Selektiv spåra Auditiva fibrer i Avian embryonala Vestibulocochlear Nerve

Summary

Här beskriver vi en mikrodissektion teknik följt av fluorescerande färg injektion i den akustiska ganglion tidiga kycklingembryon för selektiv spårning av auditiva axon fibrer i nerv och bakhjäman.

Abstract

Den embryonala chick är en allmänt använd modell för att studera perifera och centrala projektioner gangliecell. I hörselsystemet, skulle selektiv märkning av auditiva axoner inom den VIII kranialnerven förbättra studiet av centrala auditiva kretsens utveckling. Detta tillvägagångssätt är en utmaning eftersom flera sinnesorgan i innerörat bidra till VIII nerven ^1. Dessutom markörer som tillförlitligt särskiljer hörsel kontra vestibulära grupper av axoner i aviär VIII nerven har ännu inte identifierats. Hörsel och vestibulär vägar kan inte skiljas funktionellt i tidiga embryon, som sensoriska-evoked potential finns inte innan kretsarna bildas. Centralt utskjutande VIII axoner har spårats i några studier, men auditiv axon märkning åtföljdes av märkning av andra VIII nerv komponenter ^2,3. Här beskriver vi en metod för anterograd spårning från den akustiska ganglion att selektivt Label auditiva axoner inom utvecklingsländerna VIII nerven. Först, efter partiell dissektion av främre cefaliska regionen av en 8-dagars kycklingembryo nedsänkt i syresatt artificiell cerebrospinalvätska, den kokleära kanalen identifieras genom anatomiska landmärken. Därefter är ett fint dras glasmikropipett positionerad att injicera en liten mängd rodamin dextran amin in i kanalen och angränsande djup region där de akustiska ganglieceller finns. Inom 30 minuter efter injektionen, är auditiva axoner spåras centralt i bakhjäman och kan senare visualiseras efter histologisk beredning. Denna metod ger ett användbart verktyg för utvecklingsstudier av perifer till centrala auditiva kretsen bildas.

Protocol

1. Förbered följande Dissektionsverktyg Verktyg och reagenser

• Artificiell cerebrospinalvätska (aCSF, 130 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM KH ₂ PO _4, 20 mM NaHCOa _3, 3 mM HEPES, 10 mM glukos, ₂ mM CaCl2, 1,3 mM MgSO ₄₎ infunderas kontinuerligt med 95% O _2/5% CO ₂ vid rumstemperatur. För infusion, fyll till 2/3 en 500 ml med bred mun Nalgene burk med ett hål borras i locket. Tank fästas genom slang till ett glas stam bubblare, som penetrerar aCSF genom hålet i burken locket. Justera trycket att erhålla en konstant ström av bubblor som når ungefär 1/3 av vätskan men är inte kraftfulla nog att orsaka stänk över kanten. Sänk 5 ml glasflaskor (upp till 6) i Nalgene burken för att separera individuella prover från varandra och från gasflödet turbulens. ACSF bör syresättas under minst 20 minuter innan någon vävnad inkubation.
• Liten silikon dissektion maträtt (35 mm x 10mm Petri belagd med Sylgard Elastomere Kit) med två dissekering stift placerade i små sexkantiga polystyren (47 mm botten) väger båten.
• Två fin spets tång, en krökt spets pincett, en 50 ml bägare och en behållare för mjukpapper avfall.
• Drog glasmikropipett (1,2 OD / 0,9 ID) bryts till ungefär 20-50 fim öppning vid spetsen och fylld med rodamin dextran amin (RDA, MW = 3.000, Invitrogen) i en 6,25% lösning med 0,4% Triton X-100 i PBS . Fäst med fin slangen till picospritzer och stabiliseras till mikromanipulator.

