Summary
Burada sinir ve arka beyin işitsel akson liflerinin izleme seçici için erken civciv embriyo akustik ganglion içine floresan boya enjeksiyonu takiben mikrodiseksiyon tekniği tarif.
Abstract
Embriyonik civciv periferik ve santral gangliyon hücre projeksiyonlar çalışma için yaygın olarak kullanılan bir modeldir. Işitsel sisteminde, sekizinci kranial sinir olan işitsel akson seçici etiketleme merkezi işitme devre geliştirme çalışması artıracaktır. Iç kulakta birden duyu organları VIII.yy. sinirin 1. katkıda çünkü bu yaklaşım zordur. Ayrıca, güvenilir bir kuş VIII.yy. sinir içinde akson vestibüler gruplar karşısında işitsel ayırt işaretleyicileri tespit edilmesi henüz. Devreler oluşur önce duyu-uyarılmış yanıtlar mevcut değil gibi işitsel ve vestibüler yolları, erken embriyo işlevsel olarak ayırt edilemez. Merkezi projelendirme VIII.yy. sinir aksonlar bazı çalışmalar takip edilmiştir, ama işitsel akson etiketleme diğer VIII.yy. sinir bileşenler 2,3 dan etiketleme eşlik etti. Burada, seçici labe için akustik gangliyondan anterograd izleme için bir yöntem açıklanmaktadırGelişmekte VIII.yy. sinir içinde l işitsel aksonlar. İlk olarak, oksijenli yapay beyin omurilik sıvısına batırılmış bir 8 günlük civciv embriyo ön sefalik bölgede kısmi diseksiyon sonrası, koklear kanal anatomik işaretlemeler ile tanımlanır. Daha sonra, bir ince çekilmiş cam mikropipet akustik ganglion hücreleri bulunan kanal ve komşu bölge içine derin rodamin dekstran amin küçük bir miktar enjekte etmek için konumlandırılmıştır. Enjeksiyonu takiben otuz dakika içinde, işitsel aksonlar arka beyin içine merkezi izlenir ve daha sonra histolojik hazırlanmasını takiben canlandırılabilir. Bu yöntem, merkezi işitsel devre oluşumu periferik gelişimsel çalışmalar için kullanışlı bir araç sağlar.
Protocol
1. Aşağıdaki Diseksiyon araçları ve Reaktifler hazırlayın
- Yapay serebrospinal akışkan (aCSF, 130 mM NaCl, 3 mM KCI, 1.2 mM KH 2 PO 4, 20 mM NaHCO 3, 3 mM HEPES, 10 mM glikoz, 2 mM CaCl2, 1.3 mM MgSO4) sürekli olarak% 95 O ile aşılanmış Oda sıcaklığında 2 /% 5 CO2. Infüzyon için 2/3 kapağı açılmış bir delik olan bir 500 ml geniş ağızlı Nalgene kavanoza doldurun. Tank kavanoz kapağı delikten aCSF nüfuz bir bardak kök bubbler için tüp tarafından eklenecektir. Sıvının yaklaşık 1/3 ulaşmak ancak jant üzerine sıçramasına neden olacak kadar güçlü değildir kabarcıklar sabit bir akım elde etmek için baskı ayarlayın. Birbirlerinden ve gaz akışı türbülans tek tek örnekleri ayırmak için Nalgene kavanozun içine daldırın 5 ml cam şişe (6'ya kadar). ACSF herhangi bir doku inkübasyondan önce en azından 20 dakika için oksijenli olmalıdır.
- Küçük silikon diseksiyon çanak (35 mm x 10 mmküçük altıgen polistiren içine yerleştirilen iki diseksiyon işaretçilerine (47 mm alt)) Sylgard Elastomere Kit kullanarak mm Petri kaplı tekne tartın.
- İki ince uçlu forseps, bir eğri uçlu forseps, 50 ml beher, ve doku atıklar için bir kap.
- Cam mikropipet (1.2 OD / 0.9 ID) ucunda açılış yaklaşık 20-50 mikron kadar kırılmış ve bir 6.25% çözüm rodamin dekstran amin (RDA, MW = 3.000, Invitrogen) ile dolu Pulled% 0.4 Triton PBS X-100 . Mikromanipülatör picospritzer ve stabilize etmek için ince tüp ile takın.
