यहाँ हम एक microdissection श्रवण तंत्रिका और पश्चमस्तिष्क में अक्षतंतु फाइबर की अनुरेखण चयनात्मक के लिए जल्दी लड़की भ्रूण की ध्वनिक नाड़ीग्रन्थि में फ्लोरोसेंट डाई इंजेक्शन द्वारा पीछा तकनीक का वर्णन करता है.
भ्रूण लड़की परिधीय और केंद्रीय नाड़ीग्रन्थि सेल के अनुमानों के अध्ययन के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया मॉडल है. श्रवण प्रणाली, आठवीं कपाल तंत्रिका के भीतर श्रवण axons की चयनात्मक लेबलिंग केंद्रीय श्रवण सर्किट विकास के अध्ययन में वृद्धि होगी. इस दृष्टिकोण क्योंकि कई भीतरी कान की संवेदी अंगों को आठवीं 1 तंत्रिका योगदान के लिए चुनौतीपूर्ण है. इसके अलावा, अभी तक मार्करों कि मज़बूती एवियन आठवीं तंत्रिका भीतर axons के vestibular समूहों बनाम श्रवण भेद की पहचान की जा. श्रवण और vestibular रास्ते कार्यात्मक जल्दी भ्रूण में प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकते हैं, के रूप में संवेदी पैदा प्रतिक्रियाओं वर्तमान पहले सर्किट का गठन कर रहे हैं नहीं कर रहे हैं. केन्द्र पेश आठवीं तंत्रिका axons कुछ अध्ययनों में पता लगाया गया है, लेकिन श्रवण अक्षतंतु लेबलिंग अन्य आठवीं तंत्रिका 2,3 घटकों से लेबलिंग के साथ किया गया था. यहाँ, हम ध्वनिक नाड़ीग्रन्थि से चुनिंदा labe अग्रगामी पता लगाने के लिए एक विधि का वर्णनएल विकासशील आठवीं तंत्रिका भीतर श्रवण axons. सबसे पहले, एक लड़की 8 दिन oxygenated कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव में डूबे भ्रूण के पूर्वकाल मस्तक क्षेत्र के आंशिक विच्छेदन के बाद, कोकेलर नलिका संरचनात्मक स्थलों की पहचान की है. अगले, एक ठीक खींच लिया गिलास micropipette वाहिनी और आसन्न गहरी क्षेत्र में, जहां ध्वनिक नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं स्थित हैं में rhodamine dextran amine की एक छोटी राशि इंजेक्षन करने के लिए तैनात है. इंजेक्शन के बाद तीस मिनट के भीतर, श्रवण axons केन्द्र पश्चमस्तिष्क में पता लगाया जाता है और बाद में histologic तैयारी के बाद देखे जा सकते हैं. इस विधि केंद्रीय श्रवण सर्किट गठन परिधीय के विकास के अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है.
आठवीं तंत्रिका के प्रारंभिक विकास के अध्ययन भ्रूण कई अलग ganglia से उत्पन्न होने वाले axons की पहचान करने में कठिनाई की वजह से भाग में सीमित किया गया है. कई अध्ययनों से आणविक जल्दी विकास के दौरान श्रवण और vestibular स?…
The authors have nothing to disclose.
लेखकों के लिए सुझाव और इमेजिंग तकनीक और डॉ. डोरिस वू के साथ सहायता के लिए डा. Candace Hsieh जल्दी embryogenesis दौरान धन्यवाद लड़की भीतरी कान शरीर रचना विज्ञान पर विशेषज्ञता के लिए कामना करता हूं. यह काम IOS-0642346 NSF T32 – DC010775 एनआईएच, एनआईएच T32 GM008620, R01 DC010796 NIH, और डो P200A120165 GAANN द्वारा समर्थित किया गया.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Polystyrene Weigh Dish | Fisher Scientific | 02-202-101 | |
Petri Dish, 35 X 10 mm | Fisher Scientific | 50820644 | Use to make silicone dissection dish |
Sylgard Silicone Elastomer Kit | World Precision Instruments | SYLG184 | Coat Petri to make dissection dish |
Dissection Pins | Various | Holds embryo in place during dissection | |
NaCL | Various | part of aCSF recipe | |
KCl | Various | part of aCSF recipe | |
KH2PO4 | Various | part of aCSF recipe | |
NaHCO3 | Various | part of aCSF recipe | |
Glucose | Various | part of aCSF recipe | |
CaCl2 | Various | part of aCSF recipe | |
MgSO4 | Various | part of aCSF recipe | |
Container for aCSF. Suggest translucent wide-mouth Nalgene jar, 500 ml (16 oz) with lid. | CPLabSafety | QP-PLC-03717 | Drill hole opening in top of lid for glass bubling stem to penetrate liquid |
Empty 5 ml glass vial or comparable transparent vial | American Pharmaceutical Partners, Inc | 6332300105 | Use during aCSF incubation to keep samples separate from each other and from the bubbling stream |
Tank of carbogen (95%O2 / 5%CO2) connected by tubing to bubbler | Various | Attach by tubing to glass stem bubbler for infusion into aCSF | |
Glass stem bubbler | Various | To infuse carbogen into aCSF | |
Curved-tip forceps | World Precision Instruments | 501008 | To remove embryo head from egg |
Two fine-tip forceps | World Precision Instruments | 501985 | For micro-dissection |
50 ml Beaker | various | ||
Rhodamine Dextran Amine (RDA) | Invitrogen | various | Fluorescent axon tracer |
Triton X-100 | ICN Biomedicals | ||
Phosphate Buffered Saline, (1X PBS) | Various | Standard lab reagent | |
Thin Wall Glass Capillaries, 1.2 OD, .9 ID 4″ (100 mm) length | World Precision Instruments | TW120F-4 | Load with RDA. Each capillary makes two glass micropipettes |
Needle / Pipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | Settings used: Heat 16.4, Solenoid 2.2 |
Picospritzer | Parker Instrumentation | various | Attach by fine tubing to glass micropipette |
Micromanipulator | Narishige | various | |
Dissection microscope with fluorescence | Various | ||
4% Paraformaldehyde | Various | Standard lab reagent | |
anti-Neurofilament antibody, optional | Millipore | AB1991 | Follow histological protocol recommended by manufacturer |
Cryostat and associated materials for sectioning | Leica | various | |
Epifluorescent microscope for imaging | Zeiss, various |