Summary
दाता कोशिका engraftment निर्धारण माउस अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण मॉडल है कि अच्छी तरह से परिभाषित phenotypical मार्करों की कमी में एक चुनौती प्रस्तुत करता है. हम एक पद्धति का वर्णन करने के लिए महिला प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ता चूहों में पुरुष दाता सेल engraftment यों. इस विधि HSC कार्यों के अध्ययन के लिए सभी माउस उपभेदों में इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
Murine अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण मॉडल hematopoietic स्टेम सेल (HSC) कार्यों और निर्धारित जीन / अणुओं है कि HSCs को विनियमित मापने में एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करते हैं. इन प्रत्यारोपण मॉडल प्रणाली में, HSCs की समारोह में इन कोशिकाओं की पैवंद करना और reconstitute lethally विकिरणित प्राप्तकर्ता चूहों की क्षमता से निर्धारित होता है. आमतौर पर, दाता सेल / योगदान engraftment दाता विशिष्ट सेल सतह प्रवाह cytometry का उपयोग प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी द्वारा मापा जाता है. हालांकि, इस पद्धति भारी विशिष्टता और सेल सतह मार्कर के प्राप्तकर्ता उत्पन्न कोशिकाओं है, जो सभी माउस उपभेदों के लिए उपलब्ध नहीं हो सकता से दाता व्युत्पन्न कोशिकाओं को अलग करने की क्षमता पर निर्भर करता है. बाजार में आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस उपभेदों के विभिन्न पृष्ठभूमि को ध्यान में रखते हुए, इस कोशिका की सतह / प्रवाह cytometry आधारित पद्धति माउस उपभेदों कि congenic प्राप्तकर्ता ce से अलग दाता कोशिकाओं के लिए अच्छी तरह से परिभाषित सतह मार्कर की कमी में विशेष रूप से महत्वपूर्ण सीमाएँ हैंLLS. यहाँ, हम एक पीसीआर आधारित तकनीक प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ता चूहों में दाता सेल engraftment / योगदान निर्धारित की सूचना दी. हम lethally विकिरणित congenic मादा चूहों पुरुष दाता अस्थि मज्जा HSCs प्रतिरोपित. परिधीय रक्त के नमूनों के अलग अलग समय बिंदुओं के बाद प्रत्यारोपण में एकत्र किए गए. अस्थि मज्जा के नमूनों प्रयोगों के अंत में प्राप्त किया गया. जीनोमिक डीएनए अलग किया गया था और वाई गुणसूत्र विशिष्ट जीन, Zfy1, मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग प्रवर्धित किया गया था. महिला प्राप्तकर्ता चूहों में पुरुष दाता व्युत्पन्न कोशिकाओं के engraftment पुरुष बनाम महिला DNAs के ज्ञात प्रतिशत के साथ मानक वक्र के खिलाफ गणना की गई. Bcl2 कुल डीएनए राशि सामान्य के लिए एक संदर्भ के लिए जीन के रूप में इस्तेमाल किया गया था. हमारे डेटा का सुझाव दिया है कि इस दृष्टिकोण मज़बूती दाता कोशिका engraftment निर्धारित करता है और murine अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के मॉडल में hematopoietic सेल पुनर्गठन मापने में उपयोगी है, अभी तक सरल तरीका प्रदान करता है. हमारे विधि नियमित ज्यादातर प्रयोगशालाओं में किया जा सकता है क्योंकि कोईप्रवाह cytometry के रूप में इस तरह के महंगे उपकरण की आवश्यकता है.
Introduction
Murine अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण (बीएम) मॉडल 1 1 1960 के दशक में विकसित किया गया था. इस मॉडल को बड़े पैमाने पर किया गया है दाता hematopoietic स्टेम सेल (HSC) एक मेजबान प्राप्तकर्ता माउस में जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए प्रयोग किया जाता है. Murine अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण मॉडल हमें HSC कार्यों और उनके विनियमन पर बहुमूल्य ज्ञान के साथ प्रदान की गई है और HSC अनुसंधान में अपरिहार्य है. Allogeneic C57Bl/6J / H2b Balb सी H2d है या जैसे - B6.SJL CD45.1 CD45.2 C56Bl/6J congenic प्रत्यारोपण मॉडल की तरह अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण मॉडल कई प्रयोगशालाओं में किया जाता है HSC 2 गतिविधि पर जीन समारोह का अध्ययन करने के लिए, प्रभाव की भ्रष्टाचार बनाम मेजबान रोग (GvHD) 4 जैसे HSC 3 समारोह या प्रत्यारोपण से संबंधित रोगों पर दवा उपचार.
