receptores letalmente irradiados. Comummente, a célula doadora contribuição / enxerto é medida por meio de anticorpos específicos para o doador de proteínas da superfície celular, utilizando citometria de fluxo. No entanto, este método depende muito da especificidade e a capacidade do marcador de superfície celular de diferenciar células derivadas de dador a partir de células-receptor originadas, que podem não estar disponíveis para todas as estirpes de ratinho. Considerando os vários fundos de linhagens de camundongos geneticamente modificados no mercado, esta superfície celular / citometria de fluxo baseado em método tem limitações significativas, especialmente em linhagens de camundongos que não têm bem definidos marcadores de superfície de células de doadores separar Congênicos destinatário cells. Aqui, nós relatamos uma técnica baseada em PCR para determinar o enxerto de células do doador / contribuição em camundongos receptores de transplantes. Nós transplantadas machos dadores de medula óssea para HSCs letalmente irradiados congénicos ratinhos fêmea. Amostras de sangue periférico foram colhidas em diferentes pontos do tempo pós-transplante. As amostras de medula óssea foram obtidas no final das experiências. O ADN genómico foi isolado e o gene cromossoma Y específica, Zfy1, foi amplificado utilizando PCR quantitativa em tempo real. O enxerto do doador masculinos derivados de células nos ratinhos receptores do sexo feminino foi calculado contra curva padrão com a percentagem conhecida de DNAs macho versus fêmea. Bcl2 foi usado como um gene de referência para normalizar a quantidade total de ADN. Os nossos dados sugerem que esta abordagem fiável determina o enxerto de células do doador e proporciona um método útil, contudo simples para medir a reconstituição de células hematopoiéticas, em modelos de transplante de osso murino medula. O nosso método pode ser realizado rotineiramente em muitos laboratórios, porque nenhumequipamento caro, tais como citometria de fluxo é necessária.
Introduction
Murino de medula óssea (BM) modelo de transplante foi desenvolvido pela primeira vez em 1960 1. Este modelo tem sido utilizado extensivamente para o estudo do dador de células estaminais hematopoiéticas (HSC) Biologia em um rato receptor hospedeiro. Murino osso modelo de transplante de medula nos proporcionou conhecimentos valiosos sobre as funções do HSC e sua regulação e é indispensável na pesquisa HSC. Alogénica modelo de transplante de medula óssea como C57Bl/6J H2b-Balb / C H2d ou modelo de transplante Congênicos como C56Bl/6J CD45.2-B6.SJL CD45.1 são usados em muitos laboratórios, para estudar a função de genes em actividade HSC 2, efeito de tratamento com medicamentos para as doenças de função HSC 3 ou afins, tais como o transplante de enxerto-versus-hospedeiro (GVHD) 4.
Marcadores de superfície celular tais como o haplotipo MHC ou CD45.1 são comumente usados para distinguir células derivadas de dador de células-receptor originaram. C57Bl/6J H2b, CD45.2 H2d B6.SJL CD45.1 são as estirpes de ratos mais utilizados no transplante de medula óssea porque a contribuição das células do doador podem ser facilmente avaliadas por citometria de fluxo, medindo CD45.1 vs CD45.2 ou H2b vs H2D. No entanto, muitas outras cepas, como FVB / NJ 5 e C3H também são frequentemente utilizados para gerar transgênico ou geneticamente camundongos knockout. Estes ratos podem ser retrocruzada com uma linha pura e mantidos num fundo genético / MHC misto. Nestes casos, determinar o enxerto dador de células e função HSC pode ser difícil como marcadores específicos de dadores de células superficiais podem não estar disponíveis.
Usando Y-cromossoma sonda específica de DNA para detectar as células de doadores do sexo masculino por Southern blot em sexo incompatíveis transplante de medula óssea foi desenvolvido pelo grupo do Dr. Miwa 6. Em seguida, um PCR em tempo real para a região Y-sexo determinação verificou-se ser um método preciso e altamente específico para quantificar macélulas fetais le no sistema de sangue materno 7. Este conceito foi adaptado pelo grupo do Dr. Schwarzenberger para o desenvolvimento de uma técnica de PCR em tempo real em um modelo murino de transplante de medula óssea para determinar o enxerto doador de 8 células. Nós ainda modificada deste método para a medição do enxerto dador de células no modelo do rato FVB / NJ transplante de medula óssea. Este método é actualmente utilizada extensivamente no nosso grupo para o estudo do papel da quinase Pim1 em biologia HSC.