2. Mikro-disseksiyon E8 4,5 az Baziler Papilla Ortaya Çıkardı
- Kavisli bir forseps ile tekne tartmak içinde silikon kaplı diseksiyon çanak üzerine doğrudan başkanı yerleştirerek, sadece beyin sapı aşağıya E8 embriyo kesti.
- Ilgi tarafındaki kulağınızı hafifçe görünür şekilde diseksiyon işaretçilerine kullanarak, bir ventral görünümü ile baş konumlandırmak, başını hafifçe dorsal eğik ve 10-30 derece uzaklıkta ce gelen işaretnter (Şekil 2A). Hemen işaretçilerine ile kafa sabitleyin. Iki taraflı izleme istenirse, merkez 0 derece kafası, ya da bir tam alttan görünüşü her iki taraftan erişilebilir. Sol tarafta ulaşılabilir, böylece Benzer bir şekilde, sol taraflı enjeksiyon için, merkezi -10 ila -30 dereceye kadar kafa sabitleyin.
- 50 ml'lik beher kullanarak, tam doku daldırarak, çanak içine oksijenli aCSF, 30 ml aktarın.
- Hafifçe kavrayın ve ince ucu forseps kullanılarak alt çene aşağı soyma, ardından faiz tarafındaki alt gözkapağı çıkarın.
- Kalan damak ve gırtlak gibi, üstteki damar dokusu çıkarın. Bu yumuşak dokular sıyırın yüzeyinin de farklı vertebral arterler ile chondrocranium geliştirme pürüzsüz bir yüzey ifşa edilmelidir. Bu noktada, karakteristik beyaz otoconial kitle görünür olmalıdır.
- Içinde bırakarak dış meatus, çene eklem kıkırdağı ve orta kulak çevresindeki deri dikkatlice teşrihner kulak sağlam. Yavaşça bu kıkırdak yapıları kesip almak için forseps kullanın.
- Ince forseps ipuçları nazik bir süpürme hareketi ile vertebral arterler ve kan göllenmesi çıkarın. Kan görünüm belirsiz olabilir ve koagülasyon enjeksiyon pipeti açılış fişi olabilir.
- Bitişik duyusal epitel (baziler papilla) ve akustik gangliyon ile koklear kanal chondrocranium 6 altında yer alır ve anterior yakın distal-en uç (apeks) ile, ventral iç kulak uzanan uzunlamasına bir parmak şeklinde projeksiyon olarak görüntülenebilmektedir midline 5. Görselleştirme yardımcı olabilir koklear kanal (Şekil 2B) apekste disseksiyon ve / veya otolithic kireçlenmeler (beyaz) küçük bir kan havuzu (kırmızı) olabilir. Apekste lagenar makula, bir duyu yama vestibüler fonksiyonun 7,8 olduğu düşünülmektedir.
3. CN VIII İşitsel Elyaf seçici Etiketleme
- Yavaş yavaş ilk ponksiyon kafatasına mikropipet indirin. Bu kranial bölgenin çevresindeki alanlarda daha ince ve daha az güç nüfuz gerektirir. Mikropipet şimdi koklea kanal içinde olmalıdır. Opsiyonel: izleme boya küçük bir enjeksiyon baziler papilla görüntülenmesine yardım için burada yapılabilir.
- Mikropipet konumlandırarak olmadan, sadece ihlal koklear kanalın derin sınırına (Şekil 1) kadar düşürerek devam edin. Burada bir enjeksiyon yapın ve vestibüler lagena bulunduğu en proksimal bahşiş hariç, baziler papilla (Şekil 2C, 2D) uzunluğu boyunca birden çok bölgede tekrarlayın. 10-30 psi arasında yer alan picospritzer ile, birden çok enjeksiyon yapılır. Enjekte boya sıvı hacmi değişir ve istenilen etiketlenme ölçüde bağlıdır. Her enjeksiyon floresan boya-la yol açmalıdıryaklaşık 200 Beled nokta - 400 mikron çapında (Şekil 2B).
- Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, beyin sapı Yukarıdaki örnek transeksiyonu ve sürekli% 95 O 2 /% 5 CO 2 ile perfüze olan aCSF kapsayıcı içinde küçük bir kavanoza kaudal bölümünü yerleştirmek için bir transfer pipet kullanmak için forseps kullanabilir.