MHC haplotype या CD45.1 के रूप में सेल सतह मार्करों आमतौर पर प्राप्तकर्ता उत्पन्न कोशिकाओं से भेद दाता व्युत्पन्न कोशिकाओं के लिए उपयोग किया जाता है. C57Bl/6J H2b, CD45.2 H2d और B6.SJL CD45.1 अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण में सबसे अधिक इस्तेमाल किया माउस उपभेदों हैं क्योंकि दाता कोशिका योगदान को आसानी से प्रवाह cytometry CD45.1 बनाम CD45.2 या बनाम H2b मापने द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है H2d. हालांकि, / FVB 5 न्यू जर्सी और C3H के रूप में कई अन्य उपभेदों भी अक्सर अनुवांशिक इंजीनियर ट्रांसजेनिक या पीटा चूहों उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया. इन चूहों को एक जन्मजात लाइन backcrossed किया जा सकता है और एक मिश्रित आनुवंशिक पृष्ठभूमि / MHC में बनाए रखा. इन मामलों में, दाता सेल engraftment और HSC समारोह का निर्धारण करने के लिए मुश्किल हो सकता है के रूप में दाता विशिष्ट कोशिका की सतह मार्करों उपलब्ध नहीं हो सकता सकता है.
वाई गुणसूत्र विशिष्ट डीएनए जांच का प्रयोग करने के लिए सेक्स बेमेल अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण में दक्षिणी धब्बा द्वारा दाता पुरुष कोशिकाओं का पता लगाने के पहले डॉ. Miwa 6 समूह द्वारा विकसित किया गया था. फिर, एक क्षेत्र सेक्स निर्धारण वाई के लिए वास्तविक समय पीसीआर के लिए एक सटीक और अति विशिष्ट मा quantitate विधि होना पाया गयामातृ रक्त 7 प्रणाली में ले भ्रूण कोशिकाओं. इस अवधारणा डॉ. Schwarzenberger समूह द्वारा एक murine अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के मॉडल में एक वास्तविक समय पीसीआर तकनीक दाता सेल engraftment 8 निर्धारित के विकास के लिए अनुकूलित किया गया था. हम आगे दाता / FVB NJ माउस अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण मॉडल में सेल engraftment की माप के लिए इस विधि को संशोधित. इस विधि वर्तमान में बड़े पैमाने पर HSC जीव विज्ञान में Pim1 kinase की भूमिका का अध्ययन करने के लिए हमारे समूह में उपयोग किया.
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Protocol
1. अस्थि मज्जा सेल अलगाव
- पुरुष दाता / FVB NJ चूहों और महिला / FVB NJ सीओ 2 गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद विधि का उपयोग चूहों euthanize. महिला / FVB NJ अस्थि मज्जा की कोशिकाओं प्रतिस्पर्धी कोशिकाओं के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा.
- छोटे कैंची और संदंश का प्रयोग, चूहों से बाहर है और femurs tibiaes काटना और उन्हें एक 60 मिमी टिशू कल्चर 5% गर्मी निष्क्रिय FBS साथ 6 ठंडा मिलीलीटर RPMI1640 युक्त पकवान में जगह. Kimwipe ऊतक का उपयोग करने के लिए मांसपेशियों और अन्य ऊतकों को हटाने के लिए. प्रत्येक हड्डी शाफ्ट के दोनों सिरों से पकवान में काटें.
- 3 सीसी सिरिंज पर 23g सुई के साथ हड्डी के अंत कनेक्ट, बाहर RPMI1640 के साथ 5% गर्मी निष्क्रिय FBS के साथ डिश में अस्थि मज्जा फ्लश. दोहराया एक ही सुई का प्रयोग आकांक्षाओं से अस्थि मज्जा ऊतकों विसमूहन. 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब स्थानांतरण सेल निलंबन.
- नीचे 400 XG पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को स्पिन तैरनेवाला निकालने के लिए, कमरे के तापमान लाल रक्त कोशिका lysis बफर के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend (155 मिमी पीotassium बिकारबोनिट, 10 मिमी अमोनियम क्लोराइड, EDTA, पीएच 7.4 = 0.1 मिमी) और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं तो 5% गर्मी निष्क्रिय FBS साथ RPMI 1640 के 5-10 मिलीलीटर जोड़ने.