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Protocol
1. Isolamento das células da medula óssea
- Euthanize masculinas dadoras FVB / NJ ratos fêmeas e FVB / NJ camundongos utilizando CO método 2, seguido de deslocação cervical. As fêmeas FVB / NJ células da medula óssea será utilizado como células competitivos.
- Use pequenas tesouras e pinças, dissecar fêmures e tibiaes de ratos e coloque-os em um prato de 60 milímetros de cultura de tecido contendo 6 ml RPMI1640 gelada com 5% de calor FBS inativado. Use tecido Kimwipe para remover o músculo e outros tecidos. Cortar ambas as extremidades de cada eixo do osso no prato.
- Ligar a extremidade do osso, com agulha 23G, em 3 de seringa cc, expulsar medula óssea com RPMI 1640 com 5% de FBS inactivado pelo calor para dentro do prato. Desagregar os tecidos da medula óssea por aspiração repetida usando a mesma agulha. Transferir a suspensão de células para 15 ml de tubo de centrífuga.
- Girar as células durante 5 minutos a 400 xg, remover o sobrenadante, ressuspender as células em 1 ml de tampão de sangue vermelho quarto temperatura lise celular (155 mM pbicarbonato otassium, 10 mM de cloreto de amónio, 0,1 mM de EDTA, pH = 7,4) e incuba-se à temperatura ambiente durante 5 min, em seguida, adicionar 5-10 ml de meio RPMI 1640 com 5% de FBS inactivado pelo calor.
- Passar as células através de um coador de células. Recolher o fluxo através de um tubo novo. Girar durante 5 minutos a 400 x g. Remover o sobrenadante, o sedimento de células não devem conter qualquer cor vermelha. A ausência de cor vermelha indica a remoção completa das células vermelhas do sangue. Ressuspender o sedimento de células em 10 ml de RPMI 1640 com 5% de FBS inactivado pelo calor. Vortex suavemente para assegurar que a suspensão celular é completamente uniforme. Tome uma alíquota e contar as células em um hemocitômetro. Calcular a quantidade de volume de células necessárias para o transplante de medula óssea e células de alíquotas suficientes e misturar células dadoras masculinas com células concorrente do sexo feminino, numa relação de 5:2. Girar durante 5 minutos a 400 xg, lavar com PBS, ressuspender em PBS com uma concentração final de células de dador a 5 x 10 células de 6 ml / e concorrente de 2 × 10 6
2. Transplante de Medula Óssea competitivo
- Irradiar ratos fêmeas receptoras (8-12 semanas de idade) com 137Cs radiador raios gama a uma dose única de 11Gy 4-6 hr antes do transplante de medula óssea.
- Coloque os ratos irradiados do sexo feminino em um limitador mouse. Injectar o doador e mista células concorrentes via veia da cauda, em 0,1 ml de volume total de tal forma que cada rato recebe 5 x 10 5 células dadoras e 2 × 10 5 concorrente células da medula óssea.
3. Coleta de Amostras
Semana de casais após transplante de medula óssea, recolher amostras de sangue periférico (~ 50 ul) de rato receptor fêmea por sangramento retro-orbital sob anestesia condição. As amostras são recolhidas em tubos com EDTA revestidos. BM amostras também podem ser recolhidas no fim da experiência, geralmente, pelo menos, 4 meses pós-transplante, com procedimentos idênticos aos descritos anterior (Etapa 1), geralmente 20-40% de1 células BM tíbia são suficientes para tornar a quantidade suficiente de DNA. Amostras de sangue ou BM de idade correspondentes normais ratos fêmeas e machos também são coletadas para preparar curva padrão.
4. Isolamento de DNA genómico
- Adicionar volume 4 × de temperatura ambiente tampão de lise (~ ul 200) para cada amostra de sangue. Misturar bem e incubar à temperatura ambiente durante 5 min. Adicionar 1 ml de PBS e, em seguida girar para baixo para remover a maior parte do GV lisada.
- Isolar o ADN utilizando um estojo de extracção de ADN de sangue (DNA QIAmp kit de extracção de sangue). Pré-aquecer o tampão de eluição (AE), a 37 ° C para aumentar o rendimento do ADN eluído. DNAs masculinos e femininos para a curva padrão são isoladas da mesma forma.
