ミトコンドリア関連のER膜（MAMS）とスフィンゴ糖脂質マイクロドメインエンリッチド（GEMS）：マウス脳から単離
Summary
この手順では、成体マウスの脳ミトコンドリア関連のER膜またはMAMSとMAMSとミトコンドリア調製物からスフィンゴ糖脂質に富むマイクロドメイン画分から単離する方法を示しています。
Abstract
細胞内小器官は、細胞特異的内因性および外因性の刺激にさらされる形状および組成を変化させると非常にダイナミックな構造です。その膜は、しばしば、シグナル伝達分子や膜成分1,2,3,4の交換のためのハブとなって定義されている接触部位で並置されている。 IP3は敏感なCa 2 +チャネルの開口部には小胞体（ER）とミトコンドリアの間に形成されている間オルガネラ膜マイクロドメインは、ミトコンドリア関連する- ER膜またはMAMS 4,5,6として知られている。タンパク質/脂質組成およびこれらの膜の接触部位の生化学的特性は、広範囲に、特に細胞内Ca 2 + 4,5,6の調節におけるそれらの役割に関連して研究されてきた。 ERは、細胞内Ca 2 +の主な店舗となっており、この容量で下流のCa 2の細胞プロセスの無数+シグナル、税込を調節翻訳後のタンパク質の折りたたみ及びタンパク質maturation7をuding。ミトコンドリアは、その一方で、それによって下流のCa 2 +のアンバランス4,8のアポトーシス経路の開始を防止する細胞内Ca 2 +濃度をバッファリングすることにより、Ca 2 +の恒常性を維持する。 MAMSの動的な性質は、それらの理想的なサイトは、Ca 2 +シグナル伝達とミトコンドリアのCa 2 +濃度、脂質生合成と輸送、エネルギー代謝と細胞生存4,9,10,11,12の調節など、基本的な細胞メカニズムを解剖することができます。いくつかのプロトコルが、肝組織および培養細胞13,14からこれらのマイクロドメインの精製の ために記載されている。
アカウントに以前に公開されている方法を取って、我々は、成体マウスの脳からミトコンドリアとMAMSを単離するためのプロトコルを適応している。この手順に、我々はどの電子すなわち余分な精製工程、トリトンX100の抽出を追加しましたnables MAMSのスフィンゴ糖脂質に富んだマイクロドメイン（GEM）の画分の単離。これらのGEMの製剤は、原形質膜または他の細胞内膜に由来し、カベオラや脂質ラフトといくつかのタンパク質成分を共有しており、受容体タンパク質のクラスタリングのために、タンパク質-タンパク質相互作用4,15の集まるポイントとして機能するように提案されている。
Protocol
Representative Results
Discussion
細胞内膜間または細胞小器官や細胞の細胞膜との間の接触部位は、基本的な細胞プロセスのためのダイナミックシグナリングプラットフォームを表します。生理学的および病理学の両方の条件下でその機能と組成の正確な特性評価には信頼性と再現性の高い精製プロトコルを必要とします。ここで詳述した方法は、特に成体マウスの脳からMAMSとそれらに対応する宝石の単離および精製のため…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は最初のプロトコルを妊娠中レナータ佐野の貢献を認める。 Ad'A。遺伝学と遺伝子治療に寄附チルドレン（JFC）のために宝石を保持しています。この作品は、NIHの助成金GM60905、DK52025とCA021764、アメリカレバノンシリア関連慈善団体（ALSAC）によって部分的に資金を供給された。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Fractionation | |||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-5761 | |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
| MAM | |||
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M9546-250G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378-250G | |
| BSA, Fraction V, Heat Shock, Lyophilizate | Roche | 03-116-964-001 | |
| Percoll | GE | 17-0891-02 | |
| GEM | |||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500 ml | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Tris Base | Roche | 03-118-142-001 | |
| HCl | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Common | |||
| Protease Inhibitors Tablets, Complete EDTA-free | Roche | 11-873-580-001 | |
| EQUIPMENT | |||
| 2 ml Douce All-Glass Tissue Grinders | Kimble Chase | 885300-0002 | |
| 15 ml Polypropylene Conical Centrifuge Tubes, BD Falcon | BD | 352097 | |
| 30 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-30 | |
| 15 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-15 | |
| Ultracentrifuge tubes, Ultra-Clear, Thinwall, 14×89 mm | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Parafilm | Cole-Parmer | PM996 | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets, 9″ | Fisher Scientific | 13-678-20C |
References
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