Summary

الميتوكوندريا المرتبطة الأغشية ER (MAMs) وGlycosphingolipid Microdomains المخصب (GEMS): عزل من مخ الفأر

Published: March 04, 2013
doi:

Summary

هذا الإجراء يوضح كيفية عزل من مخ الفأر الكبار الميتوكوندريا المرتبطة الأغشية ER أو MAMs وglycosphingolipid التخصيب microdomain الكسور من MAMs والاستعدادات الميتوكوندريا.

Abstract

عضيات داخل الخلايا هي هياكل ديناميكية للغاية مع اختلاف الشكل والتكوين، التي تخضع لخلية محددة العظة الجوهرية وخارجي. وجنبا إلى جنب في كثير من الأحيان الأغشية في مواقع محددة الاتصال، والتي أصبحت مراكز لتبادل جزيئات إشارة، مكونات غشاء 1،2،3،4. وmicrodomains غشاء بين العضيات التي تتشكل بين الشبكة الإندوبلازمية (ER) والميتوكوندريا في افتتاح كا IP3 حساسة 2 + قناة معروفة والأغشية المرتبطة-ER أو الميتوكوندريا MAMs 4،5،6. تم تكوين البروتين / والدهون خصائص البيوكيميائية من هذه المواقع الاتصال غشاء درس على نطاق واسع ولا سيما فيما يتعلق بدورها في تنظيم الكالسيوم داخل الخلايا 2 + 4،5،6. وER بمثابة المخزن الأساسي من الكالسيوم داخل الخلايا 2 +، وبهذه الصفة ينظم عدد لا يحصى من العمليات الخلوية المصب من الكالسيوم 2 + إشارات، بما فيuding بعد متعدية للطي البروتين والبروتين maturation7. الميتوكوندريا، من ناحية أخرى، والحفاظ على التوازن الكالسيوم + 2، من خلال التخزين المؤقت عصاري خلوي الكالسيوم تركيز + 2 وبالتالي منع بدء مسارات أفكارك المصب من الكالسيوم 2 + 4،8 عدم الاتزان. الطبيعة الديناميكية للMAMs يجعلها مثالية لمواقع تشريح الآليات الخلوية الأساسية، بما في ذلك إشارات الكالسيوم + 2 وتنظيم الكالسيوم الميتوكوندريا 2 + تركيز الدهون الحيوي، والنقل، والطاقة والأيض الخلوي بقاء 4،9،10،11،12. وقد وصفت عدة بروتوكولات لتنقية هذه microdomains من أنسجة الكبد والخلايا المستزرعة 13،14.

اتخاذ أساليب المنشورة سابقا في الحسبان، تكيفنا بروتوكول لعزل الميتوكوندريا وMAMs من مخ الفأر الكبار. لهذا الإجراء واضاف لدينا خطوة اضافية تنقية، وهما X100 تريتون استخراج، والتي هنابلس عزل جزء المخصب glycosphingolipid (GEM) microdomain من MAMs. هذه الاستعدادات GEM مشاركة العديد من مكونات البروتين مع الدهون والطوافات caveolae، والمستمدة من غشاء البلازما أو الأغشية داخل الخلايا الأخرى، واقترح أن تعمل على تجميع نقاط لتجميع البروتينات المستقبلة للبروتين والبروتين التفاعلات 4،15.

Protocol

ويهدف البروتوكول التالي لعزل وتنقية والأحجار الكريمة MAMs من مخ الفأر الحلول المطلوبة لعزل MAMs، الميتوكوندريا والأحجار الكريمة تجزئة للحصول على إعداد الميتوكوندريا الخام: <p class="jove_content" style…

Representative Results

بناء على خبرتنا في استخدام هذا البروتوكول يمكن أن نوصي بأمان لعزل وتنقية MAMs، والأحجار الكريمة والكسور الميتوكوندريا من مخ الفأر. الإجراء على النحو المبين هو تكرار للغاية ومتسقة. في الشكل 1 نعرض صورة ممثل طبقة نقية طريقة الميتوكوندريا وMAMs على التدرج Percoll (الخ…

Discussion

مواقع الاتصال بين الخلايا أو الأغشية بين العضيات غشاء البلازما والخلايا تمثل دينامية منصات إشارة للعمليات الخلوية الأساسية. توصيف دقيق لوظيفتها تكوين وتحت كل الظروف الفسيولوجية والمرضية تتطلب بروتوكولات تنقية موثوق بها وقابلة للتكرار. تم الأساليب بالتفصيل هنا عل?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نحن نعترف مساهمة في تصور سانو ريناتا البروتوكول الأولي. Ad'A. يحمل جواهرجية للأطفال (JFC) هبوا الرئيس في علم الوراثة والعلاج الجيني. وقد تم تمويل هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منح GM60905، وDK52025 CA021764، والجمعيات الخيرية اللبنانية السورية الأمريكية المرتبطين بها (ALSAC).

