Summary
Hier beschrijven we een methode, gevolgd door microdissectie fluorescerende kleurstof injectie in de akoestische ganglion vroege kippenembryo's voor selectieve tracering van auditieve axon vezels in de zenuw en achterhersenen.
Abstract
De embryonale kuiken is een veel gebruikt model voor de studie van perifere en centrale ganglion cel projecties. In het auditieve systeem, zou selectieve kenmerken van auditieve axonen in het VIIIe hersenzenuw verbeteren van de studie van de centrale auditieve circuit ontwikkeling. Deze aanpak is een uitdaging omdat meerdere zintuigen van het binnenoor bij te dragen tot de VIIIe zenuw 1. Bovendien markers die betrouwbaar auditieve onderscheiden ten opzichte van vestibulaire groepen van axonen binnen het aviaire VIIIe zenuw moeten nog worden geïdentificeerd. Auditieve en vestibulaire paden kan niet functioneel worden onderscheiden in het begin van embryo's, als zintuiglijke-reacties van de consument zijn niet aanwezig voor het schakelingen worden gevormd. Centraal projecteren VIIIe zenuw axonen zijn getraceerd in sommige studies, maar auditief axon labeling werd gevoegd waarin de door de andere VIIIe zenuw componenten 2,3. We beschrijven een werkwijze voor anterograde tracing van de akoestische ganglion selectief label auditieve axonen in het ontwikkelen van VIIIe zenuw. Ten eerste, na gedeeltelijke ontleding van het voorste Cephalic gebied van een 8-daagse kippenembryo ondergedompeld in zuurstofrijk kunstmatige cerebrospinale vloeistof, wordt het cochleaire kanaal geïdentificeerd door anatomische oriëntatiepunten. Vervolgens wordt een boete getrokken glazen micropipet gepositioneerd om een kleine hoeveelheid rhodamine dextran amine injecteren in het kanaal en diep aangrenzende gebied waar de akoestische ganglion cellen zich bevinden. Binnen dertig minuten na de injectie, zijn auditieve axonen centraal getraceerd in de achterhersenen en kunnen later worden gevisualiseerd na histologische voorbereiding. Deze methode biedt een handig hulpmiddel voor ontwikkelingsstudies van perifeer naar centrale auditieve circuit formatie.
Protocol
1. Bereid de volgende Dissectiemateriaal en reagentia
- Kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF, 130 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM KH 2PO 4, 20 mM NaHCO 3, 3 mM HEPES, 10 mM Glucose, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgSO4) continu toegediend met 95% O 2/5% CO 2 bij kamertemperatuur. Voor infusie vullen tot 2/3 van 500 ml met wijde hals Nalgene pot met een gat in het deksel. Tank wordt bevestigd door een glazen buis stam bubbler, die de aCSF dringt door het gat in de pot deksel. Bandenspanning een constante stroom van belletjes die reiken ongeveer 1/3 van de vloeistof maar niet krachtig genoeg om spatten over de rand te verkrijgen. Submerge 5 ml glazen flacons (tot 6) in de Nalgene pot om individuele monsters scheiden van elkaar en van de gasstroom turbulentie. ACSF worden zuurstof ten minste 20 min voorafgaand aan de incubatie weefsel.
- Kleine siliconen dissectie schotel (35 mm x 10mm Petri gecoat met behulp van Sylgard elastomeren Kit) met twee dissectie pinnen geplaatst in kleine zeshoekige polystyreen (47 mm onder) wegen boot.
- Twee fijne tip forceps, een gebogen tip forceps, een 50 ml beker en een houder voor weefsel afval.
- Getrokken glazen micropipet (1,2 OD / 0,9 ID) gebroken ongeveer 20-50 urn opening aan het uiteinde en gevuld met rhodamine dextran amine (RDA, MW = 3.000, Invitrogen) in een 6,25% oplossing met 0,4% Triton X-100 in PBS . Bevestig door fijne slang aan picospritzer en te stabiliseren tot micromanipulator.
