Summary
Hier beschreiben wir eine Technik, die von Mikrodissektion Fluoreszenzfarbstoff Injektion in den akustischen Ganglion frühen Hühnerembryonen zur selektiven Rückverfolgung von auditorischen Axon Fasern im Nerv und Rautenhirn gefolgt.
Abstract
Die embryonale Küken ist ein weit verbreitetes Modell für die Untersuchung der peripheren und zentralen Ganglienzellen Projektionen. Im auditorischen System würde selektive Markierung von auditiven Axone innerhalb des VIII. Hirnnerven verbessern das Studium der zentralen auditorischen Schaltungsentwicklung. Dieser Ansatz ist schwierig, weil mehrere Sinnesorgane des Innenohrs der VIII. Nerven 1 beitragen. Darüber hinaus haben Markern, die zuverlässig unterscheiden auditive gegenüber vestibulären Gruppen von Axonen innerhalb der Vogelgrippe VIII. Nerven noch nicht identifiziert werden. Auditive und vestibulären Wege nicht funktional in frühen Embryonen unterschieden werden, als sensorische hervorgerufenen Reaktionen nicht vorhanden sind, bevor die Schaltungen ausgebildet sind. Zentral vorstehenden VIII. Nervenaxone haben in einigen Studien verfolgt worden, aber auditiven Axon Markierung wurde durch Markierung von anderen VIII. Nerven Bauteile 2,3 begleitet. Hier beschreiben wir eine Methode zur anterograde Tracing von der akustischen ganglion selektiv label auditiven Axone innerhalb des sich entwickelnden VIII. Nerven. Erste, nach teilweiser Durchtrennung des vorderen Schädelbereich des 8-tägiger Hühnerembryos in sauerstoffhaltigen künstliche Zerebrospinalflüssigkeit eingetaucht wird der Kanal durch Cochlea anatomischen Landmarken identifiziert. Als Nächstes wird ein feiner gezogen Glasmikropipette positioniert, um eine kleine Menge an Rhodamin Dextran Amin in den Kanal und benachbart tiefen Bereich, wo die akustischen Ganglienzellen befinden injizieren. Innerhalb 30 Minuten nach der Injektion werden auditive Axone zentral in den Hinterhirn zurückverfolgt und können später visualisiert werden nach histologischen Vorbereitung. Diese Methode liefert ein nützliches Werkzeug für Entwicklungsstudien der peripheren zum zentralen auditorischen Schaltung Bildung.
Protocol
Ein. Bereiten Sie die folgenden Dissection Tools und Reagenzien
- Künstlicher zerebrospinaler Flüssigkeit (ACSF; 130 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM KH 2 PO 4, 20 mM NaHCO 3, 3 mM HEPES, 10 mM Glucose, 2 mM CaCl 2, 1,3 mM MgSO 4) kontinuierlich mit 95% O infundiert 2/5% CO 2 bei Raumtemperatur. Infusionslösung, zu 2/3 eine 500 ml Nalgene Weithals-Glas mit einem Loch im Deckel gebohrt füllen. Tank wird über einen Schlauch zu einem Glasfuß Gasspüler, der die aCSF dringt durch das Loch im Glas Deckel befestigt werden. Passen Druck, um einen konstanten Strom von Blasen, die etwa 1/3 der Flüssigkeit zu erreichen, sind aber nicht stark genug, um zu bewirken spritzt über die Felge zu erhalten. Submerge 5 ml Glasampullen (bis 6) in das Glas zu Nalgene einzelnen Proben voneinander und aus dem Gasstrom Turbulenzen zu trennen. ACSF sollte mindestens 20 Minuten vor jedem Gewebe Inkubationszeit Sauerstoff versorgt werden.
- Kleine Silikon-Dissektion Teller (35 mm x 10mm Petri beschichtet mit Sylgard Elastomere Kit) mit zwei Dissektion Stifte in kleine sechseckige Polystyrol gelegt (47 mm unten) Wiegeschiffchen.