- Her bir embriyo için istenen merkezi izleme ve mesafeye bağlı olarak, boya transferi için 20-30 dk bekleyin.
- Dokular temizlenir ve histolojik kesit için hazırlamak. Burada gösterilen örnekte, doku% 4 paraformaldehit (1X PBS içerisinde) bir karışımı, gece boyunca,% 30 sakaroz (1X PBS içinde) batırılır.
4. Counterstaining ve Analiz
- Counterstaining orient sıra ilgi belirli bölgelerini belirlemek gibi anatomik konuma gözlemci yardım etmek yararlıdır. Bu preparat içinde etkili bir counterstain kuvvetle l nörofilaman immün (Şekiller 1, 3B, 3E), birAbels akson ve MSS aksonal yollarının çizilmesi için izin verir.
- Çıkıntılar rostro eksen boyunca birkaç yüz mikron ya da daha fazla uzatmak gibi analizi, etiketli bölge boyunca yapılmalıdır. Temel analiz bazı örnekler şunlardır: hedef hata oranları, zamanlama ve / veya projeksiyon modellerinin sapma değişiklikleri. RDA-etiketli aksonlar yüksek çözünürlüklü (Şekil 3A, 3B) ile periferik ve santral sinir sisteminde görüntülenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
VIII.yy. sinir ve sinir kendisi anatomisi bileşenleri (Şekil 1, 3), karmaşık ve karışık vardır. Seçici olarak akustik ganglion hücre kaynaklanan lifler izleme tarafından VIII sinir hem de beyin sapı içindeki birincil işitsel afferent kesimleri temiz bir şekilde takip edilebilir ve bunların muadilleri vestibüler (Şekil 2, 3) ayırt edilir. Aynı şekilde, bu tekniğin akustik ganglion hücrelerinin periferik projeksiyonları (Şekil 3G) incelemek için kullanılır, ya da bireysel vestibüler organları kaynaklanan projeksiyonları çalışma değiştirilmiş olabilir. Aksonlar temiz onların tüm uzunluğu boyunca takip Çünkü, doğru kantitatif analizleri Ayrıca, işitsel lif etiketleme önceki yaklaşımın aksine, ilk innervasyonu hassas zamanlama ve düzenleri dahil olmak üzere geliştirme sırasında vestibüler projeksiyonlar, hedefleme hata oranları, vb ayırt işitsel yapılabilir Bu yaklaşım performans olduğunuböylece sabit olmayan, canlı doku üzerinde med ve in vitro deneyler de, aynı anda, diğer de kullanılabilir.
Bu tekniğin E6-E9 embriyo için uygun olmasına rağmen işitsel aksonlar kendi primer santral hedefleri 3 innerve olduğunda, iyi sonuçlar E8 başlar. Buna karşılık, vestibüler projeksiyonlar önceki 9,10 beyinsapı gelmesi ve böylece teknik küçük boyutu ve bu yaşta vestibüler aparatı göreli gelişmemişlik nedeniyle zor olsa da, daha önceki izleme için daha iyi adaylar olarak hizmet verecek. Histolojik kesitler baziler papilla apikal en bölgenin vestibüler işlev olması ve etiketli eğer potansiyel sonuçları kirletebilir düşündüm küçük duyusal yama içerdiğinden, boya enjeksiyon yeri onaylamak için muayene edilmelidir.
Araştırmacı anatomi aşina sonra, en sık karşılaşılan sorunlardan üç aşağıdaki gibidir:
- Koklear duct boya izleme ile doludur, ama ganglion hücre aksonlar etiketli değildir. Bu sorun büyük olasılıkla enjeksiyon ganglion hücreleri ve sinir lifleri ikamet koklear kanal, derin gerçekleştirilemedi gösterir. Bu sorun, enjeksiyon mikropipet birinci delik chondrocranium ve daha sonra yavaşça kanalının diğer tarafında aracılığıyla sadece delinme şekilde gelişmiş olduğundan emin olarak düzeltilebilir. Alternatif olarak, enjeksiyon pipeti doğru yerleştirilmiş ancak boya yetersiz miktarda teslim edilmiş olabilir. Enjeksiyon enjeksiyon basıncı veya sayısının artırılması da bu sorunun üstesinden gelebilir.
