الميتوكوندريا المرتبطة الأغشية ER (MAMs) وGlycosphingolipid Microdomains المخصب (GEMS): عزل من مخ الفأر
Summary
هذا الإجراء يوضح كيفية عزل من مخ الفأر الكبار الميتوكوندريا المرتبطة الأغشية ER أو MAMs وglycosphingolipid التخصيب microdomain الكسور من MAMs والاستعدادات الميتوكوندريا.
Abstract
عضيات داخل الخلايا هي هياكل ديناميكية للغاية مع اختلاف الشكل والتكوين، التي تخضع لخلية محددة العظة الجوهرية وخارجي. وجنبا إلى جنب في كثير من الأحيان الأغشية في مواقع محددة الاتصال، والتي أصبحت مراكز لتبادل جزيئات إشارة، مكونات غشاء 1،2،3،4. وmicrodomains غشاء بين العضيات التي تتشكل بين الشبكة الإندوبلازمية (ER) والميتوكوندريا في افتتاح كا IP3 حساسة 2 + قناة معروفة والأغشية المرتبطة-ER أو الميتوكوندريا MAMs 4،5،6. تم تكوين البروتين / والدهون خصائص البيوكيميائية من هذه المواقع الاتصال غشاء درس على نطاق واسع ولا سيما فيما يتعلق بدورها في تنظيم الكالسيوم داخل الخلايا 2 + 4،5،6. وER بمثابة المخزن الأساسي من الكالسيوم داخل الخلايا 2 +، وبهذه الصفة ينظم عدد لا يحصى من العمليات الخلوية المصب من الكالسيوم 2 + إشارات، بما فيuding بعد متعدية للطي البروتين والبروتين maturation7. الميتوكوندريا، من ناحية أخرى، والحفاظ على التوازن الكالسيوم + 2، من خلال التخزين المؤقت عصاري خلوي الكالسيوم تركيز + 2 وبالتالي منع بدء مسارات أفكارك المصب من الكالسيوم 2 + 4،8 عدم الاتزان. الطبيعة الديناميكية للMAMs يجعلها مثالية لمواقع تشريح الآليات الخلوية الأساسية، بما في ذلك إشارات الكالسيوم + 2 وتنظيم الكالسيوم الميتوكوندريا 2 + تركيز الدهون الحيوي، والنقل، والطاقة والأيض الخلوي بقاء 4،9،10،11،12. وقد وصفت عدة بروتوكولات لتنقية هذه microdomains من أنسجة الكبد والخلايا المستزرعة 13،14.
اتخاذ أساليب المنشورة سابقا في الحسبان، تكيفنا بروتوكول لعزل الميتوكوندريا وMAMs من مخ الفأر الكبار. لهذا الإجراء واضاف لدينا خطوة اضافية تنقية، وهما X100 تريتون استخراج، والتي هنابلس عزل جزء المخصب glycosphingolipid (GEM) microdomain من MAMs. هذه الاستعدادات GEM مشاركة العديد من مكونات البروتين مع الدهون والطوافات caveolae، والمستمدة من غشاء البلازما أو الأغشية داخل الخلايا الأخرى، واقترح أن تعمل على تجميع نقاط لتجميع البروتينات المستقبلة للبروتين والبروتين التفاعلات 4،15.
