L'analisi selettiva delle fibre uditive nel aviaria Nerve Embryonic vestibolococleare

Summary

Qui si descrive una tecnica di microdissezione seguito da iniezione di colorante fluorescente nel ganglio acustico di embrioni di pollo primi selettiva per rintracciare uditive fibre assoni nel nervo e rombencefalo.

Abstract

Il pulcino embrionale è un modello ampiamente utilizzato per lo studio delle proiezioni gangliari periferiche e centrali cellulari. Nel sistema uditivo, etichettatura selettiva degli assoni uditivi all'interno del nervo cranico VIII aumenterebbe lo studio dello sviluppo del circuito uditivo centrale. Questo approccio è impegnativo, perché di vari organi sensoriali dell'orecchio interno contribuiscono al nervo VIII ^1. Inoltre, marcatori che distinguono affidabile uditivo rispetto vestibolari gruppi di assoni all'interno del nervo VIII aviaria devono ancora essere identificati. Vie uditive e vestibolari non si distinguono funzionalmente in embrioni precoci, come-sensoriali evocate risposte non sono presenti prima che i circuiti sono formati. Centrale sporgenti assoni dei nervi dell'VIII sono stati rintracciati in alcuni studi, ma uditivo etichettatura assone è stata accompagnata da etichettare dagli altri componenti del nervo dell'VIII ^2,3. Qui, descriviamo un metodo per l'analisi anterograda dal ganglio acustico in modo selettivo labeassoni uditive l all'interno del nervo VIII in via di sviluppo. In primo luogo, dopo la dissezione parziale della regione anteriore cefalica di un 8 giorni di embrione di pollo immerso nel liquido cerebrospinale artificiale ossigenato, il condotto cocleare è identificato da punti di repere anatomici. Successivamente, una micropipetta di vetro sottile tirato è posizionata per iniettare una piccola quantità di rodamina destrano ammina nella regione di canale e adiacente profonda in cui si trovano le cellule gangliari acustici. Entro trenta minuti dopo l'iniezione, assoni uditive sono tracciate a livello centrale nel cervello posteriore e possono poi essere visualizzati a seguito della preparazione istologica. Questo metodo fornisce un utile strumento per gli studi di sviluppo della periferica alla formazione circuito centrale uditivo.

Protocol

1. Preparare i seguenti strumenti di dissezione e reagenti

• Fluido cerebrospinale artificiale (aCSF, 130 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM KH ₂ PO _4, 20 mM NaHCO _3, 3 mM di HEPES, 10 mM di glucosio, 2 mM CaCl _2, 1,3 mM MgSO ₄₎ continuo infuso con 95% O _2/5% di CO ₂ a temperatura ambiente. Per l'infusione, riempire per 2/3 da 500 ml a bocca larga vaso Nalgene con un foro nel coperchio. Serbatoio sarà collegato mediante la tubazione di un calice gorgogliatore, che penetra la aCSF attraverso il foro nel coperchio vaso. Regolare la pressione per ottenere un flusso costante di bolle che raggiungono circa 1/3 del liquido, ma non sono abbastanza forte da causare spruzzi sul bordo. Submerge 5 ml fiale di vetro (fino a 6) nel vaso Nalgene per separare campioni singoli da loro e dalla turbolenza del flusso di gas. ACSF dovrebbe essere ossigenato per almeno 20 minuti prima di qualsiasi incubazione tessuto.
• Piccolo dissezione piatto in silicone (35 mm x 10mm rivestito Petri utilizzando Sylgard elastomero Kit) con due perni dissezione inseriti in piccolo polistirolo esagonale inferiore (47 mm) peso barca.
• Due fine-tip pinza, una curva punta pinze, da 50 becher ml, e un contenitore per i rifiuti del tessuto.
• Tirato micropipetta di vetro (1,2 OD / 0,9 ID) spezzato a circa 20-50 micron apertura in punta e riempito con rodamina destrano ammina (RDA, MW = 3000, Invitrogen) in una soluzione di 6,25% con 0,4% Triton X-100 in PBS . Collegare con un tubo in bene per picospritzer e stabilizzare a micromanipolatore.