- Sinir yanlışlıkla disseksiyon sırasında kıkırdak labirent çekerek aşırı bir sonucu olarak kesmiş edilir. Bu zorluk ince diseksiyon teknikleri ve orta kulak sınırlı diseksiyon kullanılarak önlenebilir.
- Enjeksiyon çok kapsamlıdır ve yanlışlıkla diğer duyusal ganglion hücreleri veya diğer sinir bileşenler kaynaklanan lifler etiketler. ThSorun enjeksiyon protokolleri optimize ederek minimize edilebilir, ve enjeksiyon basıncı veya darbe sayısını azaltarak, ya da enjeksiyon yeri değişen gerektirebilir.
Potansiyel analizleri iki örnekler şunlardır:
- Projeksiyon desen Farklılıklar: etiketli belirli bir eksen boyunca akson ve nasıl aşağıdaki deney etkilenebilecek ölçüde belirler. Rostro uzaklaşma olarak tarif edilebilir:
(Sayı bölümler etiketli aksonlar içeren) x (her bölüm Kalınlığı) Bu tedbir baziler papilla bir oranı olarak boya etiket ölçüde düzeltilmiş veya zıt doku, etiketli VIII.yy. sinir aksonlar oranı için olabilir. Bu etiketli aksonlar temiz arka beyin kendi terminali alanları için izlenebilir olarak, topografik projeksiyonlar analiz etmek için bir araçtır. Tonotopy ölçümleri için, boya enjeksiyon bas boyunca ilgi bölge ile sınırlı olmalıdırIlar papilla.
- Hataları Hedefleme: analiz dokusu önceden belirlenmiş her bölgesi (embriyo, vb başına, bölüm başı olabilir) için yanlış yönlendirilmiştir akson frekansını belirler. Pertürbasyonlar anormal bir projeksiyon yol izleyen ya da uygunsuz bir bölge içinde sonlanan aksonlar neden olabilir. Hataları miktarının zaman, sayılar embriyolar arasında enjeksiyon miktarları farkı hesaba normalize edilmelidir. Daha küçük enjeksiyonlar tek aksonlar atacak yeteneği neden daha olasıdır. Temel hedefleme hata analizi olarak tarif edilebilir:
Şekil 1. Ile sadeleştirme için E6 beyinsapı Koronal görünümbilateral akustik ganglionlarda bozulmadan. şematize kırmızı pipet dorsolateral giriş noktasından akustik ganglion hücrelerinin hassas hedefleme göstermektedir. Bölümler aksonal projeksiyonlar vurgulamak için anti-nörofilament ile immunolabeled edilir. Vestibüler organların gösterildiği bölümlere rostral vardır. Seçici işitsel lif RDA enjeksiyon Bölge kırmızı pipet illüstrasyon ile gösterdi izleme,. VIII = vestibülokoklear sinir, AG = akustik ganglion, VG = vestibüler ganglion. Dorsal kadardır. Ölçek bar = 300 mikron.
Şekil 2. Mikrodisseksiyon ve hedef bölgeye enjeksiyonu. Diseksiyon çanak embriyo (A) Uygun konumu, kafa ile ventral görünümü dorsal eğilmiş ve sağ tarafında daha iyi erişim sağlamak için biraz yana döndü. Sağ ear gösterilir ve altta yatan baziler papilla kesikli çizgi ile gösterilir. Arrowhead (A) ve (B) bir pipet ekleme (B) Aşağıdaki diseksiyon ilk konumunu göstermektedir, beyaz bir otoconial kütle baziler papilla (ok) ve tepe sınır çizilmesi, görülebilir. (C, D) bir ilk enjeksiyon sağlamalıdır Koklear kanal özetlemektedir. (D) Müteakip enjeksiyonlar akustik ganglion bölgeye koklear kanal ve baziler papilla sadece derin yapılmalıdır. RDA floresans arttırıcı enjeksiyon derinlik algısı yararlıdır ve her enjeksiyon yaklaşık 200 bir floresan boya etiketli nokta oluşturmanız gerekir - 400 mikron çaplı burada görüldüğü gibi. Ölçek bar = 2 mm.
