Summary
Bestemme donorcellen engraftment en utfordring i mus benmargstransplantasjon modeller som mangler veldefinerte fenotypisk markører. Vi beskrev en metode for å kvantifisere mannlig donor celle engraftment i kvinnelige transplantasjon mottaker mus. Denne metoden kan bli brukt i alle muselinjer for studiet av HSC funksjoner.
Abstract
Murine benmargstransplantasjon modellene gir et viktig verktøy for å kunne måle stamcelletransplantasjon (HSC) funksjoner og bestemme gener / molekyler som regulerer HSCs. I disse transplantasjon modellsystemer, funksjonen av HSCs bestemmes av evnen til disse cellene til engraft og rekonstituere lethally bestrålte mottaker mus. Vanlig er donorcellen bidrag / engraftment målt av antistoffer mot donor-spesifikke celleoverflatereseptorer proteiner ved hjelp av flow cytometri. Imidlertid avhenger denne metoden tungt på spesifisitet og evne til celleoverflaten markør å differensiere donor-avledede celler fra mottaker-oppsto celler, som ikke er tilgjengelige for alle muselinjer. Vurderer de ulike bakgrunner av genmodifiserte mus stammer i markedet, har denne celleoverflaten / flowcytometri-basert metode betydelige begrensninger spesielt i muselinjer som mangler veldefinerte overflate markører for å skille donor celler fra congenic mottaker ceLLS. Rapporterte vi en PCR-basert teknikk for å bestemme donorcellen engraftment / bidrag i transplantasjoner mottaker mus. Vi transplantert mannlige donor benmarg HSCs til livsfarlige bestrålte congenic hunnmus. Perifert blod prøver ble samlet ved ulike tidspunkt etter transplantasjonen. Beinmargsprøver ble oppnådd på slutten av forsøkene. Genomisk DNA ble isolert og Y kromosomet spesifikt gen, Zfy1, ble amplifisert ved hjelp av kvantitativ Sanntids PCR. Engraftment av mannlige donor-avledet celler i de kvinnelige mottaker mus ble beregnet mot standardkurve med kjent andelen mannlige vs kvinnelige DNA. BCL2 ble brukt som en referanse genet å normalisere det totale DNA beløpet. Våre data antydet at denne tilnærmingen pålitelig bestemmer donorcellen engraftment og gir et nyttig, men likevel enkel metode å måle blodkreft celle rekonstituering i murine benmargstransplantasjon modeller. Vår fremgangsmåte kan rutinemessig utført i de fleste laboratorier fordi ingenkostbart utstyr slik som strømningscytometri er nødvendig.
Introduction
Murine benmarg (BM) transplantasjon modellen ble først utviklet i 1960 en. Denne modellen har vært mye brukt for å studere donor stamcelletransplantasjon (HSC) biologi i en rekke mottaker mus. Murine benmargstransplantasjon modellen har gitt oss verdifull kunnskap om HSC funksjoner og deres regulering og er uunnværlig i HSC forskning. Allogen benmargstransplantasjon modell som C57Bl/6J H2B-Balb / C H2d eller congenic transplantasjon modell som C56Bl/6J CD45.2-B6.SJL CD45.1 brukes i mange laboratorier for å studere gen-funksjon på HSC aktivitet 2, effekt av medikamentell behandling på HSC funksjon 3 eller transplantasjon relaterte sykdommer som graft-versus-host sykdom (GVHD) 4.
Celleoverflaten markører som MHC haplotype eller CD45.1 blir ofte brukt for å skille donor-avledet celler fra mottaker-stammer celler. C57Bl/6J H2B, CD45.2 H2d og B6.SJL CD45.1 er de mest brukte muselinjer i benmargstransplantasjon fordi donorcellen innsats kan lett vurderes av flowcytometri måle CD45.1 vs CD45.2 eller H2B vs H2d. Men mange andre stammer som FVB / NJ 5 og C3H også ofte brukt til å generere genmodifisert transgene eller knockout mus. Disse musene kan backcrossed til en innavlet linje og vedlikeholdes på en blandet genetisk / MHC bakgrunn. I disse tilfellene kan bestemme donorcellen engraftment og HSC funksjon være vanskelig som donor spesifikke-celle overflate markører ikke kan være tilgjengelige.
