Summary

Les mitochondries associées à membranes ER (SMMA) et glycosphingolipides microdomaines enrichis (GEM): Isolement à partir de cerveau de souris

Published: March 04, 2013
doi:

Summary

Cette procédure illustre comment isoler du cerveau de souris adulte les membranes des mitochondries associées à l'urgence ou la SMMA et les glycosphingolipides-fractions enrichies en microdomaines de MMA propres et préparations mitochondriales.

Abstract

Organites intracellulaires sont des structures très dynamiques avec plus ou moins de forme et de composition, qui sont soumis à des cellules spécifiques indices intrinsèques et extrinsèques. Leurs membranes sont souvent juxtaposées à des sites de contact définies, qui deviennent des plaques tournantes pour l'échange de molécules de signalisation et des composants membranaires 1,2,3,4. Les microdomaines membranaires inter-organites qui sont formées entre le réticulum endoplasmique (RE) et les mitochondries lors de l'ouverture de l'IP3 Ca 2 sensible à canal + sont connus comme les mitochondries associé-ER membranes ou SMMA 4,5,6. La composition en protéines / lipides et les propriétés biochimiques de ces sites de contact membranaire ont été étudiés en particulier par rapport à leur rôle dans la régulation intracellulaire de Ca 2 + 4,5,6. L'ER sert le magasin principal de la concentration intracellulaire de Ca 2 +, et à ce titre régit une multitude de processus cellulaires en aval de Ca 2 + signalisation, y comprisuding pliage post-traductionnelle de protéine et protéine maturation7. Mitochondries, d'autre part, maintenir l'homéostasie du Ca 2 +, par mise en mémoire tampon Ca 2 + concentration en empêchant ainsi l'ouverture de voies de l'apoptose en aval du Ca 2 + 4,8 balourd. La nature dynamique des MMA rend sites idéaux pour disséquer les mécanismes de base cellulaires, y compris le Ca 2 + signalisation et la réglementation des mitochondriale de Ca 2 + de survie biosynthèse des lipides concentration, et le transport, le métabolisme énergétique cellulaire et 4,9,10,11,12. Plusieurs protocoles ont été décrits pour la purification de ces microdomaines de tissus du foie et des cellules cultivées 13,14.

Les méthodes de prise en compte précédemment publiées, nous avons adapté un protocole pour l'isolement des mitochondries et des MMA propres du cerveau de souris adulte. Pour cette procédure, nous avons ajouté une étape de purification supplémentaire, à savoir une extraction Triton X100, qui enables de l'isolement du glycosphingolipide enrichi microdomaine (GEM) fraction des MMA. Ces préparations GEM partager des composants de plusieurs protéines avec des radeaux lipidiques et cavéoles, dérivées de la membrane plasmique ou d'autres membranes intracellulaires, et sont proposés à fonctionner comme des lieux de rencontre pour le regroupement des protéines réceptrices et des interactions protéine-protéine 4,15.

Protocol

Le protocole suivant est destiné à l'isolation et la purification de MMA propres et de pierres précieuses du cerveau de souris Solutions nécessaire pour l'isolement des mitochondries, MMA propres et de pierres précieuses Fractionnement pour obtenir brut préparation mitochondriale: Solution A: 0,32 M saccharose, 1 mM NaHCO 3, 1 mM de MgCl2, 0,5 mM de CaCl 2 + inhibiteur…

Representative Results

Basé sur notre expérience avec l'utilisation de ce protocole, nous pouvons en toute sécurité le recommande pour l'isolement et la purification de la SMMA, les pierres précieuses et les fractions mitochondriales de cerveau de souris. La procédure décrite est hautement reproductible et cohérente. Dans la figure 1, nous montrons une image représentative de la façon dont la couche mitochondries et MMA propres pure sur un gradient Percoll (étape 3.4). Une définie, bande laiteuse contenant…

Discussion

Les sites de contact entre les membranes intracellulaires ou organites entre la membrane plasmique des cellules plates-formes représentent dynamiques de signalisation pour les processus cellulaires de base. La caractérisation précise de leur fonction et la composition dans les deux conditions physiologiques et pathologiques nécessite des protocoles de purification fiables et reproductibles. Les méthodes décrites ici ont été spécifiquement optimisés par notre laboratoire pour l'isolement et la purification …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous reconnaissons la contribution de Renata Sano à concevoir le protocole initial. Ad'A. détient les bijoutiers pour les enfants (JFC) de la chaire de génétique et thérapie génique. Ce travail a été financé en partie par des subventions du NIH GM60905, DK52025 et CA021764, et les américains libanais syriens Associated Charities (ALSAC).

