禽流感胚胎听神经听觉神经纤维的选择性跟踪

Summary

在这里，我们描述了一个显微切割技术，用荧光染料注射到声早期鸡胚神经节选择性地跟踪听觉神经轴突的神经纤维和后脑。

Abstract

鸡胚是一种广泛使用的外周和中枢的神经节细胞预测模型的研究。在听觉系统，听觉选择性标记的第八次颅神经轴突内将提高研究听觉中枢电路的发展。这种方法是具有挑战性的，因为多种感官的内耳器官的第八次神经。此外，可靠区分的标记，听觉与前庭禽流第八次神经轴突内还没有得到确定。听觉和前庭通路不能区分功能在早期胚胎中，感觉诱发反应不存在之前形成的电路。中心突出的第八次神经轴突已经在一些研究中追踪，伴随着但听觉神经轴突标签的标签从其他的第八次神经组件^2,3。在这里，我们描述的方法，顺行追踪声节有选择地拉贝升听觉的第八次神经轴突内。首先，在为期8天的鸡胚沉浸在氧合人工脑脊液的前头部的局部解剖，解剖标志确定的蜗管。接着，罚款拉玻璃微被定位成注入少量罗丹明葡聚糖胺进入管和相邻的位于较深的区域中的声学的神经节细胞。在注射30分钟后，听觉神经轴突集中到后脑被跟踪，以后可以可视化的组织学准备。这种方法提供了一个有用的工具，周边听觉中枢电路形成发育研究。

Protocol

1。准备好以下的解剖工具和试剂

• 人工脑脊液（人工脑脊液; 130 mM氯化钠，3 mM KCl中，1.2毫摩尔KH ₂ PO _4，20毫摩尔的NaHCO _3，3 mM的HEPES，10mM的葡萄糖，2毫摩尔的CaCl _2，1.3 mM的用MgSO _4）用95％O连续输注_{2/5％CO 2中} ，在室温下。输液，补到2/3的500毫升广口的Nalgene瓶的盖子钻了一个洞。坦克通过管道将被附加的玻璃干起泡，贯通通过的jar盖中的孔的人工脑脊液。调整压力以获得恒定的气泡流，达到约1/3的液体，但力度不够导致溅在轮辋。淹没的Nalgene罐分开个别样品从对方的气体湍流的5毫升玻璃小瓶（最多6个）。学联应含氧为任何组织孵育之前至少20分钟。
• 小硅夹层盘（35毫米×10权衡船毫米的Petri涂层的使用Sylgard的人造橡胶包）用解剖针放入小六角聚苯乙烯（47毫米底部）。
• 两个细尖镊子，一个弯曲尖端钳，一个50毫升烧杯中，和用于组织废物的容器。
• 被拉玻璃微（1.2 OD / 0.9 ID）破碎至约20-50微米的前端开放，并填充与罗丹明葡聚糖胺（RDA，分子量= 3000，Invitrogen公司）中的6.25％的溶液与0.4％的Triton X-100的PBS 。安装细管，以picospritzer和稳定微操作机器人。

2。微解剖，揭示基底乳头E8 ^4,5

1. 用弯钳，切割E8胚胎的正下方脑干，直接将头权衡船到有机硅涂层的解剖盘内。
2. 用解剖针，头的位置，一个腹面观，所以在耳朵上侧的利益是稍微明显，头部稍微倾斜的背部和指向10-30度，距离CE印表机（ 图2A）。立即用别针固定头。如果双边跟踪需要，在0度，中心的头，或一个完整的腹面观，使双方可以访问。类似地，对于一个左双面喷射，在-10℃至-30度的头部固定从中心使左侧是可访问的。
3. 使用50毫升的烧杯中，30毫升的含氧脑脊液转移入菜，完全浸没在组织。
4. 轻轻抓住下颌细尖镊子剥离下来，然后取出下眼睑上侧的兴趣。
5. 上面的血管组织，包括任何剩余的腭和咽喉。这些软组织剥离露出光滑的表面，在其表面上具有鲜明的椎动脉显影chondrocranium。由这点，特征的白色otoconial质量应该是可见的。
6. 仔细解剖周围皮肤的外鼻道，下颌关节软骨及中耳，而离开内耳完整。使用镊子轻轻地切掉软骨结构。
7. 删除椎动脉和集中使用斯文扫地运动的血液用细镊子提示的。可以掩盖血和凝血可能会堵塞注射针口。
8. 蜗管与相邻的感觉上皮（基底乳头）和声学神经节直接位于下方chondrocranium ^6的，并可以被形象化为一个细长的手指状突起从内耳腹侧延伸，与最远侧尖端（顶点）附近的前中线^5。有可能是一个小的解剖和/或耳石钙化的（白色），蜗管（ 图2B），可以帮助可视化的顶点池的血（红色）。在的顶点是lagenar的黄斑，有感觉的补丁被认为是前庭功能^7,8。