Bruke Y-kromosom-spesifikke DNA-probe for å oppdage donor mannlige celler ved Southern blot i sex-feilaktige benmargstransplantasjon ble først utviklet av Dr. Miwa gruppe 6. Deretter ble en real-time PCR for sex-fastsettelse region Y funnet å være en nøyaktig og svært spesifikk metode for å kvantifisere male fosterets celler i mors blod systemet 7. Dette konseptet ble tilpasset av Dr. Schwarzenberger gruppe for utvikling av en real-time PCR teknikk i en murine benmargstransplantasjon modellen til å bestemme donorcellen engraftment 8. Vi ytterligere modifisert denne metoden for måling av donor celle engraftment i FVB / NJ mus benmargstransplantasjon modell. Denne metoden er for tiden mye brukt i vår gruppe for å studere rollen til Pim1 kinase i HSC biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bone Marrow celleisolasjon
- Avlive mannlige donor FVB / NJ mus og kvinnelige FVB / NJ mus med CO 2-metoden etterfulgt av cervical forvridning. Den kvinnelige FVB / NJ benmargceller vil bli brukt som konkurransedyktige celler.
- Bruk små saks og tang, dissekere ut lårben og tibiaes fra mus og plassere dem i en 60 mm vev kultur tallerken med 6 ml iskald RPMI1640 med 5% varmeinaktivert FBS. Bruk kimwipe vev for å fjerne muskler og annet vev. Skjær av begge endene av hver bein aksel i parabolen.
- Koble enden av beinet med 23G nål på 3 cc sprøyte, spyle ut benmarg med RPMI1640 med 5% varmeinaktivert FBS i formen. Disaggregate benmarg vev ved gjentatte ambisjoner med samme nål. Overfør cellesuspensjonen til 15 ml sentrifugerør.
- Spinne ned cellene i 5 min ved 400 x g, Supernatanten fjernes, resuspender cellene i 1 ml romtemperatur røde blodlegemer lyseringsbuffer (155 mM potassium bikarbonat, 10 mM Ammoniumklorid, 0,1 mM av EDTA, PH = 7,4) og inkuber ved romtemperatur i 5 min og deretter legge 5-10 ml RPMI 1640 med 5% varme-inaktivert FBS.
- Pass cellene gjennom en celle sil. Samle strømningen gjennom til et nytt rør. Spinner ned i 5 min ved 400 x g. Supernatanten fjernes, cellepelleten bør ikke inneholde noen rød farge. Fraværet av rød farge indikerer en fullstendig fjerning av røde blodceller. Resuspender cellepelleten i 10 ml av RPMI1640 med 5% varme-inaktivert FBS. Forsiktig vortex å sørge cellesuspensjonen er helt uniform. Ta en delmengde og telle celler i en hemacytometer. Beregne hvor mye volum av celler som trengs for benmargstransplantasjon og alikvoter nok celler og bland mannlige donorceller med konkurrerende kvinnelige celler ved et forhold på 5:2. Spinne ned i 5 min ved 400 xg, vask med PBS, resuspender i PBS med den endelige konsentrasjon av donorceller ved 5 x 10 6 / ml og konkurrent celler ved 2 x 10 6
2. Konkurransedyktige benmargstransplantasjon
- Strålebehandling kvinnelige mottaker mus (8-12 wks av alder) med 137Cs gamma stråler radiator på en enkelt dose av 11Gy 4-6 timer før benmargstransplantasjon.
- Plasser bestrålte hunnmus i en mus restrainer. Injiser blandet donor og konkurrent cellene via halevenen i 0,1 ml totalt volum slik at hver mus mottar 5 x 10 5 donor celler og 2 x 10 5 konkurrent benmargsceller.