- एक सेल झरनी के माध्यम से कोशिकाओं गुजरती हैं. एक नया ट्यूब के माध्यम से प्रवाह ले लीजिए. 400 x छ में 5 मिनट के लिए नीचे स्पिन. तैरनेवाला निकालें, सेल गोली किसी भी लाल रंग शामिल नहीं होना चाहिए. लाल रंग के अभाव में लाल रक्त कोशिकाओं की एक पूरी तरह हटाने का संकेत भी है. सेल गोली Resuspend RPMI1640 की 10 मिलीलीटर में 5% गर्मी निष्क्रिय FBS के साथ. धीरे सुनिश्चित करने के लिए भंवर सेल निलंबन पूरी तरह से एक समान है. एक अशेष भाजक लो और एक hemacytometer में कोशिकाओं गिनती. कितना अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण और अशेष भाजक पर्याप्त कक्षों के लिए आवश्यक कोशिकाओं की मात्रा और गणना प्रतियोगी महिला कोशिकाओं के साथ 05:02 के अनुपात में पुरुष दाता कोशिकाओं मिश्रण. 400 XG पर 5 मिनट के लिए नीचे स्पिन, पीबीएस के साथ धोने, दाता कोशिकाओं के अंतिम एकाग्रता के साथ पीबीएस में resuspend 5 × 10 6 मिलीग्राम / और प्रतियोगी कोशिकाओं 2 × 10 6
2. प्रतिस्पर्धी अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण
- चमकाना अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण से पहले 4-6 11Gy घंटा की एक खुराक में 137Cs गामा किरणों के रेडिएटर के साथ महिला प्राप्तकर्ता चूहों (उम्र के 8-12 wks).
- एक माउस restrainer में विकिरणित मादा चूहों रखें. ऐसी है कि प्रत्येक माउस 5 × 10 5 दाता कोशिकाओं और 2 × 10 5 प्रतियोगी अस्थि मज्जा की कोशिकाओं को प्राप्त कुल मात्रा 0.1 मिलीलीटर में मिश्रित पूंछ नस के माध्यम से दाता प्रतियोगी कोशिकाओं इंजेक्षन.
3. नमूना संग्रह
अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के बाद सप्ताह के जोड़े, संज्ञाहरण शर्त के तहत महिला प्राप्तकर्ता माउस से परिधीय रक्त के नमूने (~ 50 μl) रेट्रो कक्षीय खून बह रहा द्वारा इकट्ठा. नमूने EDTA लेपित ट्यूबों में एकत्र कर रहे हैं. प्रयोग के अंत में बी.एम. नमूने भी एकत्र किया जा सकता है, आम तौर पर कम से कम 4 महीने के बाद प्रत्यारोपण, पिछले के रूप में एक ही प्रक्रियाओं का वर्णन (1 चरण) के साथ है, आमतौर पर 20-40%1 टिबिअ बी.एम. कोशिकाओं के डीएनए के लिए पर्याप्त राशि बनाने के लिए पर्याप्त हैं. रक्त या बी.एम. उम्र से मिलान सामान्य महिला और पुरुष चूहों के नमूने भी मानक वक्र तैयार करने के लिए एकत्र होते हैं.
4. जीनोमिक डीएनए अलगाव
- प्रत्येक रक्त के नमूने के लिए कमरे के तापमान आरबीसी lysis बफर के 4 × मात्रा (~ 200 μl) जोड़ें. अच्छी तरह मिक्स और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़ें, तो नीचे स्पिन lysed आरबीसी की सबसे को दूर करने के लिए.
- डीएनए एक रक्त डीएनए निष्कर्षण किट (QIAmp डीएनए रक्त निष्कर्षण किट) का उपयोग करते हुए पृथक करें. पूर्व गर्म 37 में क्षालन बफर (एई) ° C eluted डीएनए की उपज बढ़ाने के. मानक वक्र के लिए पुरुष और महिला DNAs इसी तरह से अलग कर रहे हैं.
- (वैकल्पिक) जीनोमिक डीएनए आगे हो सकता है या शुद्ध कर सकते हैं 3 एम सोडियम एसीटेट (5.5 पीएच =) की उपस्थिति में EtOH वर्षण की संभावना पद्धति का उपयोग करके ध्यान केंद्रित किया है. डीएनए छर्रों विश्लेषण के लिए तो तुरंत 40-50 μl आसुत जल में resuspended या भविष्य के उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत.