2. Microdissectie basilaire papilla te onthullen op E8 4,5
- Met gebogen pincet, snijd E8 embryo net onder de hersenstam, het plaatsen van het hoofd direct op silicone-coated dissectie gerecht binnen wegen boot.
- Met behulp van dissectie pinnen, het hoofd te positioneren met een ventrale uitzicht, dus het oor aan de kant van belang is licht zichtbaar, het hoofd iets schuin dorsaal en wijst 10 tot 30 graden van center (Figuur 2A). Onmiddellijk zet de kop met spelden. Als de bilaterale tracering is gewenst, in het midden van de kop op 0 graden, of een volledige ventrale uitzicht, dus beide kanten kunnen worden benaderd. Ook voor een linkszijdige injectie, zet de kop bij -10 tot -30 graden van het centrum, zodat de linkerkant toegankelijk is.
- Met behulp van de 50 ml bekerglas, breng 30 ml van zuurstofrijk aCSF in de schaal, volledig onder te dompelen het weefsel.
- Voorzichtig te grijpen en schil langs de onderkaak met behulp van fine-tip tang, dan het onderste ooglid te verwijderen aan de zijkant van belang.
- Verwijder de bovenliggende vaatweefsel, met inbegrip van alle resterende gehemelte en slokdarm. Deze zachte weefsels moeten afpellen onthullen het gladde oppervlak van de ontwikkeling van chondrocranium met de kenmerkende vertebrale slagaders aan het oppervlak. Door dit punt, moet de karakteristieke witte otoconial massa zichtbaar zijn.
- Voorzichtig ontleden de huid rond de externe gehoorgang, kraakbeen van het kaakgewricht en het middenoor, terwijl de inner oor intact. Gebruik de tang om voorzichtig weggesneden deze kraakbeenachtige structuren.
- Verwijder vertebrale slagaders en bundeling bloed met behulp van een zachte zwaaiende beweging met de fijne tang tips. Bloed kan belemmeren uitzicht en coagulatie kan de injectie pipet opening sluit.
- De cochleaire buis met aangrenzende sensorische epitheel (basilaire papilla) en akoestische ganglion ligt direct onder de chondrocranium 6 en kan worden gevisualiseerd als een langwerpige vingervormige uitsteeksel zich vanaf het binnenoor ventraal, de meest distale punt (apex) bij de voorste middellijn 5. Er een kleine pooling van bloed (rood) vanaf de dissectie en / of otolithic verkalkingen (wit) aan de top van de cochleaire kanaal (Figuur 2B) dat kan helpen bij visualisatie. Bij de top is de lagenar macula, een zintuiglijke patch waarschijnlijk van vestibulaire functie 7,8.
3. Selectieve Labeling van de GN-VIII Auditieve Vezels
- Langzaam zakken de micropipet om eerst doorboren de schedel. Deze schedel is dunner dan de omliggende gebieden en vereist minder kracht te dringen. De micropipet moet nu in de cochleaire kanaal. Optioneel: een kleine injectie van de tracering kleurstof kan hier gemaakt worden om te helpen bij het visualiseren van de basilaire papilla.
- Zonder het herpositioneren van de micropipet, verder te verlagen tot het net strijd is met de diepe rand van het cochleaire kanaal (figuur 1). Hier voert een injectie en herhaal in meerdere gebieden langs de lengte van de basilaire papilla (Figuren 2C, 2D), exclusief de meest proximale uiteinde waar de vestibulaire lagena bevindt. Met de picospritzer ingesteld tussen 10-30 psi, zijn meerdere injecties gemaakt. De hoeveelheid ingespoten kleurstof vloeistof varieert en is afhankelijk van de mate van gewenste etikettering. Iedere injectie moet resulteren in een fluorescente kleurstof-labeled spot van circa 200 - 400 urn diameter (figuur 2D).
- Nadat de injectie is voltooid, een tang om het monster boven de hersenstam doorsnijden en een transferpipet gebruiken om de caudale gedeelte plaatsen in een potje in de houder van aCSF voortdurend perfusie met 95% O2 / 5% CO 2.