2. Micro-dissekering att avslöja basilar papilla vid E8 ^4,5

1. Med böjda pincett, skär E8 embryo nedanför hjärnstammen, placera huvudet direkt på silikonbelagd dissektion maträtt inom väga båt.
2. Med hjälp av dissekering stift, placera huvudet med en ventral vy så örat på sidan av intresset är något synligt, lutade huvudet lätt dorsalt och pekar 10-30 grader från center (Figur 2A). Omedelbart säkra huvudet med stift. Om bilaterala spårning önskas, så mitt huvud vid 0 grader, eller en fullständig ventral vy båda sidor kan nås. Likaså för en vänstersidig injektion, fast huvudet vid -10 till -30 grader från centrum så den vänstra sidan är tillgänglig.
3. Använda 50 ml bägare, överför 30 ml syresatt aCSF i skålen, helt dränka vävnaden.
4. Försiktigt tag och skala ner underkäken med fin spets tång och ta sedan bort det undre ögonlocket på sidan av intresse.
5. Ta bort vävnaden överliggande vaskulära, inklusive kvarvarande gom och svalg. Dessa mjuka vävnader bör skala bort avslöjar den släta ytan för att utveckla chondrocranium med de utmärkande vertebrala artärerna vid dess yta. Genom denna punkt, bör den karakteristiska vita otoconial massa synas.
6. Försiktigt dissekera huden runt den yttre meatus, brosk i käken gemensamt, och mellanörat medan den iner öra intakt. Använd tången att försiktigt skära bort dessa broskartade konstruktioner.
7. Ta vertebrala artärer och samla blod med hjälp av en mjuk svepande rörelse med fin pincett tips. Blod kan skymma utsikt och koagulation kan täppa till öppningen injektionspipetten.
8. Den cochlea kanal med intilliggande sensoriska epitelet (basilära papilla) och akustisk ganglion ligger direkt under chondrocranium ⁶ och kan visualiseras som en långsträckt fingerliknande utsprång som sträcker sig från innerörat ventralt, med den mest distala spetsen (apex) nära den främre mittlinjen ^5. Det kan finnas en liten sammanslagning av blod (röda) från dissekering och / eller otolithic förkalkningar (vit) på spetsen av cochlea kanal (figur 2B) som kan hjälpa till visualisering. På toppen är det lagenar gula fläcken, tänkte en sensorisk lapp vara av vestibulär funktion ^7,8.

3. Selektiv märkning av KN VIII Auditory Fibrer

1. Sakta sänka mikropipett att först punktera kraniet. Denna Skallparti är tunnare än omgivande områden och kräver mindre kraft för att penetrera. Den mikropipett bör nu vara inne i cochlea kanalen. Tillval: en liten injektion av spårning färg kan göras här för att hjälpa till att visualisera basilaris papillen.
2. Utan att flytta mikropipetten fortsätter att sänka tills den bara bryter den djupa gränsen för cochlea kanal (figur 1). Utföra en injektion här och upprepa i flera områden längs längden av den basilära papilla (figurerna 2C, 2D), exklusive det mest proximala spetsen där den vestibulära Lagena ligger. Med picospritzer inställd mellan 10-30 psi, är flera injektioner görs. Volymen av injicerat färgämne vätska varierar, och beror på omfattningen av märkning önskas. Varje injektion bör resultera i ett fluorescerande färgämne-labeled fläck av cirka 200 - 400 | im diameter (figur 2D).
3. När injektionen är avslutad använder pincett för tvärsnitt provet ovanför hjärnstammen och använda en överföringspipett att placera den kaudala delen i en liten burk i behållaren av aCSF kontinuerligt perfunderas med 95% O _2/5% CO _2.
4. För varje embryo, tillåta 20-30 min för färgöverföring, beroende på avståndet önskas centrala spårning.
5. Ta vävnad och förbereda för histologisk snittning. I exemplet som visas här, är vävnad nedsänkt i 4% paraformaldehyd (i 1X PBS) över natten, 30% sackaros (i 1 x PBS) över natten.

4. Motfärgning och analys

1. Motfärgning är användbar för att hjälpa till att orientera betraktaren till anatomiska läge samt identifiera vissa områden av intresse. En effektiv motfärgning i denna beredning är neurofilament immunomärkning (figurerna 1, 3B, 3E), vilket starkt lAbels axoner och möjliggör avgränsning av axonala skrifter i CNS.
2. Analysen bör göras i hela märkta regionen, eftersom de utskjutande kan förlänga flera hundra mikrometer eller mer längs rostrocaudal axeln. Några exempel på grundläggande analyser: inriktning felfrekvensen, tidpunkt och / eller förändringar i divergens projektion mönster. RDA-märkta axoner visualiseras i det perifera och centrala nervsystemet med hög upplösning (figur 3A, 3D).