2. Micro-dissezione per svelare Papilla basilare a E8 ^4,5

1. Con pinze curve, tagliare E8 embrione appena sotto il tronco cerebrale, mettendo la testa direttamente sulla siliconata piatto dissezione all'interno pesare barca.
2. Con perni dissezione, posizionare la testa con una vista ventrale così l'orecchio sul lato di interesse è leggermente visibile, la testa leggermente inclinata dorsalmente e puntando 10-30 gradi di distanza dal center (Figura 2A). Immediatamente fissare la testa con perni. Se bilaterale analisi è desiderato, il centro della testa a 0 gradi, o una visione completa ventrale in modo da entrambi i lati è possibile accedere. Analogamente, per un lato sinistro iniezione, bloccare la testa a -10 a -30 gradi dal centro in modo che il lato sinistro è accessibile.
3. Con i 50 becher ml, trasferire 30 ml di aCSF ossigenata nel piatto, sommergendo completamente il tessuto.
4. Afferrare con delicatezza e la buccia verso il basso la mascella inferiore con punta fine pinze, quindi rimuovere la palpebra inferiore sul lato di interesse.
5. Rimuovere il tessuto vascolare sovrastante, compresa qualsiasi palato rimanente e gola. Questi tessuti molli dovrebbero staccarsi rivelando la superficie liscia di sviluppare chondrocranium con le arterie vertebrali distintivi sulla sua superficie. Da questo punto, la caratteristica massa bianca otoconial dovrebbe essere visibile.
6. Sezionare con cura la pelle intorno al meato esterno, cartilagine della mandibola e l'orecchio medio, lasciando il diNER orecchio intatto. Utilizzare le pinze per tagliare delicatamente via queste strutture cartilaginee.
7. Rimuovere le arterie vertebrali e una pozza di sangue con un movimento gentile con le punte sottili pinze. Il sangue può oscurare vista e la coagulazione può collegare l'apertura pipetta di iniezione.
8. Il condotto cocleare con adiacente epitelio sensoriale (basilare papilla) e ganglio acustico si trova direttamente sotto la chondrocranium ⁶ e può essere visualizzato come una forma allungata oa forma di dita proiezione si estende dall'orecchio interno ventralmente, con la punta più distale (apice) in prossimità del anteriore linea mediana ^5. Ci può essere un raggruppamento di sangue (rosso) dalla dissezione e / o calcificazioni otolitici (bianco) all'apice del condotto cocleare (Figura 2B) che possono aiutare nella visualizzazione. Al vertice è la macula lagenar, una patch sensoriale pensato per essere della funzione vestibolare ^7,8.

3. Etichettatura selettiva di CN VIII Fibre uditiva

1. Abbassare lentamente la micropipetta per forare prima il cranio. Questa regione cranica è più sottile di aree circostanti e richiede meno forza per penetrare. La micropipetta dovrebbe essere all'interno del canale cocleare. Opzionale: una piccola iniezione di tracciabilità colorante può essere fatto qui per aiutare a visualizzare la papilla basilare.
2. Senza il riposizionamento della micropipetta, continuare ad abbassare fino a quando incomincia viola il confine profondo del condotto cocleare (Figura 1). Effettuare un'iniezione qui e ripetere in più regioni lungo la lunghezza della papilla basilare (figure 2C, 2D), escludendo la punta più prossimale in cui si trova il lagena vestibolare. Con il picospritzer impostata tra 10-30 psi, diverse iniezioni sono fatte. Il volume del fluido iniettato colorante varia e dipende dal grado desiderato di etichettatura. Ogni iniezione dovrebbe portare a un colorante fluorescente-laposto Beled di circa 200-400 micron di diametro (Figura 2D).
3. Una volta che l'iniezione è terminata, usare il forcipe per transetto il campione al di sopra del tronco cerebrale e utilizzare una pipetta di trasferimento per posizionare la porzione caudale in un piccolo vaso all'interno del contenitore di aCSF continuamente perfuso con il 95% O _2/5% di CO _2.
4. Per ciascun embrione, 20-30 min per consentire il trasferimento di colore, a seconda della distanza del centro di traccia desiderata.
5. Rimuovere il tessuto e prepararsi per il sezionamento istologico. Nell'esempio qui illustrato, il tessuto viene immerso in paraformaldeide al 4% (in 1X PBS) overnight, saccarosio 30% (in 1X PBS) per una notte.