- Voor elk embryo, laat 20-30 min voor kleurstofoverdracht, afhankelijk van de afstand van de centrale tracing gewenst.
- Verwijder weefsel en voor te bereiden op histologische coupes. In het voorbeeld wordt weefsel ondergedompeld in 4% paraformaldehyde (in 1X PBS) gedurende de nacht, 30% sucrose (in 1X PBS) gedurende een nacht.
4. Tegenkleuring en Analyse
- Tegenkleuring is nuttig om te helpen oriënteren de waarnemer anatomische locatie, alsmede de bijzondere regio's van belang vast te stellen. Een effectieve tegenkleuring in dit preparaat neurofilament immunokleuring (figuren 1, 3B, 3E), die sterk lAbels axonen en maakt afbakening van axonale stukken in het CZS.
- Analyse worden uitgevoerd binnen de label regio en de uitsteeksels kunnen honderden microns of meer zich langs de as rostrocaudal. Enkele voorbeelden van eenvoudige analyses zijn: targeting foutenpercentages, timing en / of veranderingen in de divergentie van projectie patronen. RDA-gelabelde axons gevisualiseerd in het perifere en centrale zenuwstelsel met hoge resolutie (Figuren 3A, 3D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De componenten van de VIIIe zenuw en de anatomie van de zenuw zelf complexe en ingewikkelde (figuren 1, 3). Door selectief traceren vezels als gevolg van akoestische ganglioncellen, kan segmenten van de VIIIe zenuw en primaire afferenten auditieve hersenstam binnen de correct worden opgespoord en onderscheiden van hun tegenhangers vestibulaire (figuren 2, 3). Evenzo kan deze techniek gebruikt om perifere projecties van de akoestische ganglion cellen (Figuur 3G) bestuderen of aangepast om projecties die voortvloeien uit individuele vestibulaire organen bestuderen. Omdat axonen zijn netjes getraceerd langs hun gehele lengte, nauwkeurige kwantitatieve analyses worden uitgevoerd onderscheidende auditieve van vestibulair projecties tijdens de ontwikkeling, met inbegrip van precieze timing en patronen van de eerste innervatie, gericht op fouten, enz. Bovendien, in tegenstelling tot de vorige aanpak van auditieve vezels etikettering, deze aanpak is prestatiesmed van niet gefixeerde levend weefsel en kan dus worden gebruikt om gelijktijdig andere in vitro experimenten.
Hoewel deze techniek geschikt is voor embryo's van E6-E9, de beste resultaten begint om E8 als auditieve axons zijn geprikkeld hun primaire doelen centrale 3. Daarentegen vestibulaire uitsteeksels komen in de hersenstam eerder 9,10 en dus zou als betere kandidaten voor eerdere opsporing, hoewel technisch uitdagend door de kleine omvang en relatieve onrijpheid van het vestibulum op deze leeftijd. Coupes worden onderzocht om de locatie van kleurstof injectie bevestigen, aangezien het meest apicale gebied van de basilaire papilla bevat een kleine sensorische patch waarschijnlijk van vestibulaire functie en als label zou kunnen besmetten de resultaten.
Zodra de onderzoeker bekend is met de anatomie, drie van de meest voorkomende problemen zijn als volgt:
- Het cochleair duct is gevuld met het traceren van kleurstof, maar ganglion cel axonen niet gelabeld. Dit probleem geeft waarschijnlijk dat de injectie niet werd uitgevoerd diep om het cochleair kanaal, waar het ganglion cellen en zenuwvezels bevinden. Dit probleem kan worden verholpen door ervoor te zorgen dat de injectie micropipet eerste puncties de chondrocranium vervolgens voorzichtig zo geavanceerd om gewoon punctie door de andere kant van het kanaal. Als alternatief kan de injectie pipet correct zijn geplaatst maar heeft onvoldoende hoeveelheden kleurstof. Het verhogen inspuitdruk of het aantal injecties kan ook hier verandering in brengen.
