Summary
Fastställande engraftment givarcell utgör ett problem i benmärg hos möss transplantation modeller som saknar väldefinierade fenotypiska markörer. Vi beskrev en metod för att kvantifiera manlig engraftment donatorcellen hos honmöss transplantation mottagare. Denna metod kan användas i alla musstammar för att studera HSC funktioner.
Abstract
Murina benmärgstransplantation modellerna ger ett viktigt verktyg för att mäta hematopoetiska stamceller (HSC) funktioner och bestämma gener / molekyler som reglerar HSCs. I dessa system transplanterade modell, är funktionen av HSC: er bestämdes genom förmågan hos dessa celler att ympa och rekonstituera letalt bestrålade mottagande möss. Vanligen är donatorcellen bidrag / ympning mäts genom antikroppar mot donator-specifika cellyteproteiner med flödescytometri. Detta beror dock metoden mycket på specificitet och förmåga cellytan markör för att skilja donator-härledda celler från mottagare-ursprung celler, som inte finns för alla musstammar. Med tanke på de olika bakgrunder av genetiskt modifierade musstammar på marknaden, har denna cellytan / flödescytometri-baserad metod betydande begränsningar, särskilt i musstammar som saknar väldefinierade ytmarkörer att separera donator celler från kongena mottagare ceLLS. Här rapporterade vi en PCR-baserad teknik för att bestämma ympning donatorcellen / bidrag i möss transplantatmottagare. Vi transplanterade manliga givare HSCs benmärgen att letalt bestrålade kongena honmöss. Perifera blodprover uppsamlades vid olika tidpunkter efter transplantation. Benmärgsprov erhölls vid slutet av experimenten. Genomiskt DNA isolerades och Y-kromosomen specifika genen, Zfy1, amplifierades med användning av kvantitativ realtids-PCR. Den inympning av manliga givare härledda celler i de kvinnliga mottagande mössen beräknades mot standardkurva med känd procentandel manliga kontra kvinnliga DNA. BCL2 användes som en referens gen att normalisera det totala DNA-mängden. Våra data tyder på att detta tillvägagångssätt tillförlitligt bestämmer engraftment givarcell och ger en användbar, men ändå enkel metod att mäta hematopoetiska celler rekonstitution i murina benmärgstransplantation modeller. Vår metod kan rutinmässigt i de flesta laboratorier eftersom ingakostsam utrustning såsom flödescytometri krävs.
Introduction
Murin benmärg (BM) transplantation modell utvecklades först på 1960-talet 1. Denna modell har använts i stor utsträckning för att studera donator hematopoetiska stamceller (HSC) biologi i en värd mottagare mus. Murin benmärgstransplantation modell har gett oss värdefull kunskap om HSC funktioner och deras reglering och är nödvändig i HSC forskning. Allogen benmärgstransplantation modell som C57BL/6J H2b-Balb / C-H2D eller kongena transplantation modell som C56Bl/6J CD45.2-B6.SJL CD45.1 används i många laboratorier för att studera geners funktion på HSC aktivitet 2, effekt missbruksbehandling på HSC funktion 3 eller transplantation sjukdomar som graft-versus-host sjukdom (GvHD) 4.
Cellytmarkörer såsom MHC-haplotyp eller CD45.1 vanligen används för att särskilja donator-härledda celler från mottagare-ursprung celler. C57BL/6J H2b, CD45.2 C-H2D och B6.SJL CD45.1 är de vanligaste musstammar vid benmärgstransplantation eftersom donatorcellen bidraget kan lätt bedömas genom flödescytometri mäter CD45.1 vs CD45.2 eller H2b vs H2D. Men många andra stammar som FVB / NJ 5 och C3H också ofta används för att generera genetiskt transgena eller möss knockout. Dessa möss kan tillbakakorsade till en inavlad linje och hålls i en blandad genetisk / MHC bakgrund. I dessa fall kan bestämma engraftment givarcell och HSC funktion vara svårt som givare specifik cellytmarkörer kanske inte är tillgängliga.