- Zwei feinen Spitze-Zange, eine gekrümmte Spitze-Zange, einer 50 ml-Becher, und einen Behälter für das Tissue Abfall.
- Gezogen Glasmikropipette (1,2 OD / 0,9 ID) zerbrochen zu etwa 20-50 um die Öffnung an der Spitze und mit Rhodamin Dextran Amin (RDA, MW = 3.000, Invitrogen) in einer 6,25% igen Lösung mit 0,4% Triton X-100 in PBS . Bringen Sie durch feine Schlauch an picospritzer und Mikromanipulator stabilisieren.
2. Micro-Dissektion Basilar Papilla am E8 4,5 Reveal
- Mit gebogenen Pinzette, schneiden E8 Embryo direkt unter dem Hirnstamm, indem Kopf direkt auf silikonbeschichteten Dissektion Gericht in Wiegeschiffchen.
- Mit Dissektion Stifte, positionieren Sie den Kopf mit einem ventral so das Ohr auf der Seite von Interesse ist leicht sichtbar, geneigt der Kopf leicht nach dorsal und zeigt 10-30 Grad weg von center (Abbildung 2A). Unmittelbar sichern den Kopf mit Stiften. Wenn bilateralen Ablaufverfolgung gewünscht wird, in der Mitte der Kopf bei 0 Grad, oder eine vollständige ventral, so dass beide Seiten zugegriffen werden kann. Ähnliches gilt bei einer linksseitigen Injektion, sichern den Kopf bei -10 bis -30 Grad von der Mitte, so dass die linke Seite zugänglich ist.
- Mit dem 50-ml-Becher, übertragen 30 ml des oxygenierten aCSF in die Schüssel, voll Eintauchen des Gewebes.
- Fassen und schälen sich den Unterkiefer mit feiner Spitze Pinzette, dann entfernen Sie das untere Augenlid auf der Seite von Interesse.
- Entfernen Sie den darüberliegenden Gefäßgewebe, einschließlich aller übrigen Gaumen und Kehle. Diese weichen Geweben sollte abzuschälen enthüllt die glatte Oberfläche zu entwickeln Chondrocranium mit den unverwechselbaren Vertebralarterien an seiner Oberfläche. Zu diesem Zeitpunkt sollte die charakteristischen weißen otoconial Masse sichtbar sein.
- Vorsichtig zu sezieren die Haut um den äußeren Gehörgang, Knorpel des Kiefergelenks und des Mittelohrs, während die inner Ohr intakt. Verwenden Sie die Pinzette vorsichtig weggeschnitten diese knorpeligen Strukturen.
- Entfernen Vertebralarterien und Bündelung Blut mit einem sanften Kehrbewegung mit den feinen Pinzette Tipps. Blut kann darüber hinwegtäuschen, Ansicht und Koagulation kann die Injektionspipette Öffnung stecken.
- Das Cochlea Kanal mit benachbarten Sinnesepithel (basilaris Papilla) und akustische Ganglion liegt direkt unterhalb der Chondrocranium 6 und kann als länglicher fingerartigen Vorsprung aus dem Innenohr ventral, mit der am weitesten distalen Spitze (Apex) in der Nähe des vorderen visualisiert Mittellinie 5. Es kann eine kleine Ansammlung von Blut (rote) werden aus der Dissektion und / oder otolithic Verkalkungen (weiß) im Scheitelpunkt des Cochlea Kanal (2B), die in Visualisierung unterstützen kann. An der Spitze ist die lagenar Makula, dachte eine sensorische Patch der vestibulären Funktion 7,8 sein.
3. Selektive Markierung von CN VIII Auditory Fibers
- Langsam senken die Mikropipette zum ersten Punktion der Schädel. Diese Oberkopf ist dünner als die Umgebung und erfordert weniger Kraftaufwand zu durchdringen. Die Mikropipette sollte nun im Inneren des Ductus cochlearis sein. Optional: eine kleine Injektion von Tracing Farbstoff kann hier gemacht werden, um in die Visualisierung der basilaris Papilla unterstützen.
