Summary

Eletroporação Zona Neonatal subventricular

Published: February 11, 2013
doi:

Summary

Nós demonstramos uma técnica minimamente invasiva referido como eletroporação zona neonatal subventricular. A técnica consiste em injectar o DNA de plasmídeo nos ventrículos laterais de bebés recém-nascidos e na aplicação de corrente eléctrica para fornecer e manipular geneticamente as células estaminais neurais

Abstract

As células estaminais neurais (NSC) linha dos ventrículos laterais pós-natais e dão origem a vários tipos de células que incluem neurónios, astrócitos e células ependimais 1. Entender os caminhos moleculares responsáveis ​​pela NSC auto-renovação, compromisso e diferenciação é fundamental para aproveitar o seu potencial único para reparar o cérebro e entender melhor sistema nervoso central. Os métodos anteriores para a manipulação de sistemas de mamíferos necessário o esforço demorado e caro de engenharia genética a nível animal inteiro 2. Assim, a grande maioria dos estudos têm explorado as funções de moléculas NSC in vitro ou in invertebrados.

Aqui, nós demonstrar a técnica simples e rápida para manipular NPCs neonatais que é referido como neonatal eletroporação subventricular zona (SVZ). Técnicas semelhantes foram desenvolvidos há uma década para estudar NSCs embrionárias e ajudaram estudos sobre Cortical desenvolvimento 3,4. Mais recentemente, esta foi utilizada para estudar o prosencéfalo roedor pós-natal 5-7. Esta técnica resulta em rotulagem robusto de SVZ NSCs e seus descendentes. Assim, pós-natal SVZ electroporação proporciona uma alternativa de custo e de tempo eficaz para a engenharia genética de mamíferos NSC.

Protocol

Este procedimento está em conformidade com os requisitos de Yale IACUC. Os cientistas devem se certificar de que as orientações IACUC são aprovados e seguido de acordo com as suas necessidades institucionais. 1. Seção 1. Preparação do Pipetas de DNA, Soluções e vidro Gerar alta pureza (OD 260/280> 1,80) elevada concentração (ug / uL> 2,5) endotoxinas sem DNA. Preparar solução salina 0,9% e filtrar através de um filtro estéril uM 22. Coloca…

Representative Results

Neonatal resulta zona subventricular electroporação na rotulagem de quase todos glia radial contígua com a zona subventricular dorsal, dorsal lateral, e o movimento lateral, seguindo "varrer" do eléctrodo de pinça (Figura 1E). No entanto, a electroporação pode ser adaptado para as necessidades do respectivo ensaio, mas não varrer o eléctrodo e utilizando a colocação e orientação específica, conforme detalhado no vídeo. Por exemplo, uma vez localizada dorsalmente glia radial dife…

Discussion

Aqui nós detalhe a técnica de electroporação SVZ neonatal, uma técnica para rapidamente e de forma robusta e rotular manipular as células-tronco SVZ e seus descendentes. Há várias vantagens que tem a electroporação, em comparação com outras técnicas. Em primeiro lugar, dada a marcação focal de células, é capaz de discernir celulares autónomos e não autónomos efeitos célula. Manipulação, segundo genética utilizando sistemas indutíveis permite comparar o efeito antes ou após integração sinápti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado por doações do Departamento de Defesa (prêmio de desenvolvimento Idéia, W81XWH-10-1-0041, AB), CT de células-tronco de subvenção (AB), e um Instituto Nacional de Saúde NRSA 10668225 (DMF). O presente material é baseado no trabalho, em parte suportado pelo Estado de Connecticut sob o Stem Cell Research Connecticut Programa de Subsídios. Seu conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representam necessariamente a posição oficial do Estado de Connecticut, o Departamento de Saúde Pública do Estado de Connecticut ou Inovações CT, Inc. A financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, a coleta de dados e análise, a decisão de publicar, ou a preparação do manuscrito.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Heavy Polished Borosilicate Tubing Sutter Instrument BF150-110-10
Dual-Stage Glass Micropipette Puller Narishige PC-10H
Fast Green Fischer Scientific 0521192205
ECM 830 Square Wave Pulse generator Harvard Apparatus 45-0052
Tweezertrodes Harvard Apparatus 45-0488
Fiber-Optic Light Source Fisher Scientific 12-562-36
Tungsten Halogen lamp USHIO America, Inc 1002247
Picospritzer II Parker Instruments 052-0312-900

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Cite This Article
Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. Neonatal Subventricular Zone Electroporation. J. Vis. Exp. (72), e50197, doi:10.3791/50197 (2013).

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