Med Y-kromosom-specifik DNA-prob för att detektera donator manliga cellerna genom Southern blot i sex-felmatchade benmärgstransplantation har utvecklats av Dr Miwa grupp 6. Därefter tillsattes en realtids-PCR för kön-bestämmande region Y befunnits vara en noggrann och mycket specifik metod för att kvantifiera male fetala celler i moderns blodsystemet 7. Detta koncept anpassades av Dr Schwarzenberger grupp för utveckling av en realtids-PCR-teknik i en murin benmärgstransplantation modell för att bestämma engraftment donatorcellen 8. Vi ändrade vidare denna metod för mätning av donatorcellen engraftment i FVB / NJ mus benmärgstransplantation modell. Denna metod är för närvarande omfattande används i vår grupp för att studera vilken roll Pim1 kinas i HSC biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Benmärg cellisolering
- Avliva manliga givare FVB / NJ möss och kvinnliga FVB / NJ möss med CO 2 metoden följt av cervikal dislokation. De kvinnliga FVB / NJ benmärgsceller kommer att användas som konkurrerande celler.
- Använd en liten sax och pincett, dissekera ut lårben och tibiaes från möss och placera dem i en 60 mm vävnadsodlingsplatta innehållande 6 ml iskall RPMI1640 med 5% värmeinaktiverat FBS. Använd Kimwipe vävnad för att avlägsna muskler och andra vävnader. Skär av båda ändarna av varje ben axel i skålen.
- Anslut änden av benet med 23G nålen på 3 ml spruta, spola ut benmärg med RPMI1640 med 5% värmeinaktiverat FBS i skålen. Disaggregerade vävnader benmärgsceller genom upprepade strävanden med samma nål. Överför cellsuspensionen till 15 ml centrifugrör.
- Centrifugera ner cellerna under 5 min vid 400 xg, avlägsna supernatanten, resuspendera cellerna i 1 ml av rumstemperatur röda blodkroppar lysbuffert (155 mM potassium bikarbonat, 10 mM Ammoniumklorid, 0,1 mM EDTA, pH = 7,4) och inkubera vid rumstemperatur under 5 minuter och tillsätt sedan 5-10 ml RPMI 1640 med 5% värmeinaktiverat FBS.
- Passera cellerna genom en cell sil. Samla flödet genom till ett nytt rör. Centrifugera ner under 5 minuter vid 400 x g.. Avlägsna supernatanten, cellpelleten bör inte innehålla någon röd färg. Frånvaron av röd färg indikerar en fullständigt avlägsnande av röda blodkroppar. Resuspendera cellpelleten i 10 ml av RPMI 1640 med 5% värmeinaktiverat FBS. Vortexa försiktigt för att se cellsuspensionen är helt jämn. Tag en alikvot och räkna cellerna i en hemacytometer. Räkna ut hur mycket volym av celler som behövs för benmärgstransplantation och alikvot tillräckligt med celler och blanda manliga givarceller med konkurrerande kvinnliga celler vid ett förhållande av 5:2. Centrifugera ner under 5 minuter vid 400 xg, tvätta med PBS, resuspendera i PBS med den slutliga koncentrationen av givarceller vid 5 x 10 6 / ml och konkurrent-celler vid 2 x 10 6
2. Konkurrenskraftig benmärgstransplantation
- Bestråla honkön recipientmöss (8-12 veckor gamla) med 137Cs gammastrålar svartkroppsstrålare vid en enda dos av 11Gy 4-6 timmar före benmärgstransplantation.
- Placera de bestrålade honmöss i en mus fixeringsutrustning. Injicera blandade donator och celler konkurrerande via svansvenen i 0,1 ml av den totala volymen, så att varje mus erhåller 5 x 10 5 givarceller och 2 × 10 5 konkurrent benmärgsceller.