- Ohne Neupositionierung der Mikropipette weiter senken, bis es nur Verstöße gegen die tief Rand des Ductus cochlearis (Abbildung 1). Durchführen einer Injektion und wiederholen hier in mehreren Bereichen entlang der Länge des basilaren Papille (2C, 2D) mit Ausnahme des am meisten proximalen Spitze, wo der vestibulären Lagena befindet. Mit dem picospritzer zwischen 10-30 psi eingestellt ist, werden mehrere Injektionen gemacht. Das Volumen des injizierten Farbstoff Fluids variiert und hängt von dem Ausmaß der gewünschten Etikettierung. Jede Injektion sollte in einem Fluoreszenzfarbstoff-la führenBeled Ort von etwa 200 bis 400 Mikrometer Durchmesser (2D).
- Sobald die Injektion abgeschlossen ist, verwenden Pinzette, um die Probe oberhalb des Hirnstamms durchschneiden und verwenden Sie eine Pipette, um den kaudalen Teil in einen kleinen Topf legen im Behälter aCSF kontinuierlich mit 95% O 2/5% CO 2 durchströmt.
- Für jedes Embryo erlauben 20-30 min zur Farbstoffübertragung, abhängig vom Abstand der zentralen Tracing gewünscht.
- Entfernen Gewebe und die Vorbereitungen für histologische Schnitte. In dem hier gezeigten Beispiel wird Gewebe in 4% Paraformaldehyd (in 1X PBS) über Nacht, 30% Saccharose (in 1X PBS) über Nacht eingetaucht.
4. Gegenfärbung und Analyse
- Gegenfärbung ist nützlich, um zu helfen orient der Beobachter an anatomische Lage sowie zu identifizieren bestimmte Regionen von Interesse. Eine wirksame Gegenfärbung in dieser Zubereitung ist Neurofilament Immunmarkierung (Figuren 1, 3B, 3E), die stark l MitAbels Axonen und ermöglicht Abgrenzung der axonalen Bahnen im ZNS.
- Analyse sollte während der markierten Region durchgeführt werden, wie die Vorsprünge können mehrere hundert Mikrometer oder mehr entlang der Achse rostrokaudalen erstrecken. Einige Beispiele für grundlegende Untersuchungen sind: Targeting Fehlerraten, Timing und / oder Veränderungen der Divergenz der Projektionsmuster. RDA-markierte Axone visualisiert im peripheren und zentralen Nervensystems mit hoher Auflösung (3A, 3D).
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Representative Results
Die Komponenten der VIII. Nerv und der Anatomie des Nerven selbst sind komplex und gewundenen (Figuren 1, 3). Durch selektives Tracing Fasern aus akustischen Ganglienzellen können Segmente des VIII. Nerven sowie primären auditorischen Afferenzen im Hirnstamm sauber zurückverfolgt werden und sich von ihren vestibulären Gegenstücke (Abbildungen 2, 3). Ebenso könnte diese Technik verwendet, um periphere Vorsprünge der akustischen Ganglienzellen (3G) studieren oder modifiziert werden, um Vorsprünge, die sich aus einzelnen Vestibularorgane studieren. Weil Axone sauber entlang ihrer gesamten Länge zurückzuführen sind, kann eine genaue quantitative Analysen Unterscheiden von auditorischen vestibulären Vorsprünge während der Entwicklung, einschließlich der genaue Zeitpunkt und Muster der anfänglichen Innervation Targeting Fehlerraten, etc. durchgeführt werden Zusätzlich, im Gegensatz zu der bisherigen Vorgehensweise des auditiven Faser Kennzeichnung, Dieser Ansatz ist Leistungmed auf nicht-festen, lebendes Gewebe und somit kann gleichzeitig mit anderen in vitro Experimente werden.