3. Prøvetaking
Par uker etter benmargstransplantasjon, samle perifere blodprøver (~ 50 pl) fra kvinnelige mottaker musen ved retro-orbital blødning under narkose tilstand. Er samlet inn EDTA belagt rør. BM prøvene kan også samles ved slutten av eksperimentet, vanligvis minst 4 måneder etter transplantasjonen, med samme fremgangsmåte som tidligere beskrevet (trinn 1), vanligvis 20-40% av1 tibia BM cellene er nok til å gjøre nok mengde DNA. Blod eller BM prøver fra alder matchet normal kvinnelige og mannlige mus er også samlet for å forberede standardkurve.
4. Genomisk DNA Isolasjon
- Tilsett 4 × volum romtemperatur RBC lyseringsbuffer (~ 200 pl) til hver blodprøve. Bland godt og inkuber ved romtemperatur i 5 min. Tilsett 1 ml PBS, deretter spinne ned for å fjerne det meste av de lyserte RBC.
- Isoler DNA ved hjelp av en blod DNA-ekstraksjon kit (QIAmp DNA Blood utvinning kit). Forvarme den elueringsbuffer (AE) ved 37 ° C for å forbedre utbyttet av eluerte DNA. Mannlige og kvinnelige DNA for standardkurve er isolert på samme måte.
- (Valgfritt) Genomisk DNA kan renses ytterligere eller konsentrert ved hjelp EtOH ventet metoden i nærvær av 3 M natriumacetat (pH = 5,5). DNA pelletene deretter resuspendert i 40-50 pl destillert vann for analyse umiddelbart eller lagres ved -20 ° C for fremtidig bruk.
- Mål DNA konsentrasjonerasjon med NanoDrop ND-1000 spektra fotometer. Prøver med OD 260/280 mellom 1,8 til 2,0 er brukt for videre analyse.
- Fortynn DNA med DNAase fri H 2 O til 4ng/μl i et totalvolum på 50 pl.
5. Standard Curve Forberedelse
Fortynn mannlig DNA og kvinnelig DNA til en konsentrasjon på 4 ng / ul, og gjøre DNA blandingen ifølge den Tabell1
| % Av mannlige DNA i Female Bakgrunn | Volum (ul) av 4ng/μl mannlige DNA | Volum (ul) av 4ng/μl kvinnelige DNA | Totalt volum (ul) |
| 0.2 | 1 | 499 | 500 |
| 0.5 | 1 | 199 | 200 |
| 2.5 | 5 | 195 | 200 |
| 12,5 | 25 | 175 | 200 |
| 50 | 100 | 100 | 200 |
| 87,5 | 175 | 25 | 200 |
| 100 | 200 | 0 | 200 |
Tabell 1. Prøvepreparering for standardkurve. Normal mannlige og kvinnelige FVB / NJ mus i en alder av 8-12wks ble ofret. Blod og BM cellene ble samlet inn. DNA fra mannlige celler og kvinnelige celler ble isolert og resuspendert ved en konsentrasjon på 4ng/μl. De mannlige og kvinnelige DNA'er ble blandet ved forskjellige forhold for å generere DNA standard prøve blandinger.
6. Real-time PCR
- Sett opp PCR reaksjonen plate ved å blande SYBR Grønn SuperMix reagens med primere og genomisk DNA. Reaksjonen volum (20 ul) inneholder 400 nM av hver primer og 5 pl av blodceller genomisk DNA (4ng/μl x5 pl = 20 ng) i hver reaksjon. DNA SAMPles og standarder ble satt opp i tre eksemplarer. Sekvenser av primere er vist i tabell 2.
| Gene navn | Fremover | Reversere |
| BCL2 | 5'-AAGCTGTCACAGAGGGGCTA | 5'-CAGGCTGGAAGGAGAAGATG |
| Zfy1 | 5-TGGAGAGCCACAAGCTAACCA | 5'-CCCAGCATGAGAAAGATTCTTC |
Tabell 2. RT-PCR primer sekvens for murine BCL2 og Zfy1.
- Utfør PCR reaksjon med Biorad iQ5 PCR maskin med de følgende betingelser: 95 ° C 3 min, 42 amplifikasjons sykluser av 95 ° C i 10 sek, 58 ° C i 25 sek og 72 ° C i 15 sek, etterfulgt av en smelte-kurve trinn.