4. Di contrasto e analisi

1. Di contrasto è utile per contribuire a orientare l'osservatore a localizzazione anatomica, nonché identificare le regioni di particolare interesse. Un contrasto efficace in questa preparazione è immunomarcatura neurofilamenti (figure 1, 3B, 3E), cui L fortementeAbels assoni e permette di demarcazione di tratti assonali nel SNC.
2. Analisi deve essere eseguita in tutta la regione etichettata, come le sporgenze possono estendere diverse centinaia di micron o più lungo l'asse rostrocaudale. Alcuni esempi di analisi di base sono: tassi di errore di targeting, i tempi e / o modifiche divergenza di modelli di proiezione. Assoni RDA-etichettati sono visualizzati nel sistema nervoso centrale e periferico ad alta risoluzione (figure 3A, 3D).

Representative Results

I componenti del nervo VIII e l'anatomia del nervo stesso sono complessi e contorti (figure 1, 3). Selettivamente rintracciamento fibre derivanti da cellule gangliari acustici, segmenti del nervo VIII nonché uditive afferenti primari all'interno del tronco può essere pulito tracciata e distinti dalle loro controparti vestibolari (figure 2, 3). Analogamente, questa tecnica può essere usata per studiare sporgenze periferiche delle cellule gangliari acustiche (figura 3G), o modificati per studiare proiezioni derivanti da singoli organi vestibolari. Poiché gli assoni sono pulito tracciato lungo tutta la loro lunghezza, accurate analisi quantitative possono essere eseguite uditivo distinguere dalle proiezioni vestibolari durante lo sviluppo, tra cui tempi precisi e modelli di innervazione iniziale, tassi di errore di targeting, ecc Inoltre, a differenza del precedente approccio di etichettatura uditivo fibra, questo approccio è prestazionimed sulla non fissa, tessuto vivente e quindi può essere utilizzato contemporaneamente ad altre sperimentazione in vitro.

Anche se questa tecnica è adatta per gli embrioni di E6-E9, i migliori risultati inizio alle E8 quando gli assoni uditivi hanno innervato i loro obiettivi primari centrali ^3. Al contrario, le proiezioni vestibolari arrivano nel tronco encefalico precedente ^9,10 e quindi servirebbe come i migliori candidati per l'analisi in precedenza, anche se tecnicamente difficile a causa delle piccole dimensioni e la relativa immaturità dell'apparato vestibolare a questa età. Sezioni istologiche devono essere esaminati per confermare la posizione di inserimento del tracciante, come la regione più apicale della papilla basilare contiene una piccola patch sensoriale pensato per essere della funzione vestibolare e se etichettati potrebbero contaminare i risultati.

Una volta che il ricercatore ha familiarità con l'anatomia, tre dei problemi più comunemente riscontrati sono i seguenti:

• Il cocleare duct è pieno di tracciamento colorante, ma assoni delle cellule gangliari non sono etichettati. Questo problema probabilmente indica che l'iniezione non è stata eseguita in profondità al condotto cocleare, dove le cellule gangliari e fibre nervose risiedono. Questo problema può essere corretto da garantire che le forature iniezione micropipette prima della chondrocranium, poi viene delicatamente avanzato in modo da perforare solo attraverso l'altro lato del condotto. In alternativa, la pipetta di iniezione potrebbe essere stato posizionato correttamente, non ha formulato quantità insufficienti di tintura. Aumento della pressione di iniezione o il numero di iniezioni può anche superare questo problema.
• Il nervo viene inavvertitamente sezionato come conseguenza della trazione eccessiva sul labirinto cartilaginea durante la dissezione. Questa difficoltà può essere evitato utilizzando tecniche di dissezione fine e dissezione limitata dell'orecchio medio.
• L'iniezione è troppo ampia e etichette inavvertitamente altre cellule dei gangli sensoriali o fibre derivanti da componenti nervose. Thè problema può essere minimizzato ottimizzando protocolli di iniezione, e può richiedere la riduzione della pressione di iniezione o il numero di impulsi, o spostando la posizione di iniezioni.

Due esempi di analisi potenziali sono:

1. Divergenza di modelli di proiezione: determina la misura degli assoni etichettati lungo un asse particolare, e come potrebbe essere influenzato la sperimentazione di seguito. Divergenza rostrocaudale può essere descritto come:

(Numero Sezioni contenente assoni etichettati) x (spessore di ogni sezione) Questa misura può essere corretta per la misura di etichetta colorante come proporzione della papilla basilare, o in tessuto di contrasto, per la percentuale di assoni del nervo dell'VIII etichettati. Si tratta di uno strumento utile per analizzare le proiezioni topografiche, come gli assoni possono essere etichettati pulito risalire ai loro campi di terminali per il rombencefalo. Per misure di tonotopy, iniezioni colorante dovrebbe essere limitata alla regione di interesse lungo il basun'analoga papilla.

2. Targeting errori: determina la frequenza degli assoni mistargeted per ogni prefissata zona di tessuto analizzato (può essere per sezione, per ogni embrione, ecc.) Perturbazioni può provocare assoni seguendo un percorso anomalo proiezione o terminare in una regione non appropriato. Quando gli errori di quantificazione, numeri devono essere normalizzati per tenere conto di differenze di quantità di iniezione tra embrioni. Piccole iniezioni sono maggiori probabilità di tradursi nella capacità di segnare assoni singoli. Una analisi di base dell'errore di targeting può essere descritto come:

Figura 1. Vista coronale di E6 tronco cerebrale di semplificazione congangli acustico bilaterale intatto. schematizzata pipetta rosso illustra accurata targeting di cellule gangliari acustici da un punto di ingresso dorsolaterale. Le sezioni sono immunolabeled con anti-neurofilamenti per evidenziare proiezioni assonali. Organi vestibolari sono rostrale alle sezioni indicate. Regione di iniezione RDA di fibre uditiva selettiva la traccia ha dimostrato con l'illustrazione pipetta rosso. VIII = vestibolococleare nervo, AG = ganglio acustico, VG = ganglio vestibolare. Dorsale è in alto. Barra di scala = 300 micron.

Figura 2. Microdissezione e l'iniezione della regione di destinazione. (A) posizione adeguata dell'embrione sul piatto dissezione, vista ventrale con la testa inclinata dorsalmente e si voltò un po 'di lato per consentire un migliore accesso al lato destro. E destroar viene mostrato e sottostante papilla basilare è indicata con una linea tratteggiata. Arrowhead in (A) e (B) illustra la posizione iniziale di inserimento pipetta (B) dissezione seguito, una massa bianca otoconial è visibile, delimitando il confine apicale della papilla basilare (freccia). (C, D) prima iniezione deve fornire un contorno del condotto cocleare. (D) iniezioni successive devono essere effettuate solo in profondità alla papilla cocleare condotto e basilare nella regione ganglio acustico. Fluorescenza RDA è utile per migliorare la percezione di profondità di iniezione e iniezione ogni individuo dovrebbe creare un luogo colorante fluorescente marcato di circa 200-400 micron di diametro come si vede qui. Barra di scala = 2 mm.