Obwohl diese Technik eignet sich für Embryonen aus E6-E9, optimale Ergebnisse bei E8 beginnen, wenn ihre auditiven Axone primären zentralen Targets 3 haben innerviert. Im Gegensatz dazu kommen vestibulären Projektionen im Hirnstamm früher 9,10 und würde somit als bessere Kandidaten für frühere Tracing dienen, aber technisch anspruchsvolle aufgrund der geringen Größe und der relativen Unreife der Vestibularapparat in diesem Alter. Histologische Schnitte zu prüfen, um die Position Farbstoffinjektion bestätigen, da die apikal gelegene Region des basilaren Papille enthält eine geringe sensorische Patch vermutlich von Vestibularfunktion sein und wenn markierten kontaminieren könnten die Ergebnisse werden.
Nachdem die Ermittler ist vertraut mit der Anatomie, sind drei der am häufigsten auftretenden Probleme wie folgt:
- Das Cochlea-duct mit Tracing Farbstoff gefüllt, aber Ganglienzelle Axone sind nicht beschriftet. Dieses Problem wahrscheinlich darauf hinweisen, dass die Einspritzung nicht ausgeführt wurde die Tiefe bis zur Cochlea Kanals, wo die Ganglienzellen und Nervenfasern befinden. Dieses Problem kann durch die Gewährleistung, dass die Injektion der Löcher ersten Mikropipette Chondrocranium, dann wird vorsichtig um so nur Punktion durch die andere Seite des Kanals vorgeschoben korrigiert werden. Alternativ kann die Injektionspipette korrekt positioniert haben aber geliefert ausreichenden Mengen an Farbstoff. Steigende Einspritzdruck oder die Anzahl der Injektionen können auch überwinden dieses Problem.
- Der Nerv versehentlich als Folge der übermäßigen Zug am knorpeligen Labyrinth beim Präparieren durchtrennt. Diese Schwierigkeit kann unter Verwendung feiner Präparation Techniken und begrenzte Dissektion des Mittelohrs vermieden werden.
- Die Injektion ist zu umfangreich und versehentlich markiert anderen sensorischen Ganglienzellen oder Fasern aus anderen Nervenzellen Komponenten. Thwird Problem kann durch Optimierung Injektionsprotokolle minimiert werden, und können die Verringerung der Einspritzdruck oder die Anzahl von Impulsen oder der Verschiebung der Lage der Injektionen.
Zwei Beispiele von Potenzialanalysen sind:
- Divergenz der Projektion Muster: bestimmt das Ausmaß der markierten Axone entlang einer bestimmten Achse und wie sie folgenden Experimente betroffen sein. Rostrokaudale Divergenz kann wie folgt beschrieben werden:
(Anzahl Abschnitten mit markiertem Axonen) x (Dicke der einzelnen Abschnitte) Diese Maßnahme kann für das Ausmaß der Farbstoffmarkierung als Anteil des basilaren Papille korrigiert werden, oder in gegengefärbten Gewebe, für den Anteil der VIII. Nervenaxone beschriftet. Dies ist ein nützliches Werkzeug für die Analyse topographischen Vorsprünge, da die markierten Axone kann sauber zu ihren Anschluß Felder im Rautenhirn zurückführen. Für Messungen von Tonotopie sollte Farbstoff-Injektionen in die Region von Interesse entlang der bas begrenzt werdenIlar Papille.