FŞEKIL 3. Bir E8 embriyo izlemeyi seçici işitsel lif Temsilcisi görüntüleri. (AC) Düşük güç ve (DG) yüksek güç 25 mikron farklı düzlemlerde aynı embriyo toplanan koronal kesitler. (A) RDA etiketli aksonlar enjeksiyon yerinde (ok ucundan izlenebilir ), kranial sinir (ok) yoluyla ve kaudal primer işitsel çekirdeklerin hedefler (çift ok başı) doğru. Anti-nörofilament antikoru golleri ile (B) immün tüm aksonal projeksiyonlar ve (A) 'dan RDA-takip lifler işitsel projeksiyon dahilinde yolağı. Ayrı Yerleşimi (A) ve (B) bir renk olarak gösterilen kanalların (C). Daha kuyruk konumda aynı embriyo (DF) yüksek güç görüntü giriş noktasında sinir liflerinin (A) yüksek çözünürlükte (göstermektedir birleştirme ok) ve merkezi yol boyunca (çift ok başı). (E) </ Strong> Tüm aksonların leke Nörofilaman PNS-MSS sınırlandırılması gibi vestibüler projeksiyonları karşı olası işitsel sağlar. Ac ve Vc ilgili işitsel ve sinir giriş noktasına santral vestibüler projeksiyonları gösteriyor ise Ap ve Vp, ilgili işitsel ve vestibüler bileşenleri sinir giriş noktasına periferik göstermektedir. Ayrı Yerleşimi (D) ve (E) bir renk olarak gösterildiği kanallarda birleştirme (F). (G) akustik ganglion histolojik incelemesi (AF) gösterildiği izleme ve periferik projeksiyonları (gelen etiketli akustik ganglion hücrelerinin yerini ortaya koymaktadır asteriks) baziler papilla retrograd takip edilmektedir. (H) 700 ml'lik bir izleme yolunun İllüstrasyon E8 işitsel özgü VIII etiketleme ile bekleniyor. Enjeksiyon bölgesi (kırmızı daire) sinir giriş noktasına kaudal ve merkez projeksiyonlar rostral ve kaudal kez arka beyin yolculuk. Vp = periferik yelekibular, Ap = periferik işitsel, Vc = santral vestibüler, Ac = merkezi işitme, AG = inferior vestibüler ganglion IVG = akustik ganglion, BP = baziler papilla, LM = lagenar makula, SVG = süperior vestibüler ganglion. AC için Ölçek bar = 300 mikron, DF 100 mikron, G 100 mikron ve H 500 mikron.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
VIII.yy. sinirin erken geliştirme çalışmaları nedeniyle birden çok farklı gangliyon kaynaklanan embriyonik aksonlar tanımada zorluk kısmen sınırlı kalmıştır. Çeşitli çalışmalar erken gelişimi sırasında işitsel ve vestibüler duyu hücre ve ganglion hücre kaderi rehberlik moleküler sinyaller, 5,11,12 araştırdı fakat merkezi innervasyon düzenleyen süreçler belirlenecek henüz. Az ilköğretim çekirdekler için projelendirme merkezi süreçleri hakkında bilinenler ise akustik gangliyon hücre projeksiyonlar Raporlar genellikle duyusal epitel 13-15 periferik süreçleri tarif. Embriyogenez sırasında merkezi projelendirme VIII alt bölümlerinin çalışmalar böyle bir memeli doku dilim 17 embriyonik civciv arka beyin 16 veya kalsiyum görüntüleme, optik kayıtlar, genellikle elektrofizyolojik ama önce nöral devrelerin tamamlanması yapılamaz. Etikete immunolojik belirteçlerinin kullanımıcivciv VIII.yy. sinir işitsel aksonlar anda mümkün değildir. Transkripsiyon faktörlerinin farklı gruplar vestibüler nöronlar 18-23 versus işitsel korele olduğu tespit edilmiş olsa da, bu faktörlerin ifadesi aksonlar çıkarılmıştır. Farelerde, farklılıklar modaliteleri arasında akson büyüme ayırt olabilir. Bu genlerin ürünleri 23 daha fazla çalışma memeli ve kuş hem çalışmalar için önemli araçlar verebilir bazı umut verici adaylar dahil gen ekspresyonu spiral ganglion ve vestibüler ganglionlarda arasında bulunmuştur. Yöntemleri burada tarif ile, sağlam bir işitsel devresi ile embriyonik doku yaşayan işitsel lifler seçici kendi merkezi hedeflerine izlenebilmektedir.