Figura 3. Immagini rappresentative della fibra uditiva selettiva analisi in un embrione E8. (AC) a bassa potenza e (DG) ad alta potenza da 25 micron con sezioni coronali raccolti dall'embrione stesso a piani diversi. (A) assoni RDA etichettati può essere fatta dal sito di iniezione (punta di freccia ), attraverso il nervo cranico (freccia) e caudalmente verso i bersagli principali nuclei uditivi (doppia freccia). (B) immunomarcatura con anti-neurofilamenti evidenzia anticorpi tutte le proiezioni e le fibre assonali RDA-tracciate da (A) sono all'interno della proiezione uditivo percorso. Sovrapposizione di separato (A) e (B) canali visualizzati come colore unione in (C). (DF) immagine elevata potenza dell'embrione stesso in una posizione più caudale illustrato (A) alta risoluzione di fibre al punto di ingresso del nervo ( freccia) e lungo la via centrale (doppia freccia). (E) </ Strong> Neurofilament macchia di tutti gli assoni permette delimitazione delle PNS-CNS e uditivo putativo contro proiezioni vestibolari. Ap e Vp indicano rispettivamente uditivo e vestibolare componenti periferici al punto di ingresso del nervo, mentre Ac e Vc indicano uditivo corrispondente e proiezioni vestibolari centrali al punto di ingresso del nervo. Sovrapposizione di separato (D) e (E) canali visualizzati come colore unione in (F). (G) L'esame istologico del ganglio acustico rivela posizione etichettati cellule gangliari acustici dal (tracciamento mostrato in (AF) e le sporgenze periferiche asterisco) sono tracciati retrograda alla papilla basilare. (H) Illustrazione di un percorso di 700 micron tracciato previsto con uditivo-specifico di etichettatura VIII a E8. Sito di iniezione (cerchio rosso) è caudalmente al punto nevralgico ingresso, e le proiezioni centrali viaggiare rostrale e caudalmente una volta nel cervello posteriore. Vp = gilet perifericaibular, Ap = uditivo periferico, Vc = vestibolare centrale, Ac = centrale uditivo, AG = ganglio acustico, BP = basilare papilla, LM = macula lagenar, SVG = ganglio vestibolare superiore, IVG = ganglio vestibolare inferiore. Barra di scala = 300 micron per AC, 100 micron per DF, 100 micron in G e 500 micron in H.

Discussion

Studi di sviluppo precoce del nervo VIII sono stati limitati, in parte a causa della difficoltà di identificare assoni embrionali derivanti da più gangli distinti. Diversi studi hanno esplorato i segnali molecolari che guidano uditivo e vestibolare delle cellule sensoriali e destini delle cellule ganglionari durante lo sviluppo iniziale, ^5,11,12 ma i processi che regolano innervazione centrale devono ancora essere determinati. Rapporti di proiezioni acustiche cellule gangliari di solito descrivere i processi periferici di epitelio sensoriale ^13-15, mentre meno si sa circa i processi centrali sporgenti a nuclei primaria. Studi di centralmente sporgenti suddivisioni VIII durante l'embriogenesi sono spesso elettrofisiologiche, come ad esempio le registrazioni ottiche in rombencefalo pulcino embrionale ¹⁶ o immagini di calcio in una fetta tessuti di mammiferi, ^17, ma non può essere effettuata prima del completamento dei circuiti neurali. L'uso di marcatori immunologici di etichettareassoni nel nervo uditivo pulcino VIII non è attualmente possibile. Mentre distinti gruppi di fattori di trascrizione sono stati identificati che correlano con uditivo rispetto neuroni vestibolari ^18-23, l'espressione di questi fattori è esclusa dal assoni. Nei topi, le differenze sono state trovate tra i gangli della spirale e gangli vestibolare nell'espressione genica, tra cui alcuni candidati promettenti, capaci di differenziare la crescita degli assoni tra modalità ^23. Ulteriore studio di questi prodotti genici possono dare strumenti importanti per gli studi sia di mammiferi e uccelli. Con i metodi qui descritti, fibre uditive in tessuti viventi embrionale con un circuito uditivo intatto può essere selettivamente risalire ai loro bersagli centrali.