- Targeting Fehlern: bestimmt die Frequenz mistargeted Axone zu jedem vorgegebenen Bereich der analysierten Gewebe (können pro Abschnitt sein, pro Embryo, etc.). Störungen können in Axonen nach einer abnormalen Projektion Pfad oder enden in einer unangemessenen Region führen. Bei der Quantifizierung Fehler, sollten Zahlen zu berücksichtigen Unterschied in Einspritzmengen zwischen Embryonen normalisiert werden. Kleinere Injektionen sind eher in der Fähigkeit, einzelne Axone Punktzahl. Eine grundlegende Targeting Fehleranalyse kann wie folgt beschrieben werden:
Abbildung 1. Koronale Ansicht der E6 Hirnstamm zur Vereinfachung mitbilaterale akustische Ganglien intakt. Schematisierte roten Pipette zeigt genaue Ausrichtung der akustischen Ganglienzellen aus einer dorsolateralen Einstiegspunkt. Die Schnitte werden mit Anti-Neurofilament immunmarkiert um axonale Projektionen markieren. Vestibularorgane sind rostral Abschnitten dargestellt. Region RDA Injektion für selektive auditorische Faserlokalisierung mit rotem Pipette Abbildung gezeigt. VIII = vestibulocochlearis, AG = akustische Ganglion, VG = vestibulären Ganglion. Dorsal ist oben. Maßstab = 300 um.
Abbildung 2. Mikrodissektion und Injektion von Zielregion. (A) entsprechende Position des Embryos Dissektion Teller, ventral mit geneigtem Kopf dorsal und drehte sich leicht zur Seite, um einen besseren Zugang zu der rechten Seite ermöglichen. Rechts ear wird gezeigt und die zugrunde liegenden basilaris Papille mit einer gestrichelten Linie angedeutet. Arrowhead in (A) und (B) zeigt Ausgangsposition der Pipette Insertion (B) Nach Dissektion, ist ein weißes otoconial Masse sichtbar, Abgrenzung der apikalen Rand des basilaris Papille (Pfeil). (C, D) sollte Erste Injektion bieten eine Umriss des Ductus cochlearis. (D) Nachfolgende Injektionen sollten nur tief zu dem Cochlea-Kanal und basilaris Papille in den akustischen Ganglienzellen Region werden. RDA-Fluoreszenz ist nützlich bei der Verbesserung der Injektion Tiefenwahrnehmung und jeder einzelne Injektion sollte einen fluoreszierenden Farbstoff-markierten Stelle ca. 200 erstellen - 400 Mikrometer Durchmesser wie hier zu sehen. Maßstab = 2 mm.
FBBILDUNG 3. Repräsentative Bilder selektive auditorische Faser-Tracing in einer E8 Embryo. (AC) Geringer Stromverbrauch und (DG) High-Power 25 um koronalen Abschnitte aus dem gleichen Embryo in verschiedenen Ebenen gesammelt. (A) RDA markierte Axone aus der Injektionsstelle (Pfeilspitze zurückverfolgt werden kann ), durch die Hirnnerven (Pfeil) und kaudal in Richtung der primären auditorischen Kerne Ziele (doppelte Pfeilspitze). (B) Immunmarkierung mit Anti-Neurofilament Antikörper Highlights alle axonale Projektionen und die RDA-zurückverfolgen Fasern aus (A) innerhalb des auditorischen Projektion Stoffwechselweg. Overlay von separaten (A) und (B) Kanäle als Farbe dargestellt in (C). (DF) Hohe Leistung Bild des gleichen Embryos zu einem mehr kaudal zeigt (A) hohe Auflösung von Fasern an den Nerven Einstiegspunkt (merge Pfeil) und entlang der zentralen Bahn (Doppelpfeil). (E) </ Strong> Neurofilament Fleck aller Axone ermöglicht Abgrenzung der PNS-CNS sowie vermeintliche auditive gegenüber vestibulären Projektionen. Ap und Vp geben jeweiligen auditorischen und vestibulären Komponenten Peripherie auf den Nerv Einstiegspunkt, während Ac und Vc jeweiligen auditorischen und vestibulären Projektionen zentraler Bedeutung für die Nerven Einstiegspunkt angeben. Überlagerung von separate (D) und (E)-Kanäle als in Farbe dargestellt fusionieren (F). (G) histologische Untersuchung des akustischen Ganglion offenbart Standort markierte akustischen Ganglienzellen aus der Ablaufverfolgung, die in (AF) und ihre periphere Vorsprünge ( Sternchen) sind retrograd zum basilaris Papille zurückzuführen. (H) Illustration eines 700 um Tracing Weg mit auditiv-spezifischen VIII Kennzeichnung auf E8 erwartet. Injektionsstelle (roter Kreis) ist kaudal Nerven Einstiegspunkt und zentralen Projektionen reisen rostral und kaudal einmal im Hinterhirn. Vp = peripheren Westeibular, Ap = peripheren auditorischen, Vc = zentrale vestibuläre, Ac = zentralen auditorischen, AG = akustische Ganglion, BP = basilaris Papille, LM = lagenar Makula, SVG = Superior vestibulären Ganglion IVG = inferior vestibulären Ganglion. Maßstab = 300 um für AC, 100 um für DF, 100 um in G und 500 um in H.