- Skaffe syklusterskel (Ct) verdier ved Bio-Rad iQ5 2.1 Standard Edition Optisk System. Beregn δCt (Ct Zfy1 </ Sup>-Ct BCL2) verdi, og Zfy1 uttrykk nivå beregnes som verdien av 2-δ Ct.
- Etablere standardkurver for hver reaksjon serie med 2-δCt lesing fra kjente mannlige / kvinnelige standard blandinger. De standardkurver genereres ved plotting middelverdien av 2-δCt verdi triplicates den kjente% menn DNA i blanding med lineær regresjon montering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 og 2 viste eksempler på standardkurver plottet med gjennomsnittsverdier for to-δCt mot prosenter av mannlig DNA. Figur 1A viste spesifikk smeltetemperatur for BCL2 og Zfy1 amplikonene lokalisert ved 78,5 ° C og 88,5 ° C, henholdsvis. BCL2 brukes som referanse genet å normalisere den totale mengden loaded DNA i hver PCR-reaksjon. BCL2 forsterkning kurver (Log visning) for hver standard prøve fusjonere med hverandre uavhengig av mannlige DNA konsentrasjon, noe som indikerer lik mengde lastet DNA (figur 1B). Imidlertid Zfy1 amplifikasjonskurve migrert til venstre med økende mengde mannlig DNA i prøven (figur 1C). For å validere vår metode, testet vi mannlig donor celle engraftment i transplanterte mus som fikk BM celler fra WT vs Pim trippel knockout (TKO) mus ved ulike tidspunkt etter transplantasjonen. Både perifer blod (6 wks) og BM prøver (16wks) w ere analysert. HSCs fra Pim TKO mus har defekter i rekonstituering lethally bestrålte mus (An, N et al., Manuskript under revisjon). Som forventet, hadde mottaker mus transplantert med PIM TKO celler en mye lavere andelen mannlige celler sammenlignet med mus transplantert med WT celler (Figur 3).
Figur 1. (A) Representant smeltende kurve fra flere prøver med forskjellige mannlige DNA prosenter. Toppen på 78,5 indikerer amplifikasjon av BCL2, mens toppen ved 88,5 ° C indikerer amplifikasjon av Zfy-1. Representative amplifikasjonskurve fra flere prøver med ulike mannlige DNA prosentandel for BCL2 (B) og Zfy1 (C), Ct: syklusterskel.= "Http://www.jove.com/files/ftp_upload/50193/50193fig1large.jpg" target = "_blank"> Klikk her for å se større figur.
Figur 2. RT-PCR standardkurve for mannlig DNA prosentandel. Prøver (20 ng DNA i 20 pl totalt volum) av mannlige og kvinnelige DNA blandinger oppnådd fra benmargsceller ble prosessert for RT-PCR som beskrevet i protokollen. Middelverdiene av δCt (Ct Zfy1-Ct BCL2) for individuelle prøver ble beregnet og 2-δ Ct (Y-aksen) ble plottet mot mannlig DNA prosentandel (X-aksen) (område fra 0,2% til 100%) med lineær regresjon montering. R2 representerer koeffisienten.