- डीएनए concentr उपायसमझना Nanodrop ND 1000 स्पेक्ट्रा photometer साथ. आयुध डिपो 1.8-2.0 के बीच 260/280 के साथ नमूने आगे के विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है.
- के साथ डीएनए DNAase मुक्त एच 2 हे पतला 50 μl की कुल मात्रा में 4ng/μl.
5. मानक वक्र तैयार
एनजी 4 / μl एक एकाग्रता पुरुष डीएनए और महिला डीएनए पतला, और डीएनए Table1 अनुसार मिश्रण
| महिला पृष्ठभूमि में पुरुष डीएनए का% | 4ng/μl पुरुष डीएनए की मात्रा (μl) | 4ng/μl महिला डीएनए की मात्रा (μl) | कुल मात्रा (μl) |
| 0.2 | 1 | 499 | 500 |
| 0.5 | 1 | 199 | 200 |
| 2.5 | 5 | 195 | 200 |
| 12.5 | 25 | 175 | 200 |
| 50 | 100 | 100 | 200 |
| 87.5 | 175 | 25 | 200 |
| 100 | 200 | 0 | 200 |
तालिका 1 मानक वक्र के लिए नमूना तैयार. सामान्य पुरुष और महिला / 8-12wks की उम्र में FVB NJ चूहों बलिदान किया गया. रक्त और बीएम कोशिकाओं एकत्र किए गए थे. पुरुष कोशिकाओं और महिला कोशिकाओं से DNAs पृथक किया गया और 4ng/μl की एकाग्रता में फिर से निलंबित कर दिया. पुरुष और महिला DNAs विभिन्न अनुपात में मिलाया गया डीएनए मानक नमूना मिश्रण उत्पन्न.
6. वास्तविक समय पीसीआर
- SYBR ग्रीन supermix अभिकर्मक प्राइमरों और जीनोमिक डीएनए के साथ मिश्रण से पीसीआर प्रतिक्रिया प्लेट सेट. प्रतिक्रिया मात्रा (20 μl) प्रत्येक और प्रत्येक प्रतिक्रिया में रक्त कोशिका जीनोमिक डीएनए (4ng/μl x5 μl = 20 एनजी) के 5 μl प्राइमर के 400 एनएम शामिल हैं. डीएनए sampलेस और मानकों तीन प्रतियों में स्थापित किया गया. प्राइमरों के दृश्यों 2 तालिका में दिखाया जाता है.
| जीन नाम | आगे | उल्टा |
| Bcl2 | 5'-AAGCTGTCACAGAGGGGCTA | 5'-CAGGCTGGAAGGAGAAGATG |
| Zfy1 | 5-TGGAGAGCCACAAGCTAACCA | 5'-CCCAGCATGAGAAAGATTCTTC |
तालिका 2 RT-पीसीआर murine Bcl2 और Zfy1 के लिए प्राइमर अनुक्रम.
- निम्नलिखित शर्तों के साथ पीसीआर Biorad iQ5 पीसीआर मशीन का उपयोग कर प्रतिक्रिया प्रदर्शन: 95 ° C 3 मिनट, 42 95 के प्रवर्धन चक्र ° सी 10 सेकंड के लिए, 58 ° 25 सेकंड और 15 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के लिए सी, पिघलने वक्र द्वारा पीछा कदम.
- जैव रेड iQ5 2.1 मानक संस्करण ऑप्टिकल प्रणाली द्वारा साइकिल दहलीज मूल्यों (सीटी) प्राप्त करते हैं. गणना δCt (Zfy1 सीटी </ Bcl2> सीटी समर्थन मूल्य), और Zfy1 अभिव्यक्ति के स्तर 2-δ सीटी के मूल्य के रूप में गणना की है.
- प्रत्येक प्रतिक्रिया ज्ञात पुरुष / महिला मानक मिश्रण से 2-δCt पढ़ने का उपयोग श्रृंखला के लिए मानक घटता स्थापना. मानक घटता रेखीय प्रतिगमन फिटिंग के साथ मिश्रण में जाना जाता% पुरुष डीएनए triplicates 2-δCt के मूल्य मतलब की साजिश रचने के द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं.