- De zenuw ongeluk doorsneden als gevolg van overmatig trekken tijdens het kraakbeenachtige labyrinth dissectie. Dit probleem kan worden vermeden door fijne dissectie technieken en beperkt ontleding van het middenoor.
- De injectie is te uitgebreid en per ongeluk labelt andere zintuiglijke ganglion cellen of vezels die voortvloeien uit andere zenuw componenten. This probleem kan worden beperkt door het optimaliseren injectie protocollen en vereisen minder inspuitdruk of het aantal pulsen of verschuiving van de plaats van injectie.
Twee voorbeelden van mogelijke analyses zijn:
- Divergentie van projectie patronen: bepaalt de mate van het label axonen langs een bepaalde as en hoe ze kunnen worden beïnvloed volgende experimenten. Rostrocaudal divergentie kan worden omschreven als:
(Aantal secties die gelabeld axons) x (dikte van elke sectie) Deze maatregel kan worden gecorrigeerd voor de mate van kleurstof label in verhouding tot de basilaire papilla of in tegengekleurd weefsel, voor het gedeelte van VIIIe gelabeld zenuwaxonen. Dit is een handig hulpmiddel voor het analyseren van topografische projecties, de gelabelde axonen kan netjes worden teruggevoerd op hun terminal velden in de achterhersenen. Voor metingen van tonotopy moet kleurstof injecties worden beperkt tot het gebied van belang langs de basIlar papil.
- Targeting fouten: bepaalt de frequentie van mistargeted axons voor elk tevoren bepaald gebied van de geanalyseerde weefsels (kan per sectie per embryo, etc.). Verstoringen kunnen leiden tot axonen na een abnormale projectie pad of eindigend in een ongeschikte omgeving. Bij het kwantificeren fouten, moet het aantal worden genormaliseerd om rekening te houden voor verschil in injectie bedragen tussen embryo's. Kleinere injecties meer leiden tot het vermogen enkelvoudige axons scoren. Een basis targeting foutenanalyse kan worden omschreven als:
Figuur 1. Coronale uitzicht E6 hersenstam voor vereenvoudiging metbilaterale akoestische ganglia intact. geschematiseerde rode pipet illustreert nauwkeurig richten van akoestische ganglion cellen van een dorsolaterale ingangspunt. Secties worden immunolabeled met anti-neurofilament om axonale projecties te markeren. Vestibulaire organen zijn rostraal getoond secties. Regio van de RDA injectie voor selectieve auditieve vezels tracing gedemonstreerd met rode pipet illustratie. VIII = evenwichtszenuw zenuw, AG = akoestische ganglion, VG = vestibulaire ganglion. Dorsale om is. Scale bar = 300 urn.
Figuur 2. Microdissection en injectie van doelgebied. (A) Een goede positie van embryo op dissectie schotel, ventrale uitzicht met hoofd gekanteld dorsaal en draaide een beetje naar de zijkant om een betere toegang tot de rechter kant mogelijk te maken. Rechts ear getoond en onderliggende basilaire papilla wordt aangegeven met een stippellijn. Pijlpunt in (A) en (B) toont beginpositie van pipet insertie (B) Na dissectie een witte otoconial massa zichtbaar afbakening van de apicale rand van de basilaire papilla (pijl). (C, D) eerst injectie geven een schetsen van het cochleair kanaal. (D) Volgende injecties moeten worden gemaakt gewoon diep om het cochleair kanaal en basilaire papilla in de akoestische ganglion regio. RDA fluorescentie nuttig voor het versterken injectie dieptewaarneming en iedere injectie dient een fluorescerende kleurstof gemerkte spot van ongeveer 200 maken - 400 urn diameter zoals hier. Schaal bar = 2 mm.