L'embrione di pollo è un sistema vertebrato particolarmente utile per biologi dello sviluppo ed è in grado di superare alcune delle limitazioni presenti nei sistemi di mammifero. Regolamento del primo patterning dell'orecchio interno e la morfogenesi inuccelli presenta notevole somiglianza ai mammiferi ^1,12, mentre embrioni di pollo sono più grandi e più facilmente accessibili che embrioni di roditori nelle fasi iniziali quando il sistema uditivo periferico si sta formando. Il metodo presentato qui per la tracciatura selettiva delle fibre uditive facilita le prime sperimentazioni sulle proiezioni centrali in via di sviluppo dell'orecchio interno.

Abbiamo sviluppato questo protocollo, nel tentativo di identificare in modo differenziale proiezioni uditive centrali del nervo VIII, ma allo stesso modo può essere modificato per marcare selettivamente le fibre provenienti da altri organi sensoriali dell'orecchio interno. In contrasto con i metodi descritti in precedenza, questa procedura viene eseguita sul tessuto vivente con il circuito intatto. Un metodo simile è stato eseguito usato per descrivere tempi di innervazione afferente VIII uditivo durante l'embriogenesi aviaria, tuttavia, le fibre vestibolari stati anche inavvertitamente etichettati ³ Qui forniamo un metodo per identificare chiaramente regione o.risoluzione fibra igin e la terminazione, come pure ad alta unico di selezione centrale sporgente afferenze uditive durante l'embriogenesi dei vertebrati.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polystyrene Weigh Dish	Fisher Scientific	02-202-101
Petri Dish, 35 X 10 mm	Fisher Scientific	50820644	Use to make silicone dissection dish
Sylgard Silicone Elastomer Kit	World Precision Instruments	SYLG184	Coat Petri to make dissection dish
Dissection Pins	Various		Holds embryo in place during dissection
NaCL	Various		part of aCSF recipe
KCl	Various		part of aCSF recipe
KH2PO4	Various		part of aCSF recipe
NaHCO3	Various		part of aCSF recipe
Glucose	Various		part of aCSF recipe
CaCl2	Various		part of aCSF recipe
MgSO4	Various		part of aCSF recipe
Container for aCSF. Suggest translucent wide-mouth Nalgene jar, 500 ml (16 oz) with lid.	CPLabSafety	QP-PLC-03717	Drill hole opening in top of lid for glass bubling stem to penetrate liquid
Empty 5 ml glass vial or comparable transparent vial	American Pharmaceutical Partners, Inc	6332300105	Use during aCSF incubation to keep samples separate from each other and from the bubbling stream
Tank of carbogen (95%O2 / 5%CO2) connected by tubing to bubbler	Various		Attach by tubing to glass stem bubbler for infusion into aCSF
Glass stem bubbler	Various		To infuse carbogen into aCSF
Curved-tip forceps	World Precision Instruments	501008	To remove embryo head from egg
Two fine-tip forceps	World Precision Instruments	501985	For micro-dissection
50 ml Beaker	various
Rhodamine Dextran Amine (RDA)	Invitrogen	various	Fluorescent axon tracer
Triton X-100	ICN Biomedicals
Phosphate Buffered Saline, (1X PBS)	Various		Standard lab reagent
Thin Wall Glass Capillaries, 1.2 OD, .9 ID 4" (100 mm) length	World Precision Instruments	TW120F-4	Load with RDA. Each capillary makes two glass micropipettes
Needle / Pipette puller	David Kopf Instruments	Model 720	Settings used: Heat 16.4, Solenoid 2.2
Picospritzer	Parker Instrumentation	various	Attach by fine tubing to glass micropipette
Micromanipulator	Narishige	various
Dissection microscope with fluorescence	Various
4% Paraformaldehyde	Various		Standard lab reagent
anti-Neurofilament antibody, optional	Millipore	AB1991	Follow histological protocol recommended by manufacturer
Cryostat and associated materials for sectioning	Leica	various
Epifluorescent microscope for imaging	Zeiss, various