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Discussion
Studien der frühen Entwicklung des VIII. Nerven wurden zum Teil wegen der Schwierigkeiten bei der Ermittlung embryonalen Axone aus mehreren verschiedenen Ganglien begrenzt. Mehrere Studien haben die molekularen Signale Führung auditorischen und vestibulären sensorischen Zellen und Ganglienzellen Schicksale während der frühen Entwicklung, 5,11,12 erforscht, aber die Prozesse, die die zentrale Innervation müssen noch bestimmt werden. Berichte von akustischen Ganglienzellen Projektionen beschreiben typischerweise peripheren Prozesse Sinnesepithel 13-15, während weniger über die zentralen Prozesse Projektion zur primären Kerne bekannt ist. Studien von zentral abstehenden Unterteilungen VIII während der Embryogenese sind oft elektrophysiologischen, wie optische Aufnahmen in embryonalen Küken Rautenhirn 16 oder Calcium-Imaging in einem Säugetiergewebe Scheibe 17 kann jedoch nicht vor dem Abschluss der neuronalen Schaltkreise durchgeführt werden. Die Verwendung immunologischer Marker zur Markierungauditive Axone im chick VIII. Nerv ist derzeit nicht möglich. Während verschiedene Gruppen von Transkriptionsfaktoren erkannt worden, daß im Vergleich zu korrelieren mit auditorischen Nervenzellen vestibulären 18-23, wird die Expression dieser Faktoren von Axonen ausgeschlossen. Bei Mäusen wurden Unterschiede zwischen Spiralganglien und vestibulären Ganglien in der Genexpression, darunter auch einige vielversprechende Kandidaten, die Axon Wachstum unter Modalitäten unterscheiden. Konnten 23 weitere Untersuchung dieser Genprodukte können wichtige Instrumente sowohl für Säuger-und Vogel-Studien ergeben gefunden. Mit den hier beschriebenen Methoden können auditorischen Fasern in lebenden embryonalem Gewebe mit intakter auditorischen Schaltkreis selektiv an ihren zentralen Ziele verfolgt werden.
Der Hühnerembryo ist eine besonders nützliche Wirbeltiere für Entwicklungsbiologen und ist in der Lage, einige der Einschränkungen in Säugetierzellen Systemen gefunden zu überwinden. Verordnung des frühen Innenohr Strukturierung und Morphogenese inVögel zeigt bemerkenswerte Ähnlichkeit zu Säugetieren 1,12, während Hühnerembryonen größer und leichter zugänglich als Nager Embryonen in einem frühen Stadium, wenn die peripheren auditorischen System wird gebildet werden. Die hier angewandte Methode zur selektiven Verfolgung von auditiven Fasern vorgestellt erleichtert die frühe Experimente auf den zentralen Projektionen der Entwicklung des Innenohrs.