Representative Results

Komponenterna i VIII nerv och anatomi av nerven själva är komplexa och invecklade (fig 1, 3). Genom att selektivt spåra fibrer som härrör från akustiska ganglionceller, kan segment av nerven VIII liksom primära afferenter auditiva inom hjärnstammen vara rent spåras och särskiljas från deras motsvarigheter vestibulära (figurerna 2, 3). Likaså skulle denna teknik kunna användas för att studera perifera projektionerna av de akustiska ganglieceller (figur 3G), eller modifieras för att studera utsprång som enskilda vestibulära organ. Eftersom axoner är snyggt spåras i hela sin längd, kan noggranna kvantitativa analyser göras särskiljande hörsel från vestibulära prognoser under utveckling, inklusive exakta tidpunkten och mönster av initial innervation, inriktning felfrekvensen etc. Dessutom, till skillnad från tidigare tillvägagångssätt auditiv fiber märkning, detta tillvägagångssätt är prestandaMed icke-fast, levande vävnad och kan sålunda användas samtidigt för andra in vitro-experiment.

Även denna teknik är lämplig för embryon från E6-E9, bästa resultat börjar klockan E8 när auditiva axoner har innerveras deras primära centrala mål ^3. Däremot vestibulära prognoser kommer i hjärnstammen tidigare ^9,10 och därmed skulle tjäna som bättre kandidater för tidigare spårande, men tekniskt utmanande på grund av den lilla storleken och den relativa omognad i vestibulära apparaten i denna ålder. Histologiska sektioner bör undersökas för att bekräfta placeringen av färg injektion som den apikala-mest regionen i basilar papilla innehåller en liten sensorisk lapp tros vara vestibulär funktion och om märkta skulle kunna förorena resultaten.

När utredaren känner till anatomi, tre av de vanligaste problemen är följande:

• Cochlear duCT är fylld med spårning färg, men gangliecell axoner är inte märkta. Detta problem visar sannolikt att injektionen inte utfördes djupt för cochlea kanal, där ganglieceller och nervfibrer bor. Detta problem kan korrigeras genom att säkerställa att injektionen mikropipett 1. Punkterar chondrocranium, sedan försiktigt förs fram så att bara punktera genom den andra sidan av kanalen. Alternativt kan injektionen pipetten ha rätt läge men levereras tillräckliga mängder av färg. Ökad insprutningstryck eller antal injektioner kan också lösa problemet.
• Nerven oavsiktligt transekterades som en följd av överdriven dragning på brosk labyrint under dissektion. Denna svårighet kan undvikas genom användning av fina dissektion tekniker och begränsad dissektion av mellanörat.
• Injektionen är för omfattande och oavsiktligt märker andra sensoriska ganglion celler eller fibrer som härrör från andra nerv-komponenter. Thär problemet kan minimeras genom att optimera injektion protokoll, och kan kräva att minska insprutningstrycket eller antalet pulser, eller förskjutning placeringen av injektioner.

Två exempel på potentiella analyser är:

1. Avvikelse av projektion mönster: avgör omfattningen av märkta axoner längs en viss axel och hur de kan påverkas efter experimenterande. Rostrocaudal divergens kan beskrivas som:

(Antal sektioner med märkta axoner) x (tjocklek av varje avsnitt) Denna åtgärd kan korrigeras för omfattningen av färg etikett som en del av den basilära papilla eller i motfärgades vävnad, för andelen VIII märkta axoner. Detta är ett användbart verktyg för att analysera topografiska prognoser eftersom de märkta axoner kan rent spåras till sin terminal fält i bakhjäman. För mätningar av tonotopy bör färgämne injektioner begränsas till området av intresse längs basIlar papilla.

2. Inriktning fel: bestämmer frekvensen av mistargeted axoner för varje förutbestämt område analyserade vävnaden (kan vara per sektion, per embryo, etc). Störningar kan resultera i axoner efter en onormal utsprångsbansektionen eller slutar i en olämplig område. När kvantifiera fel bör siffrorna normaliseras ta hänsyn till skillnader i injektion belopp mellan embryon. Mindre injektioner är mer sannolikt att resultera i förmågan att göra mål enstaka axoner. En grundläggande målsökande felanalys kan beskrivas som:

Figur 1. Frontal bild av E6 hjärnstammen för förenkling medbilaterala akustisk ganglierna intakt. schematisk röd pipett illustrerar exakt inriktning av akustiska ganglion celler från en dorsolaterala ingång. Sektioner immunolabeled med anti-neurofilament att markera axonala projektioner. Vestibulära organ är rostralt till visas sektioner. Region av RDA injektion för selektiv auditiv fibrer spårning demonstreras med röd pipett illustrationen. VIII = vestibulocochlear nerv, AG = akustisk ganglion, VG = vestibulära ganglion. Dorsal är slut. Skala bar = 300 nm.