Figure 3. Afbeeldingen slechts ter illustratie van selectieve auditieve vezels tracing in een E8 embryo. (AC) Lage macht en (DG) hoog vermogen 25 pm coronale secties bij dezelfde embryo in verschillende vlakken. (A) RDA gelabeld axonen kunnen worden getraceerd van de plaats van injectie (pijlpunt ), door de hersenzenuw (pijl) en caudaal in de richting van de primaire auditieve kernen doelstellingen (dubbele pijlpunt). (B) immunokleuring met anti-neurofilament antilichaam hoogtepunten alle axonale projecties en de RDA-getraceerd vezels van (A) binnen de auditieve projectie pathway. Overlay afzonderlijke (A) en (B) kanalen weergegeven als een kleur samenvoegen in (C). (DF) High power beeld van hetzelfde embryo in een caudale positie toont (A) hoge resolutie van vezels op de zenuw ingang ( pijl) langs de middenas pathway (dubbele pijlpunt). (E) </ Strong> neurofilament vlek van alle axonen mogelijk maakt afbakening van de PNS-CZS alsmede vermeende auditieve versus vestibulaire projecties. Ap en Vp aangeven respectieve auditieve en vestibulaire componenten perifere aan de zenuw entry point, terwijl Ac en Vc aangeven respectieve auditieve en vestibulaire projecties centraal in de zenuw ingangspunt. Overlay afzonderlijke (D) en (E) kanalen weergegeven als een kleur samenvoegen (F). (G) Histologisch onderzoek van de akoestische ganglion blijkt plaats van gelabelde akoestische ganglioncellen van het opsporen weergegeven in (AF) en de perifere projecties ( sterretje) zijn retrograad terug te voeren op de basilaire papilla. (H) Illustratie van een 700 pm tracing pad verwacht met auditieve-specifieke VIII etikettering op E8. Injectieplaats (rode cirkel) is caudaal van zenuw entry point, en de centrale projecties reizen rostrale en caudaal een keer in de achterhersenen. Vp = perifere vestibular, Ap = perifere auditieve, Vc = centrale vestibulaire, Ac = centrale auditieve, AG = akoestische ganglion, BP = basilaire papilla, LM = lagenar macula, SVG = superieure vestibulaire ganglion, IVG = inferieur vestibulaire ganglion. Schaal bar = 300 urn voor AC, 100 micrometer voor DF, 100 urn in G en H in 500 urn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studies van de vroege ontwikkeling van de VIIIe zenuw zijn beperkt voor een deel als gevolg van de moeilijkheid bij het identificeren van embryonale axonen die voortvloeien uit meerdere, afzonderlijke ganglia. Verschillende studies hebben gekeken naar de moleculaire signalen geleiden auditieve en vestibulaire sensorische ganglion cel en celtypes tijdens de vroege ontwikkeling, maar 5,11,12 processen reguleren centrale innervatie nog worden bepaald. Verslagen van akoestische ganglion cel projecties doorgaans beschrijven perifere processen om sensorische epitheel 13-15, terwijl minder is bekend over de centrale processen projecteren op de primaire kernen. Studies van centraal uitstekende VIII onderdelen tijdens embryogenese vaak elektrofysiologische, zoals optische opnames in embryonale chick achterhersenen 16 of calcium beeldvorming in een zoogdierweefsel segment 17, maar niet voor de voltooiing van neurale circuits worden uitgevoerd. Het gebruik van immunologische merkers labelauditieve axonen in de kuiken VIIIe zenuw is momenteel niet haalbaar is. Hoewel verschillende groepen van transcriptiefactoren geïdentificeerd die samenhangen met auditieve versus vestibulaire neuronen 18-23, wordt de expressie van deze factoren uitgesloten axonen. Bij muizen zijn verschillen gevonden tussen spiraal ganglia en vestibulaire ganglia in genexpressie, waaronder een aantal veelbelovende kandidaten dat axongroei kunnen differentiëren tussen de modaliteiten. 23 Nader onderzoek van deze genproducten kan opleveren belangrijke instrumenten voor zowel zoogdieren en vogels studies. Met de hier beschreven methoden, kan auditieve vezels in levende embryonaal weefsel met een intact auditieve circuit selectief te voeren op hun centrale targets.