3. Provtagning
Par veckor efter benmärgstransplantation, samla perifera blodprover (~ 50 | il) från kvinnlig mottagare mus genom retro-orbital blödning under anestesi tillstånd. Prover samlas i EDTA-belagda rör. BM prover kan också samlas i slutet av försöket, vanligtvis minst 4 månader efter transplantation med samma procedurer som beskrivs som tidigare (steg 1), vanligtvis 20-40% av1 tibia BM celler är tillräckligt för att göra tillräckligt mängd DNA. Blod eller BM prover från åldersmatchade normala kvinnliga och manliga möss samlas också in för att förbereda standardkurva.
4. Genomiskt DNA Isolering
- Tillsätt 4 x volym av rumstemperatur RBC lysbuffert (~ 200 | il) till varje blodprov. Blanda väl och inkubera vid rumstemperatur under 5 min. Tillsätt 1 ml PBS, sedan snurra ner för att avlägsna det mesta av den lysade RBC.
- Isolera DNA med en blod-kit DNA-extraktion (QIAmp DNA Blood utvinning kit). Pre-varm elueringsbufferten (AE) vid 37 ° C för att öka utbytet av eluerat DNA. Manliga och kvinnliga DNA för standardkurva isoleras på samma sätt.
- (Valfritt) Genomiskt DNA kan renas ytterligare eller koncentreras med EtOH-utfällning metod i närvaro av 3 M natriumacetat (pH = 5,5). DNA pelletarna återsuspenderas sedan i 40-50 pl destillerat vatten för analys omedelbart eller lagras vid -20 ° C för framtida användning.
- Mät DNA-concentrtion med NanoDrop ND-1000 spektra fotometer. Prov vars OD 260/280 mellan 1,8-2,0 används för vidare analys.
- Späd DNA med DNAas fri H 2 O att 4ng/μl i en total volym av 50 pl.
5. Standardkurva Beredning
Späd manligt DNA och kvinnligt DNA till en koncentration av 4 ng / pl, och göra DNA-blandningen enligt den Tabell1
| % Av manligt DNA i kvinnlig Bakgrund | Volym (pl) av 4ng/μl manligt DNA | Volym (pl) av 4ng/μl kvinnliga DNA | Total volym (il) |
| 0,2 | 1 | 499 | 500 |
| 0,5 | 1 | 199 | 200 |
| 2,5 | 5 | 195 | 200 |
| 12,5 | 25 | 175 | 200 |
| 50 | 100 | 100 | 200 |
| 87,5 | 175 | 25 | 200 |
| 100 | 200 | 0 | 200 |
Tabell 1. Provberedning för standardkurva. Normala manliga och kvinnliga FVB / NJ möss vid en ålder av 8-12wks offrades. Blod och BM celler uppsamlades. DNA från manliga celler och kvinnliga celler isolerades och återsuspenderas vid en koncentration av 4ng/μl. De manliga och kvinnliga DNA blandades vid olika förhållanden för att generera DNA-standardprov blandningar.
6. Realtids-PCR
- Ställ in PCR-reaktionen plattan genom att blanda SYBR Green SuperMix reagens med primers och genomisk DNA. Reaktionen volym (20 pl) innehåller 400 nM av varje primer och 5 pl av blodkroppar genomiskt DNA (4ng/μl x5 il = 20 ng) i varje reaktion. DNA SAMPles och standarder sattes upp i tre exemplar. Sekvenserna för primrarna visas i tabell 2.
| Gene namn | Framåt | Omvänd |
| BCL2 | 5'-AAGCTGTCACAGAGGGGCTA | 5'-CAGGCTGGAAGGAGAAGATG |
| Zfy1 | 5-TGGAGAGCCACAAGCTAACCA | 5'-CCCAGCATGAGAAAGATTCTTC |
Tabell 2. RT-PCR-primersekvensen för murin Bcl2 och Zfy1.