Figur 2. Mikrodissektion och injektion av målregion. (A) lämplig position embryo på dissekering skålen, ventrala vy med huvudet lutat dorsalt och vände lite åt sidan för att ge bättre tillgång till rätt sida. Rätt ear visas och underliggande basilar papilla indikeras med en streckad linje. Pilspets i (A) och (B) visar utgångsläget för pipett insättning (B) Efter dissektion, är en vit otoconial massa synlig, avgränsa den apikala gräns basilaris papilla (pil). (C, D) ska Första injektionen ge en översikt över de cochlea kanal. (D) Efterföljande injektioner bör göras bara djupt för cochlea kanal och basilar papilla i den akustiska ganglion regionen. RDA fluorescens är användbart för att öka injektion djupseende och varje enskild injektion bör skapa en fluorescerande färg-märkt plats på cirka 200 till 400 nm diameter som här. Skala stapel = 2 mm.

Figure 3. Representativa bilder av selektiv hörsel fiber spårning i ett E8 embryo. (AC) låg effekt och (GD) hög effekt 25 um koronala sektioner som samlats in från samma embryo vid olika plan. (A) RDA märkta axoner kan spåras från injektionsstället (pilspets ), genom kranialnerv (pil) och kaudalt mot de primära auditiva kärnor mål (dubbel pilspets). (B) immunomärkning med anti-neurofilament antikroppar höjdpunkter alla axonala projektioner och RDA-spåras fibrer från (A) ligger inom auditiva projektion väg. Överlagring av separat (A) och (B) kanalerna som visas som en färg samman i (C). (DF) Hög effekt bild av samma embryo till en mer kaudal läge visar (A) hög upplösning av fibrer på nerven ingång ( pil) och längs den centrala banan (dubbel pilspets). (E) </ Strong> neurofilament fläck av alla axoner möjliggör avgränsning av PNS-CNS samt förmodade hörsel kontra vestibulära prognoser. Ap och Vp indikerar respektive hörsel-och vestibulära komponenter perifera till nerven ingångspunkt, medan Ac och Ve indikerar respektive hörsel-och vestibulära prognoser centrala för nerven ingångspunkt. Överlagring av separat (D) och (E) kanaler visas som en färg samman i (F). (G) Histologisk undersökning av den akustiska ganglion avslöjar placering av märkta akustiska ganglieceller från spårning visas i (AF) och deras perifera utsprång ( asterisk) spåras retrograd till basilar papillen. (H) Illustration av en 700 nm spåra väg förväntas med hörsel-specifik VIII märkning på E8. Injektionsstället (röd cirkel) är kaudalt till nerv ingångspunkt, och centrala projektioner reser rostral och kaudalt gång i bakhjäman. Vp = perifer västibular, Ap = perifera hörselsystemet, Vc = centrala vestibulära, Ac = centrala auditiva, AG = akustisk ganglion, BP = basilar papilla, LM = lagenar gula fläcken, SVG = överlägsen vestibulär ganglion, IVG = sämre vestibulära ganglion. Skala bar = 300 nm för AC, 100 nm för DF, 100 um i G och 500 nm i H.

Discussion

Studier av tidiga utvecklingen av VIII nerven har begränsats delvis på grund av svårigheten att identifiera embryonala axoner som härrör från flera distinkt ganglierna. Flera studier har undersökt de molekylära signaler som styr hörsel och vestibulär sensorisk cell-och ganglion öden cell under tidig utveckling, ^5,11,12, men de processer som reglerar centrala innervation har ännu inte fastställts. Rapporter om akustiska prognoser gangliecell beskriver vanligen perifera processer sensoriska epitel ^13-15, medan mindre är känt om de centrala processerna utskjutande till primär kärnor. Studier av centralt utskjutande VIII underavdelningar under embryogenes ofta elektrofysiologiska, såsom optiska inspelningar i embryonala brud bakhjäman ¹⁶ eller kalcium avbildning i en däggdjursvävnad skiva ^17, men kan inte utföras innan slutförandet av nervbanor. Användningen av immunologiska markörer för att märkaauditiva axoner i ungen VIII nerven är för närvarande inte möjligt. Medan distinkta grupper av transkriptionsfaktorer har identifierats som korrelerar med hörsel kontra vestibulär neuroner ^18-23, är uttrycket av dessa faktorer utesluts från axoner. Hos möss har skillnader konstaterats mellan spiral ganglier och vestibulära ganglier i genuttryck, inklusive några lovande kandidater som kan skilja axon tillväxt bland modaliteter. ²³ Ytterligare studier av dessa genprodukter kan ge viktiga verktyg för både däggdjur och fåglar studier. Med de metoder som beskrivs här, kan auditiva fibrer i levande embryonal vävnad med en intakt auditiv krets selektivt spåras till sina centrala mål.