Het kippenembryo is een nuttige vertebrate voor ontwikkelingsbiologen en kan een aantal beperkingen in zoogdiersystemen overwinnen. Regulering van de vroege binnenoor patroonvorming en morfogenese invogels toont opmerkelijke gelijkenis met 1,12 zoogdieren, terwijl kippenembryo's groter en beter toegankelijk dan knaagdieren embryo in een vroeg stadium wanneer de perifere gehoorsysteem wordt gevormd. De methode die hier gepresenteerd voor selectieve opsporing van auditieve vezels vergemakkelijkt vroeg experimenten op de centrale projecties van de zich ontwikkelende binnenoor.
We hebben dit protocol in een poging om differentieel identificeren centrale auditieve projecties van de VIIIe zenuw, maar ook kan worden aangepast om selectief labelen vezels van andere zintuigen van het binnenoor. In tegenstelling tot eerder beschreven werkwijzen, wordt deze procedure uitgevoerd op levend weefsel door het hele circuit intact. Een uitgevoerd Dezelfde methode werd gebruikt om de timing van auditieve VIII afferente innervatie beschrijven in aviaire embryogenese, maar vestibulaire vezels werden ongewild gelabeld 3 Hier een werkwijze om duidelijk regio of.igin en beëindiging, alsmede een hoge enkele vezel resolutie van select centraal projecteren auditieve afferenten tijdens gewervelde embryogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten worden gedeclareerd.
Acknowledgments
De auteurs willen dr. Candace Hsieh bedanken voor suggesties en hulp bij beeldvormende technieken en Dr Doris Wu voor expertise op het gebied chick binnenoor anatomie tijdens de vroege embryogenese. Dit werk werd ondersteund door NSF IOS-0642346, NIH T32-DC010775, NIH T32-GM008620, NIH R01-DC010796, en DOE GAANN P200A120165.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene Weigh Dish | Fisher Scientific | 02-202-101 | |
| Petri Dish, 35 X 10 mm | Fisher Scientific | 50820644 | Use to make silicone dissection dish |
| Sylgard Silicone Elastomer Kit | World Precision Instruments | SYLG184 | Coat Petri to make dissection dish |
| Dissection Pins | Various | Holds embryo in place during dissection | |
| NaCL | Various | part of aCSF recipe | |
| KCl | Various | part of aCSF recipe | |
| KH2PO4 | Various | part of aCSF recipe | |
| NaHCO3 | Various | part of aCSF recipe | |
| Glucose | Various | part of aCSF recipe | |
| CaCl2 | Various | part of aCSF recipe | |
| MgSO4 | Various | part of aCSF recipe | |
| Container for aCSF. Suggest translucent wide-mouth Nalgene jar, 500 ml (16 oz) with lid. | CPLabSafety | QP-PLC-03717 | Drill hole opening in top of lid for glass bubling stem to penetrate liquid |
| Empty 5 ml glass vial or comparable transparent vial | American Pharmaceutical Partners, Inc | 6332300105 | Use during aCSF incubation to keep samples separate from each other and from the bubbling stream |
| Tank of carbogen (95%O2 / 5%CO2) connected by tubing to bubbler | Various | Attach by tubing to glass stem bubbler for infusion into aCSF | |
| Glass stem bubbler | Various | To infuse carbogen into aCSF | |
| Curved-tip forceps | World Precision Instruments | 501008 | To remove embryo head from egg |
| Two fine-tip forceps | World Precision Instruments | 501985 | For micro-dissection |
| 50 ml Beaker | various | ||
| Rhodamine Dextran Amine (RDA) | Invitrogen | various | Fluorescent axon tracer |
| Triton X-100 | ICN Biomedicals | ||
| Phosphate Buffered Saline, (1X PBS) | Various | Standard lab reagent | |
| Thin Wall Glass Capillaries, 1.2 OD, .9 ID 4" (100 mm) length | World Precision Instruments | TW120F-4 | Load with RDA. Each capillary makes two glass micropipettes |
| Needle / Pipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | Settings used: Heat 16.4, Solenoid 2.2 |
| Picospritzer | Parker Instrumentation | various | Attach by fine tubing to glass micropipette |
| Micromanipulator | Narishige | various | |
| Dissection microscope with fluorescence | Various | ||
| 4% Paraformaldehyde | Various | Standard lab reagent | |
| anti-Neurofilament antibody, optional | Millipore | AB1991 | Follow histological protocol recommended by manufacturer |
| Cryostat and associated materials for sectioning | Leica | various | |
| Epifluorescent microscope for imaging | Zeiss, various |
References
- Groves, A. K., Fekete, D. M. Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning. Development. 139, 245-257 (2012).