3。 CN第八听觉纤维的选择性标记

1. 慢慢地降低的微量移液器第一穿刺头盖骨。这颅地区是厚度小于周边地区和需要减穿透力。微管现在应该蜗管内。可选：一个小的注射追踪染料，可在这里，以帮助可视化的基底乳头。
2. 不重新定位微管的情况下，继续降低，直到它只是违反了深边境的蜗管（ 图1）。在这里执行注射剂，并重复沿基底乳头的长度（ 图2C，2D），在多个区域内不含前庭lagena位于最近端的小费。 10-30磅之间，picospritzer，多次注射。注入染料的流体的体积的变化，并取决于所需的程度上的标签。每次注射应导致的荧光染料 - 拉贝莱德点约为200 - 400微米直径的（ 图2D）。
3. 一旦注射完成后，用钳子来横切脑干上面的示例中，使用移液管，放置到一个小罐子的尾部的人工脑脊液的容器内，用95％O _{2/5％CO 2的}不断灌注。
4. 对于每个胚胎，允许20-30分钟的染料转移，这取决于所需的距离上的中心跟踪。
5. 删除组织和准备​​组织学切片。在这里所示的例子中，在4％多聚甲醛（在1X PBS）过夜，30％蔗糖（1X PBS）过夜组织浸渍。

4。 Counterstaining与分析

1. Counterstaining是非常有用的帮助观察者的解剖位置，以及确定特定地区的利益。在此制备一种有效的染液是神经丝免疫标记（ 图1，图3B，3E），这强烈升abels轴突和可以划分在中枢神经系统的轴突大片。
2. 分析应该执行整个标记的区域中，，突起可以延长几百微米或更大沿rostrocaudal轴。基本分析的一些例子是：目标错误率，时序和/或发散的突起图形的变化。 RDA-标记的轴突与高分辨率（ 图3A，3D）的外周和中枢神经系统中的可视化。

Representative Results

第八次神经和神经本身的解剖结构的组成部分是复杂的，错综复杂的（ 图1，图3）。通过选择性地跟踪从声学的神经节细胞所产生的纤维，可以干净地跟踪段的第八次神经，以及初级听觉传入脑干内区别于他们的前庭同行（ 图2，图3）。同样地，这种技术可用于研究声学的神经节细胞的周缘凸部（ 图3G），或修改，以研究从个别前庭器官所产生的凸起。 ，因为轴突干净追溯到沿其整个长度，准确的定量分析，可以进行区分听觉前庭预测在开发过程中，包括精确的初始神经支配的时间和模式，瞄准误差率等。此外，与以往的做法不同的听觉纤维的标签，此方法是PERFOR，MED非固定，生物体组织上，因此可以同时使用其他体外实验。

虽然这种技术适用于胚胎E6-E9，最好的结果时，开始在E8听觉神经轴突中央支配他们的主要目标^3。相反，前庭预测到达脑干早期^9,10，从而为更好的候选人的早期跟踪，虽然在技术上具有挑战性，由于规模小和相对不成熟，在这个年龄段的前庭器官。应组织切片检查，以确认位置的染料注射液，大部分区域的基底乳头的顶端包含一个小的感觉补丁被认为是前庭功能，如果标有可能污染的结果。

一旦调查是熟悉的解剖结构，最常遇到的问题如下：

• 人工耳蜗杜CT是充满了追踪染料，但神经节细胞轴突都没有标记。这个问题可能表明，蜗管，神经节细胞和神经纤维的注射液进行深。此问题可以校正通过确保注射微量吸移管的第一穿刺chondrocranium，然后轻轻地前进，从而只是通过导管的另一侧的穿刺。另外，注射移液管可能已被正确地定位，但染料数量不足交货。提高注射压力和注射次数，还可以克服这个问题。
• 不经意间，神经横断作为软骨迷宫剥离时过度拉扯的结果。这种困难，可避免采用精细的解剖技术和有限的中耳解剖。
• 注射过于广泛，无意中标签等感觉神经节细胞或纤维所产生的其他神经成分。钍的问题可以被最小化通过优化喷射协议，并可能需要降低喷射压力或的脉冲数，或移位的位置注射。