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalogue Number Comments
REAGENTS
Fractionation
Sucrose Fisher Scientific S5-500
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S-5761
Magnesium Chloride, Hexahydrate Fisher Scientific BP214-500
Calcium Chloride, Dihydrate Sigma-Aldrich C-5080
MAM
D-Mannitol Sigma-Aldrich M9546-250G
Hepes Fisher Scientific BP310-500
EGTA Sigma-Aldrich E4378-250G
BSA, Fraction V, Heat Shock, Lyophilizate Roche 03-116-964-001
Percoll GE 17-0891-02
GEM
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284-500 ml
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-3
Tris Base Roche 03-118-142-001
HCl Fisher Scientific A144S-500
EDTA Fisher Scientific BP120-500
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Fisher Scientific BP166-500
Common
Protease Inhibitors Tablets, Complete EDTA-free Roche 11-873-580-001
EQUIPMENT
2 ml Douce All-Glass Tissue Grinders Kimble Chase 885300-0002
15 ml Polypropylene Conical Centrifuge Tubes, BD Falcon BD 352097
30 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes Kimble Chase 45500-30
15 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes Kimble Chase 45500-15
Ultracentrifuge tubes, Ultra-Clear, Thinwall, 14×89 mm Beckman-Coulter 344059
Parafilm Cole-Parmer PM996
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets, 9″ Fisher Scientific 13-678-20C

References

  1. Poburko, D., Kuo, K. H., Dai, J., Lee, C. H., van Breemen, C. Organellar junctions promote targeted Ca2+ signaling in smooth muscle: why two membranes are better than one. Trends Pharmacol. Sci. 25 (1), 8-15 (2004).
  2. Pani, B., Ong, H. L., Liu, X., Rauser, K., Ambudkar, I. S., Singh, B. B. Lipid rafts determine clustering of STIM1 in endoplasmic reticulum-plasma membrane junctions and regulation of store-operated Ca2+ entry (SOCE. J. Biol. Chem. 283 (25), 17333-17340 (2008).
  3. Levine, T., Rabouille, C. Endoplasmic reticulum: one continuous network compartmentalized by extrinsic cues. Curr. Opin. Cell Biol. 17 (4), 362-368 (2005).
  4. Sano, R., Annunziata, I., Patterson, A., Moshiach, S., Gomero, E., Opferman, J., Forte, M., d’Azzo, A. GM1-ganglioside accumulation at the mitochondria-associated ER membranes links ER stress to Ca(2+)-dependent mitochondrial apoptosis. Mol. Cell. 36 (3), 500-511 (2009).
  5. Raturi, A., Simmen, T. Where the endoplasmic reticulum and the mitochondrion tie the knot: The mitochondria-associated membrane (MAM). Biochim. Biophys. Acta. , (2012).
  6. Giorgi, C., De Stefani, D., Bononi, A., Rizzuto, R., Pinton, P. Structural and functional link between the mitochondrial network and the endoplasmic reticulum. Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1817-1827 (2009).
  7. d’Azzo, A., Tessitore, R. Sano Gangliosides as apoptotic signals in ER stress response. Cell Death Differ. 13, 404-414 (2006).
  8. Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial membrane permeabilization in cell death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
  9. Rizzuto, R., Brini, M., Murgia, M., Pozzan, T. Microdomains with high Ca2+ close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria. Science. 262, 744-747 (1993).
  10. Lynes, E. M., Bui, M., Yap, M. C., Benson, M. D., Schneider, B., Ellgaard, L., Berthiaume, L. G., Simmen, T. Palmitoylated TMX and calnexin target to the mitochondria-associated membrane. EMBO J. 31 (2), 457-470 (2011).
  11. Fujimoto, M., Hayashi, T., Su, T. P. The role of cholesterol in the association of endoplasmic reticulum membranes with mitochondria. Biochem. Biophys. Res. Commun. 417 (1), 635-639 (2012).
  12. Grimm, S. The ER-mitochondria interface: the social network of cell death. Biochim. Biophys. Acta. 1823 (2), 327-334 (2012).
  13. Vance, J. E. Phospholipid synthesis in a membrane fraction associated with mitochondria. J. Biol. Chem. 265, 7248-7256 (1990).
  14. Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat. Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).
  15. Pizzo, P., Viola, A. Lymphocyte lipid rafts: structure and function. Curr. Opin. Immunol. 15 (3), 255-260 (2003).

Play Video

Cite This Article
Annunziata, I., Patterson, A., d’Azzo, A. Mitochondria-associated ER Membranes (MAMs) and Glycosphingolipid Enriched Microdomains (GEMs): Isolation from Mouse Brain. J. Vis. Exp. (73), e50215, doi:10.3791/50215 (2013).

View Video