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Representative Results
चित्रा 1 और 2 मानक घटता के उदाहरण दिखाया पुरुष डीएनए के प्रतिशत के खिलाफ 2-δCt के मतलब मूल्यों के साथ साजिश रची चित्रा 1A के Bcl2 और 78.5 डिग्री सेल्सियस और 88.5 डिग्री सेल्सियस पर Zfy1 स्थानीयकृत amplicons के लिए विशिष्ट तापमान के पिघलने से पता चला है, क्रमशः. Bcl2 प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया में भरी हुई डीएनए की कुल राशि को सामान्य के लिए एक संदर्भ के लिए जीन के रूप में प्रयोग किया जाता है. Bcl2 प्रत्येक मानक नमूना के लिए प्रवर्धन curves (प्रवेश दृश्य) प्रत्येक स्वतंत्र पुरुष डीएनए एकाग्रता का दूसरे के साथ विलय करने के लिए, लोड डीएनए (चित्रा 1B) के बराबर राशि का संकेत. हालांकि, Zfy1 प्रवर्धन वक्र पुरुष डीएनए के नमूने में बढ़ती हुई राशि (चित्रा 1C) के साथ छोड़ दिया करने के लिए चले गए. हमारे विधि को मान्य करने के लिए, हम प्रतिरोपित WT बनाम पिम ट्रिपल पीटा चूहों (TKO) से अलग अलग समय बिंदुओं के बाद प्रत्यारोपण में बी.एम. कोशिकाओं को प्राप्त चूहों में पुरुष दाता सेल engraftment का परीक्षण किया. दोनों परिधीय (6wks) रक्त और बीएम (16wks) और नमूने w अरे का विश्लेषण किया. पिम TKO चूहों से HSCs lethally विकिरणित चूहों (एक, एन एट अल., संशोधन के तहत पांडुलिपि) के पुनर्गठन में दोष है. जैसी कि उम्मीद थी, प्राप्तकर्ता पिम TKO कोशिकाओं के साथ प्रतिरोपित चूहों WT कोशिकाओं (चित्रा 3) के साथ प्रतिरोपित चूहों की तुलना में पुरुष की कोशिकाओं के एक बहुत कम प्रतिशत था.
चित्रा 1 (ए) अलग पुरुष डीएनए प्रतिशत के साथ प्रतिनिधि कई नमूने से पिघलने वक्र. 78.5 में चोटी Bcl2 के प्रवर्धन इंगित करता है, जबकि 88.5 में चोटी डिग्री सेल्सियस के प्रवर्धन Zfy-1 को इंगित करता है. चक्र सीमा: अलग (बी) और Zfy1 Bcl2 (सी), सीटी के लिए पुरुष डीएनए प्रतिशत के साथ कई नमूने से प्रतिनिधि प्रवर्धन वक्र.= "Http://www.jove.com/files/ftp_upload/50193/50193fig1large.jpg" लक्ष्य => "_blank" बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2. RT-पीसीआर पुरुष डीएनए प्रतिशत के लिए मानक वक्र. पुरुष और महिला डीएनए अस्थि मज्जा की कोशिकाओं से प्राप्त मिश्रण के नमूने (20 μl कुल मात्रा में 20 एनजी डीएनए) के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित RT-पीसीआर के लिए प्रोसेस किया गया. व्यक्ति के नमूनों के लिए δCt का मतलब (सीटी Zfy1 सीटी Bcl2) मूल्यों की गणना किया गया और 2 δ सीटी (शाफ़्ट) पुरुष डीएनए प्रतिशत के खिलाफ साजिश रची थे (X-अक्ष) (0.2% से 100% से लेकर रेखीय प्रतिगमन के साथ) फिटिंग. R2 दृढ़ संकल्प के गुणांक का प्रतिनिधित्व करता है.
चित्रा 3 प्रतियोगी अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण अनुभव.riments. 5 x 10 5 पुरुष WT या उम्र 2 x 10 5 महिला प्रतियोगी अस्थि मज्जा की कोशिकाओं के साथ पुरुष ट्रिपल पिम (TKO) को चूहों मिलान से कुल बी.एम. कोशिकाओं विकिरणित महिला मेजबान में प्रत्यारोपित किया गया. 16 wks में परिधीय रक्त (पंजाब) 6 सप्ताह और बीएम काइमेरावाद में काइमेरावाद पोस्ट प्रत्यारोपण RT-पीसीआर द्वारा पुरुष डीएनए के प्रतिशत के आधार पर अनुमान लगाया गया था के रूप में प्रोटोकॉल में decried (* <0.05 पी, पी ** 0.01 <).