两个潜在的分析的例子是：

1. 发散的投影模式标记的轴突沿特定轴线，他们可能会受到影响下面的实验：决定程度。 Rostrocaudal分歧可以被描述为：

（号码部分包含标记的轴突）×（每个部分的厚度）这措施可校正染料标记作为基底乳头的比例的程度，或者在复染组织，为第八次标记的神经轴突比例。这是一个有用的工具，分析地形的预测，作为标记的轴突可以清晰地追踪到他们的终端领域的后脑。染料注射对于测量tonotopy，应限制到感兴趣的区域，沿基本ILAR乳头。

2. 瞄准误差：确定错误定位轴突分析组织（可以是每部分，每胚， 等 ）为每一个预定区域的频率。扰动可能会导致异常的投影路径中的不适当区域或终止在轴突。量化错误时，数字应被归帐户胚胎注射量之间的差异。规模较小的注射是更可能导致在单个轴突的得分能力。一个基本的定位误差分析可以描述为：

图1。为简化E6脑干冠状双侧听神经完好无损。图式红色吸管说明准确的定位声学神经节细胞从背外侧入口点。抗神经丝节immunolabeled突出轴突的预测。前庭器官的喙部分所示。地区的RDA注射选择性听觉纤维跟踪证明用红色吸管插图。八，听神经，AG =声节，VG =前庭神经节。背。比例尺= 300微米。

图2。显微切割技术和注塑的目标区域。（A）适当的位置的胚胎解剖盘，倾斜的背部和头部腹面观转向略向一侧，以便更好地向右侧的访问。右E芳示出和底层基底乳头是用虚线表示。箭头（A）和（B）所示的初始位置的吸管插入（B）以下解剖，一个白色的otoconial质量是可见的，顶边界划定的基底乳头（箭头）。（C，D）第一次注射应提供概述（D）的蜗管。随后的注射应做深，蜗管和基底乳头到声神经节区。 RDA的荧光是有用的在加强注射深度知觉和每个单独的注射应建立一个荧光染料标记的点的约200 - 400微米直径的，因为在这里看到。比例尺= 2毫米。

FIGURE 3。代表图像的选择性听觉纤维中的E8胚胎的跟踪。（AC）低功率和高功率（DG）（A）25微米收集的冠状面，从相同的胚胎在不同的平面。RDA标记的轴突可以追溯到从注射部位（箭头（B）），通过对颅神经（箭头）和尾部向主的听觉核目标（双箭头）。应用免疫与抗神经丝抗体亮点轴突的预测和RDA跟踪纤维（A）在听觉投影途径。叠加独立的（A）和（B）（C），（DF）的高功率更尾鳍的位置相同的胚胎演示图像（A）的高分辨率的纤维在神经的入口点（中作为彩色显示的信道合并箭头所示），沿着中央通路（双箭头），（E）</ STRONG>所有轴突的神经丝蛋白染色允许划分的PNS-CNS以及公认的的听觉与前庭预测的。鸭和副总裁表示各自的听觉和前庭功能组件，周边的神经入口点，，，而Ac和VC指示各中央的神经入口点的听觉和前庭预测的。叠加单独的（D）和（E）作为彩色显示的信道合并的（F），（G）的声学神经节的组织学检查揭示从跟踪中所示（AF）和它们的周缘凸部（位置的标记的声学神经节细胞星号），被跟踪的基底乳头逆行。（H）插图预期的700微米跟踪通路与听觉的第八标签，在E8。注射部位（红色圆圈）是尾椎神经入点和中心预测，旅游头端和尾端一次在后脑。 VP =周边背心ibular，鸭外周听觉，VC =前庭中枢性，AC = AG中枢听觉，声节，BP =基底乳头，LM = lagenar黄斑，SVG前庭神经节，自愿终止妊娠=前庭下神经节。比例尺= 300微米的交流，DF为100微米，100微米的G和H 中有500微米。