- Pflieger, J. F., Cabana, T. The vestibular primary afferents and the vestibulospinal projections in the developing and adult opossum, Monodelphis domestica. Anatomy and Embryology. 194, 75-88 (1996).
- Molea, D., Rubel, E. W. Timing and topography of nucleus magnocellularis innervation by the cochlear ganglion. The Journal of Comparative Neurology. 466, 577-591 (2003).
- Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken. The Journal of Comparative Neurology. 368, 620-630 (1996).
- Brigande, J. V., Kiernan, A. E., Gao, X., Iten, L. E., Fekete, D. M. Molecular genetics of pattern formation in the inner ear: do compartment boundaries play a role. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11700-11706 (1073).
- Bellairs, R., Osmond, M. The atlas of chick development. , 2nd Edn, Elsevier. (2005).
- Manley, G. A., Haeseler, C., Brix, J. Innervation patterns and spontaneous activity of afferent fibres to the lagenar macula and apical basilar papilla of the chick's cochlea. Hearing Research. 56, 211-226 (1991).
- Code, R. A. Efferent neurons to the macular lagena in the embryonic chick. Hearing Research. 82, 26-30 (1995).
- Maklad, A., Fritzsch, B. Development of vestibular afferent projections into the hindbrain and their central targets. Brain Research Bulletin. 60, 497-510 (2003).
- Rubel, E. W., Fritzsch, B. Auditory system development: primary auditory neurons and their targets. Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).
- Satoh, T., Fekete, D. M. Lineage analysis of inner ear cells using genomic tags for clonal identification. Methods Mol. Biol. 493, 47-63 (2009).
- Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. The International Journal of Developmental Biology. 51, 521-533 (2007).
- Appler, J. M., Goodrich, L. V. Connecting the ear to the brain: Molecular mechanisms of auditory circuit assembly. Progress in Neurobiology. 93, 488-508 (2011).
- Bulankina, A. V., Moser, T. Neural circuit development in the mammalian cochlea. Physiology (Bethesda). 27, 100-112 (2012).
- Fekete, D. M., Campero, A. M. Axon guidance in the inner ear. The International Journal of Developmental Biology. 51, 549-556 (2007).
- Momose-Sato, Y., Glover, J. C., Sato, K. Development of functional synaptic connections in the auditory system visualized with optical recording: afferent-evoked activity is present from early stages. Journal of Neurophysiology. 96, 1949-1962 (2006).
- Marrs, G. S., Spirou, G. A. Embryonic assembly of auditory circuits: spiral ganglion and brainstem. The Journal of Physiology. 590, 2391-2408 (2012).
- Milo, M., et al. Genomic analysis of the function of the transcription factor gata3 during development of the mammalian inner ear. PloS One. 4, e7144 (2009).
- Fritzsch, B., Eberl, D. F., Beisel, K. W. The role of bHLH genes in ear development and evolution: revisiting a 10-year-old hypothesis. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67, 3089-3099 (2010).
- Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. Neurod1 regulates survival and formation of connections in mouse ear and brain. Cell and Tissue Research. 341, 95-110 (2010).
- Huang, E. J., et al. Brn3a is a transcriptional regulator of soma size, target field innervation and axon pathfinding of inner ear sensory neurons. Development. 128, 2421-2432 (2001).
- Jones, J. M., Warchol, M. E. Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 516, 507-518 (2009).
- Lu, C. C., Appler, J. M., Houseman, E. A., Goodrich, L. V. Developmental profiling of spiral ganglion neurons reveals insights into auditory circuit assembly. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 10903-10918 (2011).