- Utför PCR-reaktion med användning av Biorad iQ5 PCR-maskin med följande villkor: 95 ° C 3 minuter, 42 amplifieringscykler med 95 ° C under 10 sek, 58 ° C under 25 sekunder och 72 ° C under 15 sekunder, följt av en smältning-kurva steg.
- Skaffa Cycle tröskel (CT) värden av Bio-Rad iQ5 2,1 Standard Edition optiskt system. Beräkna ACt (Ct Zfy1 </ Sup>-Ct Bcl2) värde, och Zfy1 expressionsnivån beräknas som värdet av 2-δ Ct.
- Upprätta standardkurvor för varje reaktion serie med 2-ACt läsning från kända manliga / kvinnliga standard blandningar. De standardkurvor alstras genom att avsätta medelvärdet av 2-ACt värde triplikat till den kända% manligt DNA i blandningen med linjär regression montering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 och 2 visade exempel på standardkurvor plottade med medelvärden av 2-ACt mot procentandelar av manligt DNA. Figur 1A visade specifik smälttemperaturen för BCL2 och Zfy1 amplikoner lokaliserade vid 78,5 ° C och 88,5 ° C resp. BCL2 används som en referens gen att normalisera den totala mängden laddade DNA i varje PCR-reaktion. BCL2 förstärkning kurvor (loggen) för varje standardprov samman med varandra oberoende av manligt DNA-koncentration, vilket indikerar lika stor mängd laddade DNA (Figur 1B). Emellertid Zfy1 amplifieringskurva migrerade till vänster med ökande mängd av manligt DNA i provet (Figur 1C). För att validera vår metod, testade vi manliga engraftment donatorcellen i transplanterade möss som fick BM-celler från WT vs Pim trippel knockout (TKO) möss vid olika tidpunkter efter transplantation. Både perifert blod (6wks) och BM prover (16wks) w ere analyseras. HSCs från Pim TKO möss har brister i beredning dödligt bestrålade möss (An, N et al., Manuskript under översyn). Som väntat hade mottagande möss transplanterade med Pim TKO celler en mycket lägre andel av manliga celler jämfört med möss transplanterade med WT-celler (Figur 3).
Figur 1. (A) representant smältkurva från flera prover med olika manliga DNA procentsatser. Toppen vid 78,5 indikerar amplifiering av Bcl2, medan toppen vid 88,5 ° C indikerar amplifiering av Zfy-1. Representativ förstärkning kurva från flera prover med olika manligt DNA procent för Bcl2 (B) och Zfy1 (C), CT: cykel tröskel.= "Http://www.jove.com/files/ftp_upload/50193/50193fig1large.jpg" target = "_blank"> Klicka här för att se större bild.
Figur 2. RT-PCR-standardkurva för manligt DNA procent. Prover (20 ng DNA i 20 | il total volym) av manliga och kvinnliga DNA blandningar erhållna från benmärgsceller bearbetades för RT-PCR såsom beskrivits i protokollet. Medelvärdena för ACt (Ct Zfy1-Ct Bcl2) för enskilda prover beräknades och 2-δ Ct (Y-axeln) avsattes mot manligt DNA andel (X-axel) (intervall från 0,2% till 100%) med linjär regression montering. R2 representerar determinationskoefficienten.