Tavuk embriyo gelişim biyologlar için özellikle yararlıdır omurgalı sistemi ve memeli sistemlerinde bulunan bazı sınırlamaları aşmak mümkün. Erken iç kulak desenlendirme ve morfonogenezi Yönetmeliğicivciv embriyolarının periferik işitme sistemi oluşturuluyor zaman erken aşamalarında daha büyük ve kemirgen embriyolar daha kolay erişilebilir ise kuşlar, memeliler 1,12 için dikkate değer bir benzerlik gösterir. Işitsel liflerin seçici izleme için burada sunulan yöntem geliştirerek iç kulağın orta projeksiyonlar erken deneyler kolaylaştırır.
Biz ayirt VIII.yy. sinir merkezi işitme projeksiyonları tanımlamak amacıyla bu protokolü geliştirdi, ama aynı şekilde seçici olarak iç kulağın diğer duyu organlarından gelen lifler etiketlemek için modifiye edilebilir. Daha önce tarif edilen yöntemler aksine, bu işlem bozulmamış tüm devre ile canlı dokuda gerçekleştirilir. Yapılan benzer bir yöntem kuş embriyogenez sırasında VIII işitsel afferent innervasyonunu zamanlaması tanımlamak için kullanılmıştır, ancak vestibüler lifler de yanlışlıkla etiketli Burada 3 biz açıkça bölge veya tanımlamak için bir yöntem sağlar.select igin ve sonlandırma, yanı sıra yüksek tek lif çözünürlüklü omurgalı embriyogenez sırasında işitsel afferentlerin merkezi projelendirme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan edilir.
Acknowledgments
Yazarlar erken embriyonik dönemde piliç iç kulak anatomisi üzerine uzmanlık için görüntüleme teknikleri ve Dr Doris Wu ile öneri ve yardım için Dr Candace Hsieh teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NSF IOS-0642346, NIH T32-DC010775, NIH T32-GM008620, NIH R01-DC010796 ve DOE GAANN P200A120165 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene Weigh Dish | Fisher Scientific | 02-202-101 | |
| Petri Dish, 35 X 10 mm | Fisher Scientific | 50820644 | Use to make silicone dissection dish |
| Sylgard Silicone Elastomer Kit | World Precision Instruments | SYLG184 | Coat Petri to make dissection dish |
| Dissection Pins | Various | Holds embryo in place during dissection | |
| NaCL | Various | part of aCSF recipe | |
| KCl | Various | part of aCSF recipe | |
| KH2PO4 | Various | part of aCSF recipe | |
| NaHCO3 | Various | part of aCSF recipe | |
| Glucose | Various | part of aCSF recipe | |
| CaCl2 | Various | part of aCSF recipe | |
| MgSO4 | Various | part of aCSF recipe | |
| Container for aCSF. Suggest translucent wide-mouth Nalgene jar, 500 ml (16 oz) with lid. | CPLabSafety | QP-PLC-03717 | Drill hole opening in top of lid for glass bubling stem to penetrate liquid |
| Empty 5 ml glass vial or comparable transparent vial | American Pharmaceutical Partners, Inc | 6332300105 | Use during aCSF incubation to keep samples separate from each other and from the bubbling stream |
| Tank of carbogen (95%O2 / 5%CO2) connected by tubing to bubbler | Various | Attach by tubing to glass stem bubbler for infusion into aCSF | |
| Glass stem bubbler | Various | To infuse carbogen into aCSF | |
| Curved-tip forceps | World Precision Instruments | 501008 | To remove embryo head from egg |
| Two fine-tip forceps | World Precision Instruments | 501985 | For micro-dissection |
| 50 ml Beaker | various | ||
| Rhodamine Dextran Amine (RDA) | Invitrogen | various | Fluorescent axon tracer |
| Triton X-100 | ICN Biomedicals | ||
| Phosphate Buffered Saline, (1X PBS) | Various | Standard lab reagent | |
| Thin Wall Glass Capillaries, 1.2 OD, .9 ID 4" (100 mm) length | World Precision Instruments | TW120F-4 | Load with RDA. Each capillary makes two glass micropipettes |
| Needle / Pipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | Settings used: Heat 16.4, Solenoid 2.2 |
| Picospritzer | Parker Instrumentation | various | Attach by fine tubing to glass micropipette |
| Micromanipulator | Narishige | various | |
| Dissection microscope with fluorescence | Various | ||
| 4% Paraformaldehyde | Various | Standard lab reagent | |
| anti-Neurofilament antibody, optional | Millipore | AB1991 | Follow histological protocol recommended by manufacturer |
| Cryostat and associated materials for sectioning | Leica | various | |
| Epifluorescent microscope for imaging | Zeiss, various |
References
- Groves, A. K., Fekete, D. M. Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning. Development. 139, 245-257 (2012).