Protocol
Representative Results
Discussion
مواقع الاتصال بين الخلايا أو الأغشية بين العضيات غشاء البلازما والخلايا تمثل دينامية منصات إشارة للعمليات الخلوية الأساسية. توصيف دقيق لوظيفتها تكوين وتحت كل الظروف الفسيولوجية والمرضية تتطلب بروتوكولات تنقية موثوق بها وقابلة للتكرار. تم الأساليب بالتفصيل هنا عل?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نعترف مساهمة في تصور سانو ريناتا البروتوكول الأولي. Ad'A. يحمل جواهرجية للأطفال (JFC) هبوا الرئيس في علم الوراثة والعلاج الجيني. وقد تم تمويل هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منح GM60905، وDK52025 CA021764، والجمعيات الخيرية اللبنانية السورية الأمريكية المرتبطين بها (ALSAC).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Fractionation | |||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-5761 | |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
| MAM | |||
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M9546-250G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378-250G | |
| BSA, Fraction V, Heat Shock, Lyophilizate | Roche | 03-116-964-001 | |
| Percoll | GE | 17-0891-02 | |
| GEM | |||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500 ml | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Tris Base | Roche | 03-118-142-001 | |
| HCl | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Common | |||
| Protease Inhibitors Tablets, Complete EDTA-free | Roche | 11-873-580-001 | |
| EQUIPMENT | |||
| 2 ml Douce All-Glass Tissue Grinders | Kimble Chase | 885300-0002 | |
| 15 ml Polypropylene Conical Centrifuge Tubes, BD Falcon | BD | 352097 | |
| 30 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-30 | |
| 15 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-15 | |
| Ultracentrifuge tubes, Ultra-Clear, Thinwall, 14×89 mm | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Parafilm | Cole-Parmer | PM996 | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets, 9″ | Fisher Scientific | 13-678-20C |
References
- Poburko, D., Kuo, K. H., Dai, J., Lee, C. H., van Breemen, C. Organellar junctions promote targeted Ca2+ signaling in smooth muscle: why two membranes are better than one. Trends Pharmacol. Sci. 25 (1), 8-15 (2004).
- Pani, B., Ong, H. L., Liu, X., Rauser, K., Ambudkar, I. S., Singh, B. B. Lipid rafts determine clustering of STIM1 in endoplasmic reticulum-plasma membrane junctions and regulation of store-operated Ca2+ entry (SOCE. J. Biol. Chem. 283 (25), 17333-17340 (2008).
- Levine, T., Rabouille, C. Endoplasmic reticulum: one continuous network compartmentalized by extrinsic cues. Curr. Opin. Cell Biol. 17 (4), 362-368 (2005).
- Sano, R., Annunziata, I., Patterson, A., Moshiach, S., Gomero, E., Opferman, J., Forte, M., d’Azzo, A. GM1-ganglioside accumulation at the mitochondria-associated ER membranes links ER stress to Ca(2+)-dependent mitochondrial apoptosis. Mol. Cell. 36 (3), 500-511 (2009).
- Raturi, A., Simmen, T. Where the endoplasmic reticulum and the mitochondrion tie the knot: The mitochondria-associated membrane (MAM). Biochim. Biophys. Acta. , (2012).
- Giorgi, C., De Stefani, D., Bononi, A., Rizzuto, R., Pinton, P. Structural and functional link between the mitochondrial network and the endoplasmic reticulum. Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1817-1827 (2009).
- d’Azzo, A., Tessitore, R. Sano Gangliosides as apoptotic signals in ER stress response. Cell Death Differ. 13, 404-414 (2006).
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial membrane permeabilization in cell death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
- Rizzuto, R., Brini, M., Murgia, M., Pozzan, T. Microdomains with high Ca2+ close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria. Science. 262, 744-747 (1993).
- Lynes, E. M., Bui, M., Yap, M. C., Benson, M. D., Schneider, B., Ellgaard, L., Berthiaume, L. G., Simmen, T. Palmitoylated TMX and calnexin target to the mitochondria-associated membrane. EMBO J. 31 (2), 457-470 (2011).
- Fujimoto, M., Hayashi, T., Su, T. P. The role of cholesterol in the association of endoplasmic reticulum membranes with mitochondria. Biochem. Biophys. Res. Commun. 417 (1), 635-639 (2012).
- Grimm, S. The ER-mitochondria interface: the social network of cell death. Biochim. Biophys. Acta. 1823 (2), 327-334 (2012).
- Vance, J. E. Phospholipid synthesis in a membrane fraction associated with mitochondria. J. Biol. Chem. 265, 7248-7256 (1990).
- Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat. Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).
- Pizzo, P., Viola, A. Lymphocyte lipid rafts: structure and function. Curr. Opin. Immunol. 15 (3), 255-260 (2003).