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Discussion
हमारे वर्तमान अध्ययन के उद्देश्य के लिए दर्शकों को एक पीसीआर आधारित एक प्रतिस्पर्धी murine अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण के मॉडल में दाता सेल engraftment यों तकनीक प्रदान करने के लिए है. कई अध्ययनों RT-पीसीआर प्रत्यारोपण 9-10 मॉडल में दाता कोशिकाओं का पता लगाने का उपयोग करने के लिए सूचित किया गया है. पहले डॉ. Schwarzenberger समूह एक murine अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण का उपयोग करने के लिए वास्तविक समय पीसीआर y गुणसूत्र विशिष्ट 8 बढ़ाना मॉडल विकसित किया है. इस विधि-1 समारोह Gli HSC 11 गतिविधि में अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. हम तो आगे प्रोटोकॉल संशोधित और visualized प्रारूप में एक विस्तृत, कदम दर कदम प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रदान की. हमारे प्रोटोकॉल की कल्पना प्रस्तुति दर्शकों हमारे प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए आसानी से की अनुमति देता है. हम भी हमारे पीसीआर बी.एम. बनाम परिधीय रक्त से नमूने डीएनए से जीनोमिक डीएनए का उपयोग कर परिणाम की तुलना में. बी.एम. और रक्त के नमूनों से दाता engraftment डेटा मूल रूप से संगत कर रहे हैं, लेकिन, आमतौर पर कम भिन्नता बी.एम. के नमूनों में पाया गया था. यह वह जगह हैसंभावना है कि रक्त के नमूनों में / जीनोमिक डीएनए की शुद्धता और गुणवत्ता के साथ समझौता कर सकता है परिधीय रक्त में आरबीसी lysis के बाद अवशिष्ट हीमोग्लोबिन कारण.
वहाँ हमारे पीसीआर आधारित तकनीक के साथ कई फायदे दाता सेल engraftment यों. सबसे पहले, हमारी तकनीक प्रयोगशालाओं की अधिकांश में किया जा सकता है. विशेष और महंगी वास्तविक समय पीसीआर मशीन के अलावा अन्य उपकरणों के लिए कोई ज़रूरत नहीं है. हम आगे पीसीआर प्रतिक्रिया घटक संशोधित और TaqMan के बजाय SYBR ग्रीन supermix इस्तेमाल किया. यह परिवर्तन आगे लागत और खर्च के रूप में हम फ्लोरोसेंट लेबल जांच को खत्म करने को कम कर देता है. दूसरा, हमारे तकनीक विश्वसनीय और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है. हम Bcl2 संदर्भ जीन का इस्तेमाल करने के लिए कुल डीएनए रूप में डीएनए quantitation किट विरोध राशि सामान्य. 1) इस जीन Y-गुणसूत्र पर स्थित नहीं है: Bcl2 जीन वजह से इस्तेमाल किया गया था. इसलिए, अपनी अभिव्यक्ति पुरुष दाता सेल engraftment से प्रभावित नहीं है. ) 2. वर्तमान प्रत्यारोपण की शर्तों के तहत Bcl2 विनियमित नहीं है. श के रूप मेंचित्रा 1 में अपनी, Bcl2 जीन कुल डीएनए लोड पुरुष डीएनए राशि की स्वतंत्र लोड करने के लिए एक विश्वसनीय और अत्यधिक संगत नियंत्रण पैदा करता है. Zfy1 12 वृषण क्षेत्र का निर्धारण करने के भीतर एक जस्ता उंगली जीन है और वाई गुणसूत्र पर स्थित है. यह बताया गया है कि Zfy1 के जीन की अभिव्यक्ति स्तर एक माउस प्रत्यारोपण 8 मॉडल में पुरुष सेल DNAs की राशि के लिए अच्छी तरह से मेल खाती है. तीसरा, हमारे पीसीआर आधारित तकनीक बेहद संवेदनशील है, और दाता सेल engraftment <1% का पता लगा सकते हैं. इसके अलावा, नमूने बाद में विश्लेषण के लिए लंबे समय के लिए भंडारित किया जा सकता है. इसके विपरीत, पारंपरिक प्रवाह cytometry आधारित विधि तत्काल नमूना प्रसंस्करण की आवश्यकता है. अंत में, हमारी तकनीक माउस स्वतंत्र तनाव है और आनुवंशिक पृष्ठभूमि है कि प्राप्तकर्ता कोशिकाओं से अलग दाता कोशिकाओं के लिए अच्छी तरह से परिभाषित सतह मार्कर का अभाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह इस विधि का सबसे महत्वपूर्ण लाभ है.