Figur 3. Konkurransedyktige benmargstransplantasjon erfaringriments. 5 x 10 5 totalt BM celler fra mannlige WT eller alder matchet mannlig Pim trippel KO (TKO) mus sammen med 2 x 10 5 kvinnelige konkurrent benmargceller ble transplantert inn bestrålte kvinnelige verter. Perifert blod (PB) chimerism ved 6 uker og BM chimerism på 16 wks etter transplantasjonen ble estimert ved andel av mannlige DNA ved RT-PCR som fordømte i protokollen (* p <0,05, ** p <0,01).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med vår nåværende studien er å gi publikum en PCR-basert teknikk for å kvantifisere donorcellen engraftment i et konkurranseutsatt murine benmargstransplantasjon modell. Flere studier har rapportert hjelp RT-PCR for å påvise donor celler i transplantasjon modeller 9-10. Dr. Schwarzenberger gruppe først utviklet en murine benmargstransplantasjon modellen bruker real-time PCR for å forsterke y-kromosom-spesifikke 8. Denne metoden ble brukt for å studere Gli-1 funksjon i HSC aktivitet 11. Vi deretter videre endret protokollen og gitt en detaljert, steg-for-steg eksperimentelle protokollen i visualisert format. Den visualisert presentasjon av protokoll vår tillater publikum å følge vår protokoll lett. Vi har også sammenlignet våre PCR resultater ved hjelp genomisk DNA fra BM prøver vs DNA fra perifert blod. Donor engraftment data fra BM og blodprøver er i utgangspunktet konsistent, men ble vanligvis mindre variasjon funnet i BM prøver. Dette ersannsynlig skyldes gjenværende hemoglobin etter RBC i perifert blod som kan kompromittere renhet / kvalitet av genomisk DNA i blodprøvene.
Det er flere fordeler med vår PCR-basert teknikk for å kvantifisere donorcellen engraftment. Første; vårt teknikken kan utføres i de fleste laboratorier. Det er ikke behov for spesialisert og kostbart utstyr enn sanntid-PCR maskin. Vi ytterligere modifisert PCR reaksjon komponent og brukte SYBR Grønn SuperMix istedenfor Taqman. Denne endringen reduserer ytterligere kostnader og utgifter som vi eliminere den fluorescerende-merket probe. Sekund, er vår teknikk pålitelig og reproduserbar. Vi brukte BCL2 referanse genet å normalisere det totale DNA beløpet motsetning til DNA kvantifisering kit. BCL2 genet ble brukt fordi: 1) dette genet ikke er plassert på Y-kromosomet. Derfor er det uttrykket ikke påvirket av mannlige donorcellen engraftment. 2). BCL2 er ikke regulert under de gjeldende transplantasjon forhold. Som shegen i Figur 1, produserer BCL2 genet en pålitelig og meget konsistent kontroll for totalt DNA lasting uavhengig av lastet mannlig DNA mengde. Zfy1 er en sink finger gen innen testis bestemmer region 12 og ligger på Y kromosomet. Det har blitt rapportert at genuttrykk nivået Zfy1 svarer godt til mengden av mannlige celle DNA i en mus transplantasjon modell 8. Tredje, vårt PCR basert teknikk svært sensitive, og kan detektere donorcellen engraftment på <1%. Videre kan prøvene oppbevares i lang tid for senere analyse. I kontrast, krever konvensjonell strømningscytometri-basert metode umiddelbar prøvebehandling. Endelig er vår teknikk mus belastning uavhengig og kan brukes for genetisk bakgrunn som mangler veldefinerte overflate markører for å skille donorceller fra mottakercellene. Dette er den viktigste fordel med denne metoden.
Under vår nåværende eksperimentelle tilstand (donor / competiteller forholdet er 5/2), observerte vi rundt 80-90% donor engraftment ved 16 uker med PCR-basert metode. Våre data er helt sammenlignbare med konvensjonelle, flowcytometri basert-metode som viste ~ 95% donorcellen engraftment på 16 uker etter transplantasjon med donor (CD45.2) / konkurrent (CD45.1) ratio på 4:01 to. Sammenlignet med den konvensjonelle metode som bruker celleoverflaten markør å oppdage donorceller i mottaker mus, er den store ulempe av metode vår manglende evne til å analysere engraftment i ulike subpopulasjoner av blodceller slik som i B-celler, T-celler eller granulocytter. Imidlertid, hvis det er nødvendig, er det mulig å samle hver populasjon av celler ved hjelp av mobiltelefon sortering teknikk og deretter underlagt prøvene for RT-PCR for å bestemme donorcellen bidrag i hver celle populasjonen. Siden donorcellen engraftment ble beregnet basert på standardkurven er utvalget avlesning helt avhengig stigningstallet og y skjæringspunktet av standardkurve. Det er mulig at vi kan få off-serien readout (dvs. over 100% av engraftment). Imidlertid, kan disse "falske positive eller falske negative" resultater unngås hvis: 1) DNA isolering prosedyrer for testede prøver og standardkurve prøver er identiske, og 2) den valgte rekke standardkurve er nær den forventede prøven avlesning. I tillegg, siden det kan være forskjeller i hver PCR-reaksjon, og i kalibrering status PCR maskin bør standardkurve prøvene tas med i hver PCR-plate for å unngå variasjoner mellom hver PCR-reaksjon.