- (Opcional) O DNA genómico pode ser ainda purificado ou concentrados utilizando EtOH método de precipitação na presença de acetato de sódio 3 M (pH = 5,5). Os sedimentos de DNA são então ressuspensas em 40-50 ul de água destilada, para análise imediatamente ou armazenados a -20 ° C para uso futuro.
- Medir o DNA Concentrção com Nanodrop fotômetro espectros ND-1000. As amostras com DO 260/280 entre 1,8-2,0 são utilizadas para análise posterior.
- Diluir com DNAase DNA livre H 2 O para 4ng/μl em um volume total de 50 ul.
5. Preparação da curva padrão
Diluir DNA do sexo masculino e feminino de ADN a uma concentração de 4 ng / ul, e faz-se a mistura de ADN de acordo com a Tabela 1
| % De ADN masculino no fundo feminino | Volume (uL) de DNA macho 4ng/μl | Volume (uL) de DNA fêmea 4ng/μl | Volume total (pi) |
| 0,2 | 1 | 499 | 500 |
| 0,5 | 1 | 199 | 200 |
| 2,5 | 5 | 195 | 200 |
| 12,5 | 25 | 175 | 200 |
| 50 | 100 | 100 | 200 |
| 87,5 | 175 | 25 | 200 |
| 100 | 200 | 0 | 200 |
Tabela A preparação da amostra 1. De curva padrão. Normais machos e fêmeas FVB / NJ ratos na idade de 8-12wks foram sacrificados. As células do sangue e da BM foram coletados. Os DNAs das células do sexo masculino e do sexo feminino células foram isoladas e re-suspensas numa concentração de 4ng/μl. Os DNAs de ambos os sexos foram misturadas em várias proporções para produzir as misturas de ADN de amostra padrão.
6. PCR em tempo real
- Configure a placa de reação de PCR pela mistura reagente SYBR Green Supermix com primers e DNA genômico. O volume de reacção (20 ul) contém 400 nM de cada iniciador e 5 ul de ADN genómico de células de sangue (uL 4ng/μl x5 = 20 ng), em cada reacção. DNA samples e padrões foram criados em triplicado. As sequências dos iniciadores são apresentadas na Tabela 2.
| Nome do gene | Para a frente | Reverter |
| Bcl2 | 5'-AAGCTGTCACAGAGGGGCTA | 5'-CAGGCTGGAAGGAGAAGATG |
| Zfy1 | 5-TGGAGAGCCACAAGCTAACCA | 5'-CCCAGCATGAGAAAGATTCTTC |
Tabela 2. Sequência do iniciador de RT-PCR para Bcl2 murino e Zfy1.
- Realizar PCR de reacção utilizando Biorad IQ5 máquina PCR com as seguintes condições: 95 ° C 3 min, 42 ciclos de amplificação de 95 ° C durante 10 seg, 58 ° C durante 25 seg e 72 ° C durante 15 segundos, seguido por uma fusão de curva passo.
- Obter ciclo limiar (Ct) valores pelo Sistema IQ5 Bio-Rad Edition 2.1 ótico padrão. Calcular δCt (Ct Zfy1 </ Sup>-Ct Bcl2), valor e Zfy1 nível de expressão é calculado como o valor de 2-δ Ct.
- Estabelecer curvas padrão para cada uma das séries de reacção com 2-δCt leitura a partir da conhecida macho / fêmea misturas padrão. As curvas padrão são geradas através da representação gráfica da média de 2-δCt valor de triplicados para a DNA conhecido macho% na mistura com encaixe de regressão linear.