हमारे वर्तमान प्रयोगात्मक हालत के तहत (दाता / competitया अनुपात 2/5), हम चारों ओर 16 सप्ताह में 80-90% दाता engraftment पीसीआर आधारित पद्धति का उपयोग कर मनाया. हमारे डेटा काफी पारंपरिक, प्रवाह cytometry आधारित तरीका है कि दाता के साथ 16 सप्ताह के बाद प्रत्यारोपण (CD45.2) / प्रतियोगी (CD45.1) 2 4:01 पर अनुपात में ~ 95% दाता कोशिका engraftment दिखाया के साथ तुलना कर रहे हैं. पारंपरिक विधि है कि प्राप्तकर्ता चूहों में दाता कोशिकाओं का पता लगाने के लिए सेल सतह मार्कर का उपयोग करता है की तुलना में, हमारे विधि के प्रमुख नुकसान बी कोशिकाओं, टी कोशिकाओं या granulocytes में के रूप में रक्त कोशिकाओं के विभिन्न subpopulations में engraftment का विश्लेषण करने में असमर्थता है. हालांकि, अगर जरूरत है, यह संभव है कोशिकाओं की प्रत्येक आबादी एकत्र सेल छँटाई तकनीक और फिर विषय RT-पीसीआर के लिए नमूने का उपयोग करने के लिए दाता प्रत्येक सेल आबादी में सेल योगदान का निर्धारण. चूंकि दाता कोशिका engraftment मानक वक्र के आधार पर गणना की गई है, नमूना readout ढलान और मानक वक्र के y अवरोधन पर पूरी तरह से निर्भर है. यह संभव है कि हम बंद रेंज की वजह विनिर्माण कर रहे मिल सकता हैdout (engraftment के 100 से अधिक यानी%). हालांकि, अगर इन "झूठी सकारात्मक या नकारात्मक झूठी" परिणाम से बचा जा सकता है: 1) नमूनों का परीक्षण और मानक वक्र के नमूने के लिए डीएनए अलगाव प्रक्रियाओं समान हैं, और 2) मानक वक्र के चुना रेंज की उम्मीद नमूना readout करीब है. इसके अलावा, के बाद से वहाँ प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया में और पीसीआर मशीन के अंशांकन स्थिति में मतभेद हो सकता है, मानक वक्र नमूने प्रत्येक पीसीआर थाली में शामिल किया जाना चाहिए प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया के बीच बदलाव से बचने के.
अंत में, हम हमारे हमारे पिम ट्रिपल KO चूहों तकनीक का उपयोग मान्य. लगातार पिछले 13 रिपोर्ट के साथ, हमने पाया कि पिम ट्रिपल KO चूहों से दाता HSCs lethally विकिरणित प्राप्तकर्ता चूहों के पुनर्गठन में दोषपूर्ण हैं.
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Disclosures
हम कोई वित्तीय हितों का खुलासा करने के लिए प्रतिस्पर्धा है.
Acknowledgments
हम अपने वास्तविक समय पीसीआर मशीन के उपयोग के लिए डॉ. चार्ल्स Greenberg धन्यवाद. यह काम MUSC Hollings कैंसर केंद्र स्टार्टअप फंड, Hollings कैंसर केंद्र ACS IRG, ASCO जीतना कैंसर फाउंडेशन कैरियर विकास पुरस्कार, एनआईएच +१,०३,७८० 01A1 1K08HL, और 3P30CA138313-01S3 NIH द्वारा समर्थित है. सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और स्वास्थ्य या अन्य वित्तपोषण एजेंट के राष्ट्रीय संस्थानों के अधिकारी विचार जरूरी नहीं प्रतिनिधित्व.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30255.01 | |
| FBS | Invitrogen | 16140-017 | Heat inactivated |
| Ammonium chloride | MP Biomedicaals | 194806 | |
| Potassium Bicarbonate | Fisher | P184-500 | |
| QIAamp DNA Blood minikit | Qiagen | 51106 | |
| Cell strainer | BD bioscience | ||
| iQ SYBR Green supermix | Biorad | 170-8882 | |
| iQ5 real time PCR machine | Biorad | ||
| Spectra photometer | Nanodrop ND-1000 | ND-1000 |
References
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