Wir haben dieses Protokoll in dem Bemühen, differentiell identifizieren zentralauditorischen Vorsprünge der VIII. Nerv, sondern es kann ebenfalls modifiziert werden, um selektive Markierung Fasern von anderen Sinnesorganen des Innenohres ist. Im Gegensatz zum zuvor beschriebenen Verfahren, ist dieses Verfahren auf lebendes Gewebe mit der gesamten Schaltung intakten durchgeführt. Ein ähnliches Verfahren wurde verwendet, durchgeführt, um Timing VIII auditorischen afferenten Innervation während aviären Embryogenese beschreiben, jedoch vestibulären Fasern wurden auch versehentlich markierten 3 Hier haben wir ein Verfahren bereitzustellen zur eindeutigen Identifizierung Bereich oder.igin und Kündigung sowie hohen Faser-Auflösung wählen zentral vorstehende auditiven Afferenzen während der Vertebraten Embryogenese.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt werden.
Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Candace Hsieh für Anregungen und Unterstützung danken, mit bildgebenden Verfahren und Dr. Doris Wu für Kompetenz auf chick Innenohr Anatomie während der frühen Embryogenese. Diese Arbeit wurde von der NSF IOS-0642346, NIH T32-DC010775, NIH T32-GM008620, NIH R01-DC010796 und DOE GAANN P200A120165 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene Weigh Dish | Fisher Scientific | 02-202-101 | |
| Petri Dish, 35 X 10 mm | Fisher Scientific | 50820644 | Use to make silicone dissection dish |
| Sylgard Silicone Elastomer Kit | World Precision Instruments | SYLG184 | Coat Petri to make dissection dish |
| Dissection Pins | Various | Holds embryo in place during dissection | |
| NaCL | Various | part of aCSF recipe | |
| KCl | Various | part of aCSF recipe | |
| KH2PO4 | Various | part of aCSF recipe | |
| NaHCO3 | Various | part of aCSF recipe | |
| Glucose | Various | part of aCSF recipe | |
| CaCl2 | Various | part of aCSF recipe | |
| MgSO4 | Various | part of aCSF recipe | |
| Container for aCSF. Suggest translucent wide-mouth Nalgene jar, 500 ml (16 oz) with lid. | CPLabSafety | QP-PLC-03717 | Drill hole opening in top of lid for glass bubling stem to penetrate liquid |
| Empty 5 ml glass vial or comparable transparent vial | American Pharmaceutical Partners, Inc | 6332300105 | Use during aCSF incubation to keep samples separate from each other and from the bubbling stream |
| Tank of carbogen (95%O2 / 5%CO2) connected by tubing to bubbler | Various | Attach by tubing to glass stem bubbler for infusion into aCSF | |
| Glass stem bubbler | Various | To infuse carbogen into aCSF | |
| Curved-tip forceps | World Precision Instruments | 501008 | To remove embryo head from egg |
| Two fine-tip forceps | World Precision Instruments | 501985 | For micro-dissection |
| 50 ml Beaker | various | ||
| Rhodamine Dextran Amine (RDA) | Invitrogen | various | Fluorescent axon tracer |
| Triton X-100 | ICN Biomedicals | ||
| Phosphate Buffered Saline, (1X PBS) | Various | Standard lab reagent | |
| Thin Wall Glass Capillaries, 1.2 OD, .9 ID 4" (100 mm) length | World Precision Instruments | TW120F-4 | Load with RDA. Each capillary makes two glass micropipettes |
| Needle / Pipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | Settings used: Heat 16.4, Solenoid 2.2 |
| Picospritzer | Parker Instrumentation | various | Attach by fine tubing to glass micropipette |
| Micromanipulator | Narishige | various | |
| Dissection microscope with fluorescence | Various | ||
| 4% Paraformaldehyde | Various | Standard lab reagent | |
| anti-Neurofilament antibody, optional | Millipore | AB1991 | Follow histological protocol recommended by manufacturer |
| Cryostat and associated materials for sectioning | Leica | various | |
| Epifluorescent microscope for imaging | Zeiss, various |
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