Discussion

第八次神经的早期发展研究已部分限制，因为很难确定胚胎从多个不同的神经轴突产生。一些研究探讨了指导听觉和前庭感觉细胞和神经节细胞的命运在早期发育过程中的分子信号^{，5,11,12，}但还没有得到确定的调节中央神经支配的进程。声神经节细胞预测报告通常描述外围过程到感觉上皮^{13日至15日} ，而被称为中央工艺主要核突出。中央突出第八细分在胚胎发育过程中的研究也常常电生理学，如光学录音鸡胚后脑¹⁶或钙在哺乳动物组织切片^17的成像，但神经回路完成之前，不能执行。免疫学标志物的使用标签听觉在鸡胚第八次神经轴突是目前可行的。虽然已经确定，不同群体的转录因子与听觉与前庭神经元^18-23，轴突的表达，这些因素被排除。在小鼠实验中，分歧已发现螺旋神经节，前庭神经节之间的基因表达，包括一些有希望的候选人，可以区分轴突的生长方式^。23进一步研究这些基因的产品可能会产生的哺乳动物和鸟类研究的重要工具。用这里描述的方法，与一个完整的听觉电路生活胚胎组织的听觉纤维可以被选择性地追溯到它们的中心的目标。

鸡胚胎是一个特别有用的脊椎动物系统发育生物学家，是能够克服一些在哺乳动物系统中的限制。早期内耳的图案和形态的规管鸟表现出惊人的相似到哺乳动物^1,12，，而鸡胚较大，更容易获得比啮齿动物胚胎的早期阶段时，外周听觉系统正在形成。这里介绍的方法，选择性跟踪的听觉纤维促进中心预测的内耳发育的早期实验。

我们开发了这个协议的差异第八次神经的中枢听觉的预测，但同样可以进行修改，以选择地将标签从其他感觉器官的内耳纤维。在先前描述的方法相比，此程序进行对活组织的整个电路完好。采用类似的方法进行描述第八听觉传入禽流感胚胎发育过程中神经支配的时间，但是，前庭神经纤维也无意中标记^。3在这里，我们提供一个方法来清楚地确定区域或igin和终止，以及高纤维分辨率的选择集中投射在脊椎动物胚胎发育的听觉传入。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polystyrene Weigh Dish	Fisher Scientific	02-202-101
Petri Dish, 35 X 10 mm	Fisher Scientific	50820644	Use to make silicone dissection dish
Sylgard Silicone Elastomer Kit	World Precision Instruments	SYLG184	Coat Petri to make dissection dish
Dissection Pins	Various		Holds embryo in place during dissection
NaCL	Various		part of aCSF recipe
KCl	Various		part of aCSF recipe
KH2PO4	Various		part of aCSF recipe
NaHCO3	Various		part of aCSF recipe
Glucose	Various		part of aCSF recipe
CaCl2	Various		part of aCSF recipe
MgSO4	Various		part of aCSF recipe
Container for aCSF. Suggest translucent wide-mouth Nalgene jar, 500 ml (16 oz) with lid.	CPLabSafety	QP-PLC-03717	Drill hole opening in top of lid for glass bubling stem to penetrate liquid
Empty 5 ml glass vial or comparable transparent vial	American Pharmaceutical Partners, Inc	6332300105	Use during aCSF incubation to keep samples separate from each other and from the bubbling stream
Tank of carbogen (95%O2 / 5%CO2) connected by tubing to bubbler	Various		Attach by tubing to glass stem bubbler for infusion into aCSF
Glass stem bubbler	Various		To infuse carbogen into aCSF
Curved-tip forceps	World Precision Instruments	501008	To remove embryo head from egg
Two fine-tip forceps	World Precision Instruments	501985	For micro-dissection
50 ml Beaker	various
Rhodamine Dextran Amine (RDA)	Invitrogen	various	Fluorescent axon tracer
Triton X-100	ICN Biomedicals
Phosphate Buffered Saline, (1X PBS)	Various		Standard lab reagent
Thin Wall Glass Capillaries, 1.2 OD, .9 ID 4" (100 mm) length	World Precision Instruments	TW120F-4	Load with RDA. Each capillary makes two glass micropipettes
Needle / Pipette puller	David Kopf Instruments	Model 720	Settings used: Heat 16.4, Solenoid 2.2
Picospritzer	Parker Instrumentation	various	Attach by fine tubing to glass micropipette
Micromanipulator	Narishige	various
Dissection microscope with fluorescence	Various
4% Paraformaldehyde	Various		Standard lab reagent
anti-Neurofilament antibody, optional	Millipore	AB1991	Follow histological protocol recommended by manufacturer
Cryostat and associated materials for sectioning	Leica	various
Epifluorescent microscope for imaging	Zeiss, various