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalogue Number Comments
REAGENTS
Fractionation
Sucrose Fisher Scientific S5-500
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S-5761
Magnesium Chloride, Hexahydrate Fisher Scientific BP214-500
Calcium Chloride, Dihydrate Sigma-Aldrich C-5080
MAM
D-Mannitol Sigma-Aldrich M9546-250G
Hepes Fisher Scientific BP310-500
EGTA Sigma-Aldrich E4378-250G
BSA, Fraction V, Heat Shock, Lyophilizate Roche 03-116-964-001
Percoll GE 17-0891-02
GEM
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284-500 ml
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-3
Tris Base Roche 03-118-142-001
HCl Fisher Scientific A144S-500
EDTA Fisher Scientific BP120-500
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Fisher Scientific BP166-500
Common
Protease Inhibitors Tablets, Complete EDTA-free Roche 11-873-580-001
EQUIPMENT
2 ml Douce All-Glass Tissue Grinders Kimble Chase 885300-0002
15 ml Polypropylene Conical Centrifuge Tubes, BD Falcon BD 352097
30 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes Kimble Chase 45500-30
15 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes Kimble Chase 45500-15
Ultracentrifuge tubes, Ultra-Clear, Thinwall, 14×89 mm Beckman-Coulter 344059
Parafilm Cole-Parmer PM996
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets, 9″ Fisher Scientific 13-678-20C

References

  1. Poburko, D., Kuo, K. H., Dai, J., Lee, C. H., van Breemen, C. Organellar junctions promote targeted Ca2+ signaling in smooth muscle: why two membranes are better than one. Trends Pharmacol. Sci. 25 (1), 8-15 (2004).
  2. Pani, B., Ong, H. L., Liu, X., Rauser, K., Ambudkar, I. S., Singh, B. B. Lipid rafts determine clustering of STIM1 in endoplasmic reticulum-plasma membrane junctions and regulation of store-operated Ca2+ entry (SOCE. J. Biol. Chem. 283 (25), 17333-17340 (2008).
  3. Levine, T., Rabouille, C. Endoplasmic reticulum: one continuous network compartmentalized by extrinsic cues. Curr. Opin. Cell Biol. 17 (4), 362-368 (2005).
  4. Sano, R., Annunziata, I., Patterson, A., Moshiach, S., Gomero, E., Opferman, J., Forte, M., d’Azzo, A. GM1-ganglioside accumulation at the mitochondria-associated ER membranes links ER stress to Ca(2+)-dependent mitochondrial apoptosis. Mol. Cell. 36 (3), 500-511 (2009).
  5. Raturi, A., Simmen, T. Where the endoplasmic reticulum and the mitochondrion tie the knot: The mitochondria-associated membrane (MAM). Biochim. Biophys. Acta. , (2012).
  6. Giorgi, C., De Stefani, D., Bononi, A., Rizzuto, R., Pinton, P. Structural and functional link between the mitochondrial network and the endoplasmic reticulum. Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1817-1827 (2009).
  7. d’Azzo, A., Tessitore, R. Sano Gangliosides as apoptotic signals in ER stress response. Cell Death Differ. 13, 404-414 (2006).
  8. Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial membrane permeabilization in cell death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
  9. Rizzuto, R., Brini, M., Murgia, M., Pozzan, T. Microdomains with high Ca2+ close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria. Science. 262, 744-747 (1993).
  10. Lynes, E. M., Bui, M., Yap, M. C., Benson, M. D., Schneider, B., Ellgaard, L., Berthiaume, L. G., Simmen, T. Palmitoylated TMX and calnexin target to the mitochondria-associated membrane. EMBO J. 31 (2), 457-470 (2011).
  11. Fujimoto, M., Hayashi, T., Su, T. P. The role of cholesterol in the association of endoplasmic reticulum membranes with mitochondria. Biochem. Biophys. Res. Commun. 417 (1), 635-639 (2012).
  12. Grimm, S. The ER-mitochondria interface: the social network of cell death. Biochim. Biophys. Acta. 1823 (2), 327-334 (2012).
  13. Vance, J. E. Phospholipid synthesis in a membrane fraction associated with mitochondria. J. Biol. Chem. 265, 7248-7256 (1990).
  14. Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat. Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).
  15. Pizzo, P., Viola, A. Lymphocyte lipid rafts: structure and function. Curr. Opin. Immunol. 15 (3), 255-260 (2003).

Play Video

Cite This Article
Annunziata, I., Patterson, A., d’Azzo, A. Mitochondria-associated ER Membranes (MAMs) and Glycosphingolipid Enriched Microdomains (GEMs): Isolation from Mouse Brain. J. Vis. Exp. (73), e50215, doi:10.3791/50215 (2013).

View Video