Figur 3. Konkurrenskraftig benmärgstransplantation erfarenhetriments. 5 x 10 5 totalt BM celler från manlig WT eller ålder matchade manliga Pim trippel KO (TKO) möss tillsammans med 2 x 10 5 kvinnliga konkurrerande benmärgsceller transplanterades in i bestrålade kvinnliga värdar. Perifert blod (PB) chimerism vid 6 veckor och BM chimerism vid 16 v. efter transplantation uppskattades i procent av manligt DNA med RT-PCR som decried i protokollet (* p <0,05, ** P <0,01).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med vår nuvarande studie är att ge publiken en PCR-baserad teknik för att kvantifiera engraftment donatorcellen i en konkurrenskraftig murin benmärgstransplantation modell. Flera studier har rapporterats med RT-PCR för att detektera donatorceller vid transplantation modeller 9-10. Dr Schwarzenberger grupp utvecklade först en murin ben modell benmärgstransplantation med realtids-PCR för att förstärka y-kromosom-specifika 8. Denna metod användes för att studera Gli-1 funktion i HSC aktivitet 11. Vi sedan ytterligare modifieras protokollet och gav en detaljerad steg-för-steg försöksprotokoll i visualiseras format. Den visualiserade presentation av vår protokollet kan publiken att följa vår protokoll lätt. Vi jämförde också våra PCR-resultat med genomiskt DNA från BM prover vs DNA från perifert blod. Donator engraftment data från BM och blodprover är i grunden överens, var dock vanligtvis mindre variationer finns i BM prover. Detta ärsannolikt på grund av att kvarvarande hemoglobin efter RBC-lys i det perifera blodet som kan äventyra renheten / kvalitet av genomiskt DNA i blodprover.
Det finns flera fördelar med vår PCR-baserad teknik för att kvantifiera engraftment donatorcellen. Första, vår teknik kan utföras i de flesta laboratorier. Det finns inget behov av specialiserad och dyrbar utrustning annan än realtid-PCR-maskin. Vi ytterligare modifierade PCR-reaktion komponent och används SYBR Green SuperMix istället för Taqman. Denna förändring minskar ytterligare kostnader och utgifter som vi eliminerar fluorescensmärkt sond. Andra är vår teknik tillförlitlig och mycket reproducerbar. Vi använde Bcl2 referens genen att normalisera det totala DNA-mängden i motsats till DNA-kvantifieringskit. BCL2 gen användes eftersom: 1) denna gen inte är belägen på Y-kromosomen. Därför är dess expression inte påverkas av manlig donatorcellen engraftment. 2). BCL2 är inte reglerad enligt gällande transplantation villkoren. Som shegen i figur 1, alstrar Bcl2 genen en tillförlitlig och mycket konsekvent kontroll för total DNA-laddning oberoende av lastade manligt DNA belopp. Zfy1 är ett zinkfinger gen inom testiklar bestämmande region 12 och ligger på Y-kromosomen. Det har rapporterats att genuttryck nivån Zfy1 motsvarar väl mängden av manliga cell DNA i en mus transplantation modell 8. Det tredje, är vår PCR-baserad teknik mycket känslig och kan detektera inympning donatorcellen till <1%. Vidare, kan proverna förvaras under lång tid för senare analys. I motsats kräver konventionella flödescytometri-baserad metod omedelbar provbearbetning. Slutligen är vår teknik musstam oberoende och kan användas för genetisk bakgrund som saknar väl definierade ytmarkörer att separera givarceller från mottagarceller. Detta är den viktigaste fördelen med denna metod.
Enligt vår nuvarande experimentell tillstånd (donator / competiteller förhållandet är 5/2), observerade vi omkring 80-90% donator inympning vid 16 veckor med användning av PCR-baserad metod. Våra data är ganska jämförbara med konventionell flödescytometri baserade-metod som visade ~ 95% engraftment donatorcellen vid 16 veckor efter transplantation med givare (CD45.2) / konkurrent (CD45.1) uppgick vid 04:01 2. Jämfört med den konventionella metoden som använder markör cellytan för att detektera givarceller i recipientmöss, är den största nackdelen med vår metod oförmågan att analysera engraftment i olika subpopulationer av blodceller såsom i B-celler, T-celler eller granulocyter. Men, om det behövs, är det möjligt att samla varje population av celler med användning av cellsortering teknik och sedan utsätta proverna för RT-PCR för att bestämma bidraget donatorcellen i varje cellpopulation. Eftersom donatorcellen engraftment har beräknats baserat på standardkurvan är provet avläsning helt beroende av lutningen och y-skärningspunkt av standardkurvan. Det är möjligt att vi kan få ut-range READOUT (dvs. över 100% av engraftment). Dock kan dessa "falska positiva eller falska negativa" resultat undvikas om: 1) isolering av DNA förfaranden för testade prover och standardprov kurva är identiska, och 2) det valda området standardkurva ligger nära den förväntade provet avläsning. Dessutom, eftersom det kan finnas skillnader i varje PCR-reaktion och kalibrering status PCR-maskin, bör standardkurva prov inkluderas i varje PCR-platta för att undvika variationer mellan varje PCR-reaktion.