Til slutt, validert vi vår teknikk å bruke våre Pim trippel KO mus. Konsistent med tidligere rapport 13, fant vi ut at donor HSCs fra Pim trippel KO mus er defekt i rekonstituering lethally bestrålte mottaker mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingen konkurrerende økonomiske interesser å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Charles Greenberg for bruk av hans Real time PCR maskin. Dette arbeidet støttes av MUSC Hollings Cancer Center Oppstart Fund,, ASCO Hollings Cancer Center ACS IRG Conquer Cancer Foundation Career Development Award, NIH 1K08HL 103780-01A1, og NIH 3P30CA138313-01S3. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og ikke nødvendigvis representerer den offisielle utsikt over National Institutes of Health eller andre finansieringskilder agenter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30255.01 | |
| FBS | Invitrogen | 16140-017 | Heat inactivated |
| Ammonium chloride | MP Biomedicaals | 194806 | |
| Potassium Bicarbonate | Fisher | P184-500 | |
| QIAamp DNA Blood minikit | Qiagen | 51106 | |
| Cell strainer | BD bioscience | ||
| iQ SYBR Green supermix | Biorad | 170-8882 | |
| iQ5 real time PCR machine | Biorad | ||
| Spectra photometer | Nanodrop ND-1000 | ND-1000 |
References
- McCulloch, E. A., Till, J. E. The radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells, determined by quantitative marrow transplantation into irradiated mice. Radiat. Res. 13, 115-125 (1960).
- Xiao, N., et al. Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress. Blood. 119, 4898-4907 (2012).
- Kang, Y., Chen, B. J., Deoliveira, D., Mito, J., Chao, N. J. Selective enhancement of donor hematopoietic cell engraftment by the CXCR4 antagonist AMD3100 in a mouse transplantation model. PLoS One. 5, e11316 (2010).
- Sadeghi, B., et al. GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice. Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).
- Taketo, M., et al. FVB/N: an inbred mouse strain preferable for transgenic analyses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2065-2069 (1991).
- Morisaki, H., et al. Genotypic analysis using a Y-chromosome-specific probe following bone marrow transplantation. Am. J. Hematol. 27, 30-33 (1988).
- Lo, Y. M., et al. Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis. Am. J. Hum. Genet. 62, 768-775 (1998).
- Byrne, P., et al. Chimerism analysis in sex-mismatched murine transplantation using quantitative real-time PCR. Biotechniques. 32, 279-280 (2002).
- Ma, X., et al. Contribution of recipient-derived cells in allograft neointima formation and the response to stent implantation. PLoS One. 3, e1894 (2008).
- Bosio, E., et al. A comparison between real-time quantitative PCR and DNA hybridization for quantitation of male DNA following myoblast transplantation. Cell Transplant. 13, 817-821 (2004).
- Merchant, A., Joseph, G., Wang, Q., Brennan, S., Matsui, W. Gli1 regulates the proliferation and differentiation of HSCs and myeloid progenitors. Blood. 115, 2391-2396 (2010).
- Nagamine, C. M., Chan, K., Hake, L. E., Lau, Y. F. The two candidate testis-determining Y genes (Zfy-1 and Zfy-2) are differentially expressed in fetal and adult mouse tissues. Genes & development. 4, 63-74 (1990).
- Grundler, R., et al. Dissection of PIM serine/threonine kinases in FLT3-ITD-induced leukemogenesis reveals PIM1 as regulator of CXCL12-CXCR4-mediated homing and migration. J. Exp. Med. 206, 1957-1970 (2009).
