Mitokondrier-associerede ER Membranes (Mams) og glycosphingolipid Berigede mikrodomæner (GEM'er): Isolering fra musehjerne
Summary
Denne fremgangsmåde viser, hvordan at isolere fra den voksne musehjerne mitokondrierne-associerede ER membraner eller Mams og glycosphingolipid-berigede microdomain fraktioner fra Mams og mitokondriske præparater.
Abstract
Intracellulære organeller er yderst dynamiske strukturer med varierende form og sammensætning, som underkastes cellespecifikke indre og ydre signaler. Deres membraner er ofte sammenstillet med definerede kontakt sites, der bliver knudepunkter for udveksling af signalmolekyler og membran komponenter 1,2,3,4. De indbyrdes organellar membran mikrodomæner, der dannes mellem det endoplasmatiske reticulum (ER) og mitokondrier ved åbningen af IP3-sensitive Ca2 +-kanal er kendt som mitokondrier associeret-ER membraner eller Mams 4,5,6. Protein / lipid-sammensætning og biokemiske egenskaber af disse membranmaterialer kontaktsteder er blevet omfattende undersøgt særligt med hensyn til deres rolle i regulering af intracellulær Ca2 + 4,5,6. ER fungerer som det primære lager af intracellulære Ca2 +, og i denne egenskab regulerer et utal af cellulære processer nedstrøms af Ca2 +-signalering, including posttranslationel proteinfoldning og protein maturation7. Mitokondrier, på den anden side bibeholdes Ca2 +-homeostase ved buffering cytosolisk Ca2 +-koncentration og derved forhindrer iværksættelsen af apoptotiske veje nedstrøms for Ca2 + ubalance 4,8. Den dynamiske karakter af Mams gør dem ideelle steder at dissekere de grundlæggende cellulære mekanismer, herunder Ca 2 + signalering og regulering af mitokondrie Ca 2 + koncentration, lipidbiosyntese og transport, energi metabolisme og celleoverlevelse 4,9,10,11,12. Adskillige protokoller er blevet beskrevet til oprensning af disse mikrodomæner fra levervæv og dyrkede celler 13,14.
Idet tidligere publicerede metoder i betragtning, har vi tilpasset en protokol til isolering af mitokondrier og Mams fra voksen musehjerne. Til denne procedure har vi tilføjet en ekstra oprensningstrin, nemlig en Triton X100 udvinding, som enables isolationen af de glycosphingolipid beriget microdomain (GEM) fraktion af Mams. Disse GEM præparater deler flere proteinkomponenter med caveolae og lipidklumper, afledt fra plasmamembranen eller andre intracellulære membraner, og foreslås til at fungere som samle point for ophobning af receptorproteiner og for protein-protein interaktioner 4,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stederne for kontakt mellem intracellulære membraner eller mellem organeller og plasmamembran celler repræsenterer dynamiske signalering platforme for grundlæggende cellulære processer. Den nøjagtige karakterisering af deres funktion og sammensætning under både fysiologiske og patologiske tilstande kræver pålidelige og reproducerbare oprensningsprotokoller. Fremgangsmåderne beskrevet her, er blevet specifikt optimeret ved vores laboratorium til isolering og oprensning af Mams og tilsvarende perler fra voksen m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkender det bidrag, Renata Sano i udformningen den oprindelige protokol. Ad'A. holder Jewelers for børn (JFC) Begavet Chair i Genetik og genterapi. Dette arbejde blev finansieret delvist af NIH tilskud GM60905, DK52025 og CA021764, og de amerikanske libanesiske syriske associerede Charities (ALSAC).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Fractionation | |||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-5761 | |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
| MAM | |||
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M9546-250G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378-250G | |
| BSA, Fraction V, Heat Shock, Lyophilizate | Roche | 03-116-964-001 | |
| Percoll | GE | 17-0891-02 | |
| GEM | |||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500 ml | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Tris Base | Roche | 03-118-142-001 | |
| HCl | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Common | |||
| Protease Inhibitors Tablets, Complete EDTA-free | Roche | 11-873-580-001 | |
| EQUIPMENT | |||
| 2 ml Douce All-Glass Tissue Grinders | Kimble Chase | 885300-0002 | |
| 15 ml Polypropylene Conical Centrifuge Tubes, BD Falcon | BD | 352097 | |
| 30 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-30 | |
| 15 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-15 | |
| Ultracentrifuge tubes, Ultra-Clear, Thinwall, 14×89 mm | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Parafilm | Cole-Parmer | PM996 | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets, 9″ | Fisher Scientific | 13-678-20C |
References
- Poburko, D., Kuo, K. H., Dai, J., Lee, C. H., van Breemen, C. Organellar junctions promote targeted Ca2+ signaling in smooth muscle: why two membranes are better than one. Trends Pharmacol. Sci. 25 (1), 8-15 (2004).
- Pani, B., Ong, H. L., Liu, X., Rauser, K., Ambudkar, I. S., Singh, B. B. Lipid rafts determine clustering of STIM1 in endoplasmic reticulum-plasma membrane junctions and regulation of store-operated Ca2+ entry (SOCE. J. Biol. Chem. 283 (25), 17333-17340 (2008).
- Levine, T., Rabouille, C. Endoplasmic reticulum: one continuous network compartmentalized by extrinsic cues. Curr. Opin. Cell Biol. 17 (4), 362-368 (2005).
- Sano, R., Annunziata, I., Patterson, A., Moshiach, S., Gomero, E., Opferman, J., Forte, M., d’Azzo, A. GM1-ganglioside accumulation at the mitochondria-associated ER membranes links ER stress to Ca(2+)-dependent mitochondrial apoptosis. Mol. Cell. 36 (3), 500-511 (2009).
- Raturi, A., Simmen, T. Where the endoplasmic reticulum and the mitochondrion tie the knot: The mitochondria-associated membrane (MAM). Biochim. Biophys. Acta. , (2012).
- Giorgi, C., De Stefani, D., Bononi, A., Rizzuto, R., Pinton, P. Structural and functional link between the mitochondrial network and the endoplasmic reticulum. Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1817-1827 (2009).
- d’Azzo, A., Tessitore, R. Sano Gangliosides as apoptotic signals in ER stress response. Cell Death Differ. 13, 404-414 (2006).
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial membrane permeabilization in cell death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
- Rizzuto, R., Brini, M., Murgia, M., Pozzan, T. Microdomains with high Ca2+ close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria. Science. 262, 744-747 (1993).
- Lynes, E. M., Bui, M., Yap, M. C., Benson, M. D., Schneider, B., Ellgaard, L., Berthiaume, L. G., Simmen, T. Palmitoylated TMX and calnexin target to the mitochondria-associated membrane. EMBO J. 31 (2), 457-470 (2011).
- Fujimoto, M., Hayashi, T., Su, T. P. The role of cholesterol in the association of endoplasmic reticulum membranes with mitochondria. Biochem. Biophys. Res. Commun. 417 (1), 635-639 (2012).
- Grimm, S. The ER-mitochondria interface: the social network of cell death. Biochim. Biophys. Acta. 1823 (2), 327-334 (2012).
- Vance, J. E. Phospholipid synthesis in a membrane fraction associated with mitochondria. J. Biol. Chem. 265, 7248-7256 (1990).
- Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat. Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).
- Pizzo, P., Viola, A. Lymphocyte lipid rafts: structure and function. Curr. Opin. Immunol. 15 (3), 255-260 (2003).