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Representative Results
Figura 1 e 2 apresentaram exemplos de curvas padrão traçada com valores médios de 2-δCt contra percentagens de ADN masculino. Figura 1A mostraram temperatura de fusão específica para Bcl2 e Zfy1 amplicons localizadas a 78,5 ° C e 88,5 ° C, respectivamente. Bcl2 é utilizado como um gene de referência para normalizar a quantidade total de ADN carregado em cada reacção de PCR. Bcl2 curvas de amplificação (ver Log) para cada amostra, padrão fundem uns com os outros independentemente da concentração de DNA do sexo masculino, que indica a mesma quantidade de carga de ADN (Figura 1B). No entanto, Zfy1 curva de amplificação migrado para a esquerda com a crescente quantidade de DNA masculino na amostra (Figura 1C). Para validar o nosso método, nós testamos o enxerto de células de doadores do sexo masculino transplantados em camundongos que receberam células BM de WT vs Pim knockout triplo (TKO) ratos em diferentes tempo após o transplante pontos. Tanto o sangue periférico (6wks) e amostras (BM 16wks) w ere analisados. HSCs de camundongos Pim TKO têm defeitos na reconstituição de camundongos letalmente irradiados (AN, N et al., Manuscrito em revisão). Como esperado, os ratinhos receptores transplantados com células Pim TKO tinha uma percentagem muito inferior de células em comparação com ratos machos transplantados com células WT (Figura 3).
Figura 1. (A) curva de fusão representativas a partir de amostras múltiplas com diferentes percentagens de ADN do sexo masculino. O pico a 78,5 indica amplificação de Bcl2, enquanto que o pico a 88,5 ° C indica amplificação de ZFY-1. Curva de amplificação representativo de amostras múltiplas com a percentagem de DNA diferente de Bcl2 macho (B) e Zfy1 (C) Ct: limiar de ciclo.= "Http://www.jove.com/files/ftp_upload/50193/50193fig1large.jpg" target = "_blank"> Clique aqui para ver maior figura.
Figura 2. RT-PCR curva padrão para percentagem de ADN masculino. As amostras de DNA (20 ng em 20 uL de volume total) de misturas de DNA de ambos os sexos obtidos a partir de células da medula óssea foram processados por RT-PCR como descrito no protocolo. Os valores médios de δCt (Ct-Ct Zfy1 Bcl2) para as amostras individuais foram calculadas e 2-δ Ct (eixo Y), foram comparados com percentagem de ADN masculino (eixo X) (intervalo de 0,2% a 100%) por meio de regressão linear montagem. R2 representa o coeficiente de determinação.
Figura 3. Competitiva transplante de medula óssea experiments. 5 x 10 5 total de células da BM de WT macho ou a mesma faixa etária masculino Pim triplo KO (nocaute técnico) ratos juntamente com 2 x 10 5 femininos concorrente células da medula óssea foram transplantadas em irradiados fêmeas. Quimerismo no sangue periférico (PB) às 6 semanas e quimerismo BM menos 16 semanas após o transplante foram estimadas pela percentagem de ADN masculino por RT-PCR como decried no protocolo (* p <0,05, ** P <0,01).
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Discussion
O objetivo de nosso estudo é o de fornecer as audiências uma técnica de PCR baseado quantificar o enxerto de células de doadores em um modelo murino de osso competitivo transplante de medula. Vários estudos têm sido relatados por meio de RT-PCR para detectar as células de dadores em modelos de transplante 9-10. O grupo do Dr. Schwarzenberger a primeira desenvolveu um modelo murino óssea transplante de medula usando PCR em tempo real para amplificar cromossomo Y específico 8. Este método foi utilizado para estudar Gli-1 em função de atividade HSC 11. Em seguida, ainda mais modificada do protocolo e fornecida uma descrição detalhada, o protocolo de passo-a-passo experimental em formato visualizado. A apresentação visualizada de nosso protocolo permite que o público a seguir o nosso protocolo facilmente. Também foram comparados os resultados da PCR utilizando ADN genómico a partir de amostras de DNA de BM vs sangue periférico. Os dados relativos ao dador enxertia de BM e amostras de sangue são basicamente constante, no entanto, normalmente inferior a variação foi observada em amostras de BM. Isto éprovavelmente devido a hemoglobina residual após a lise de glóbulos vermelhos no sangue periférico que podem comprometer a pureza / qualidade do ADN genómico nas amostras de sangue.