Slutligen valideras vi vår teknik använder våra Pim triple KO möss. I överensstämmelse med tidigare rapport 13, fann vi att givare HSCs från Pim triple KO-möss är defekta för att återupprätta letalt bestrålade mottagare möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inga konkurrerande ekonomiska intressen att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Charles Greenberg för användning av sin realtids-PCR maskin. Detta arbete stöds av Musc Hollings Cancer Center Startup Fund, Hollings Cancer Center ACS IRG, ASCO Conquer Cancerfonden Award Karriärutveckling, NIH 1K08HL 103.780-01A1, och NIH 3P30CA138313-01S3. Innehållet är endast ansvar författarna och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institutes of Health eller andra medel finansiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30255.01 | |
| FBS | Invitrogen | 16140-017 | Heat inactivated |
| Ammonium chloride | MP Biomedicaals | 194806 | |
| Potassium Bicarbonate | Fisher | P184-500 | |
| QIAamp DNA Blood minikit | Qiagen | 51106 | |
| Cell strainer | BD bioscience | ||
| iQ SYBR Green supermix | Biorad | 170-8882 | |
| iQ5 real time PCR machine | Biorad | ||
| Spectra photometer | Nanodrop ND-1000 | ND-1000 |
References
- McCulloch, E. A., Till, J. E. The radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells, determined by quantitative marrow transplantation into irradiated mice. Radiat. Res. 13, 115-125 (1960).
- Xiao, N., et al. Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress. Blood. 119, 4898-4907 (2012).
- Kang, Y., Chen, B. J., Deoliveira, D., Mito, J., Chao, N. J. Selective enhancement of donor hematopoietic cell engraftment by the CXCR4 antagonist AMD3100 in a mouse transplantation model. PLoS One. 5, e11316 (2010).
- Sadeghi, B., et al. GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice. Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).
- Taketo, M., et al. FVB/N: an inbred mouse strain preferable for transgenic analyses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2065-2069 (1991).
- Morisaki, H., et al. Genotypic analysis using a Y-chromosome-specific probe following bone marrow transplantation. Am. J. Hematol. 27, 30-33 (1988).
- Lo, Y. M., et al. Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis. Am. J. Hum. Genet. 62, 768-775 (1998).
- Byrne, P., et al. Chimerism analysis in sex-mismatched murine transplantation using quantitative real-time PCR. Biotechniques. 32, 279-280 (2002).
- Ma, X., et al. Contribution of recipient-derived cells in allograft neointima formation and the response to stent implantation. PLoS One. 3, e1894 (2008).
- Bosio, E., et al. A comparison between real-time quantitative PCR and DNA hybridization for quantitation of male DNA following myoblast transplantation. Cell Transplant. 13, 817-821 (2004).
- Merchant, A., Joseph, G., Wang, Q., Brennan, S., Matsui, W. Gli1 regulates the proliferation and differentiation of HSCs and myeloid progenitors. Blood. 115, 2391-2396 (2010).
- Nagamine, C. M., Chan, K., Hake, L. E., Lau, Y. F. The two candidate testis-determining Y genes (Zfy-1 and Zfy-2) are differentially expressed in fetal and adult mouse tissues. Genes & development. 4, 63-74 (1990).
- Grundler, R., et al. Dissection of PIM serine/threonine kinases in FLT3-ITD-induced leukemogenesis reveals PIM1 as regulator of CXCL12-CXCR4-mediated homing and migration. J. Exp. Med. 206, 1957-1970 (2009).