Kyckling embryo är en särskilt användbar ryggradsdjur för utvecklings biologer och kan övervinna några av de begränsningar som finns i däggdjurssystem. Reglering av tidig innerörat mönstring och morfogenes ifåglar visar anmärkningsvärd likhet med däggdjur ^1,12, medan kycklingembryon är större och mer lättillgänglig än gnagare embryon i tidiga skeden när det perifera hörselsystemet bildas. Metoden presenteras här för selektiv spårning av auditiva fibrer underlättar tidiga experiment på de centrala prognoserna i utvecklingsländerna innerörat.

Vi utvecklade detta protokoll i syfte att differentiellt identifiera centrala auditiva projektioner av VIII nerven, men också den kan modifieras för att selektivt märka fibrer från andra sinnesorgan i innerörat. I motsats till tidigare beskrivna metoder, är denna procedur utförs på levande vävnad med hela kretsen intakt. En liknande metod utförs användes för att beskriva timingen av VIII auditiva afferenta innervation under aviär embryogenes, men har vestibulära fibrer också oavsiktligt märkt ³ Här tillhandahåller vi en metod för att klart identifiera regionen av eller.igin och uppsägning, liksom hög enskild fiber upplösning Select centralt utskjutande auditiva afferenter under ryggradsdjur embryogenes.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polystyrene Weigh Dish	Fisher Scientific	02-202-101
Petri Dish, 35 X 10 mm	Fisher Scientific	50820644	Use to make silicone dissection dish
Sylgard Silicone Elastomer Kit	World Precision Instruments	SYLG184	Coat Petri to make dissection dish
Dissection Pins	Various		Holds embryo in place during dissection
NaCL	Various		part of aCSF recipe
KCl	Various		part of aCSF recipe
KH2PO4	Various		part of aCSF recipe
NaHCO3	Various		part of aCSF recipe
Glucose	Various		part of aCSF recipe
CaCl2	Various		part of aCSF recipe
MgSO4	Various		part of aCSF recipe
Container for aCSF. Suggest translucent wide-mouth Nalgene jar, 500 ml (16 oz) with lid.	CPLabSafety	QP-PLC-03717	Drill hole opening in top of lid for glass bubling stem to penetrate liquid
Empty 5 ml glass vial or comparable transparent vial	American Pharmaceutical Partners, Inc	6332300105	Use during aCSF incubation to keep samples separate from each other and from the bubbling stream
Tank of carbogen (95%O2 / 5%CO2) connected by tubing to bubbler	Various		Attach by tubing to glass stem bubbler for infusion into aCSF
Glass stem bubbler	Various		To infuse carbogen into aCSF
Curved-tip forceps	World Precision Instruments	501008	To remove embryo head from egg
Two fine-tip forceps	World Precision Instruments	501985	For micro-dissection
50 ml Beaker	various
Rhodamine Dextran Amine (RDA)	Invitrogen	various	Fluorescent axon tracer
Triton X-100	ICN Biomedicals
Phosphate Buffered Saline, (1X PBS)	Various		Standard lab reagent
Thin Wall Glass Capillaries, 1.2 OD, .9 ID 4" (100 mm) length	World Precision Instruments	TW120F-4	Load with RDA. Each capillary makes two glass micropipettes
Needle / Pipette puller	David Kopf Instruments	Model 720	Settings used: Heat 16.4, Solenoid 2.2
Picospritzer	Parker Instrumentation	various	Attach by fine tubing to glass micropipette
Micromanipulator	Narishige	various
Dissection microscope with fluorescence	Various
4% Paraformaldehyde	Various		Standard lab reagent
anti-Neurofilament antibody, optional	Millipore	AB1991	Follow histological protocol recommended by manufacturer
Cryostat and associated materials for sectioning	Leica	various
Epifluorescent microscope for imaging	Zeiss, various