- Pflieger, J. F., Cabana, T. The vestibular primary afferents and the vestibulospinal projections in the developing and adult opossum, Monodelphis domestica. Anatomy and Embryology. 194, 75-88 (1996).
- Molea, D., Rubel, E. W. Timing and topography of nucleus magnocellularis innervation by the cochlear ganglion. The Journal of Comparative Neurology. 466, 577-591 (2003).
- Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken. The Journal of Comparative Neurology. 368, 620-630 (1996).
- Brigande, J. V., Kiernan, A. E., Gao, X., Iten, L. E., Fekete, D. M. Molecular genetics of pattern formation in the inner ear: do compartment boundaries play a role. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11700-11706 (1073).
- Bellairs, R., Osmond, M. The atlas of chick development. , 2nd Edn, Elsevier. (2005).
- Manley, G. A., Haeseler, C., Brix, J. Innervation patterns and spontaneous activity of afferent fibres to the lagenar macula and apical basilar papilla of the chick's cochlea. Hearing Research. 56, 211-226 (1991).
- Code, R. A. Efferent neurons to the macular lagena in the embryonic chick. Hearing Research. 82, 26-30 (1995).
- Maklad, A., Fritzsch, B. Development of vestibular afferent projections into the hindbrain and their central targets. Brain Research Bulletin. 60, 497-510 (2003).
- Rubel, E. W., Fritzsch, B. Auditory system development: primary auditory neurons and their targets. Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).
- Satoh, T., Fekete, D. M. Lineage analysis of inner ear cells using genomic tags for clonal identification. Methods Mol. Biol. 493, 47-63 (2009).
- Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. The International Journal of Developmental Biology. 51, 521-533 (2007).
- Appler, J. M., Goodrich, L. V. Connecting the ear to the brain: Molecular mechanisms of auditory circuit assembly. Progress in Neurobiology. 93, 488-508 (2011).
- Bulankina, A. V., Moser, T. Neural circuit development in the mammalian cochlea. Physiology (Bethesda). 27, 100-112 (2012).
- Fekete, D. M., Campero, A. M. Axon guidance in the inner ear. The International Journal of Developmental Biology. 51, 549-556 (2007).
- Momose-Sato, Y., Glover, J. C., Sato, K. Development of functional synaptic connections in the auditory system visualized with optical recording: afferent-evoked activity is present from early stages. Journal of Neurophysiology. 96, 1949-1962 (2006).
- Marrs, G. S., Spirou, G. A. Embryonic assembly of auditory circuits: spiral ganglion and brainstem. The Journal of Physiology. 590, 2391-2408 (2012).
- Milo, M., et al. Genomic analysis of the function of the transcription factor gata3 during development of the mammalian inner ear. PloS One. 4, e7144 (2009).
- Fritzsch, B., Eberl, D. F., Beisel, K. W. The role of bHLH genes in ear development and evolution: revisiting a 10-year-old hypothesis. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67, 3089-3099 (2010).
- Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. Neurod1 regulates survival and formation of connections in mouse ear and brain. Cell and Tissue Research. 341, 95-110 (2010).
- Huang, E. J., et al. Brn3a is a transcriptional regulator of soma size, target field innervation and axon pathfinding of inner ear sensory neurons. Development. 128, 2421-2432 (2001).
- Jones, J. M., Warchol, M. E. Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 516, 507-518 (2009).
- Lu, C. C., Appler, J. M., Houseman, E. A., Goodrich, L. V. Developmental profiling of spiral ganglion neurons reveals insights into auditory circuit assembly. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 10903-10918 (2011).