Existem várias vantagens com a nossa técnica de PCR-based para quantificar o enxerto de células de doadores. Primeiro, a técnica pode ser realizada na maioria dos laboratórios. Não há necessidade de equipamento especializado e caro do que outro aparelho de tempo de PCR real. Nós ainda modificado por PCR componente de reacção e utilizados SYBR Green Supermix vez de Taqman. Essa mudança reduz ainda mais os custos e despesas como eliminar a sonda fluorescente marcado. Em segundo lugar, a nossa técnica é confiável e altamente reprodutível. Utilizou-se o gene de referência Bcl2 para normalizar a quantidade total de ADN em vez de kit de quantificação de ADN. Gene bcl2 foi usado porque: 1) o gene não está localizado no cromossoma Y. Portanto, a sua expressão não é afectado por enxerto macho dador de células. 2). Bcl2 não é regulado sob as condições atuais de transplante. Como shpróprio na Figura 1, Bcl2 gene produz um controlo fiável e altamente consistentes para o carregamento de DNA total independente da quantidade de ADN carregado masculina. Zfy1 é um gene de dedo de zinco dentro dos testículos determinantes região 12 e está localizado no cromossoma Y. Tem sido relatado que o nível de expressão do gene de Zfy1 corresponde bem com a quantidade de ADN de células do sexo masculino, num modelo de rato de transplante 8. Terceiro, a nossa técnica de PCR com base é altamente sensível e pode detectar o enxerto de células de doadores em <1%. Além disso, as amostras podem ser armazenadas durante muito tempo para análise posterior. Em contraste, o método convencional de fluxo baseado em citometria de amostra requer processamento imediato. Finalmente, a nossa técnica é a estirpe do rato independente e pode ser utilizada para o fundo genético que carece de marcadores de superfície bem definidos para células doadoras separadas das células receptoras. Esta é a maior vantagem deste método.
Sob a nossa atual condição experimental (doador / competitou a razão é de 5/2), observou-se em torno de enxerto doador de 80-90% em 16 semanas utilizando o método baseado em PCR. Nossos dados são bastante comparável com método convencional de fluxo baseado em citometria, que mostrou ~ enxerto de células 95% de doadores em 16 semanas após o transplante com doador (CD45.2) / concorrente (CD45.1) em relação 4:01 2. Em comparação com o método convencional, que usa marcadores de superfície celular para detectar células do doador nos ratinhos receptores, a principal desvantagem do método é a nossa incapacidade para analisar o enxerto em diferentes sub-populações de células do sangue, tais como em células B, células T ou granulócitos. No entanto, se necessário, é possível a recolha de cada população de células utilizando a técnica de separação de células e, em seguida, sujeitas as amostras para RT-PCR para determinar a contribuição de doadores de células em cada população de células. Uma vez que o enxerto de células do doador foi calculada com base na curva padrão, a leitura da amostra é totalmente dependente da inclinação e intercepção y da curva padrão. É possível que possamos sair gama-readout (isto é, mais de 100% de enxerto). No entanto, estes "falsos positivos ou falsos negativos" podem ser evitados se: 1) os procedimentos de ADN de isolamento para as amostras testadas e as amostras da curva padrão são idênticos, e 2) a gama escolhida de curva padrão está perto da leitura de amostra esperado. Além disso, uma vez que pode haver diferenças de cada reacção de PCR e no estado de calibração de máquina de PCR, as amostras da curva padrão deve ser incluído em cada placa de PCR, para evitar variações entre cada reacção de PCR.
Por fim, validada a nossa técnica usando nossos Pim ratos triplos KO. Consistente com o relatório anterior 13, descobrimos que HSCs doadores de camundongos KO Pim triplos estão com defeito na reconstituição ratos receptores letalmente irradiados.
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Disclosures
Nós não temos nenhuma competição de interesses financeiros de divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Charles Greenberg para o uso de sua máquina do tempo real PCR. Este trabalho é apoiado por MUSC Hollings Cancer Center Startup Fundo, Hollings Cancer Center ACS IRG, ASCO Conquer Cancer Foundation Award Desenvolvimento de Carreira, 1K08HL NIH 103.780-01A1, e NIH 3P30CA138313-01S3. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente a posição oficial do Instituto Nacional de Saúde ou agentes de outros financiamentos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30255.01 | |
| FBS | Invitrogen | 16140-017 | Heat inactivated |
| Ammonium chloride | MP Biomedicaals | 194806 | |
| Potassium Bicarbonate | Fisher | P184-500 | |
| QIAamp DNA Blood minikit | Qiagen | 51106 | |
| Cell strainer | BD bioscience | ||
| iQ SYBR Green supermix | Biorad | 170-8882 | |
| iQ5 real time PCR machine | Biorad | ||
| Spectra photometer | Nanodrop ND-1000 | ND-1000 |
References
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