Summary
यहाँ हम एक microdissection श्रवण तंत्रिका और पश्चमस्तिष्क में अक्षतंतु फाइबर की अनुरेखण चयनात्मक के लिए जल्दी लड़की भ्रूण की ध्वनिक नाड़ीग्रन्थि में फ्लोरोसेंट डाई इंजेक्शन द्वारा पीछा तकनीक का वर्णन करता है.
Abstract
भ्रूण लड़की परिधीय और केंद्रीय नाड़ीग्रन्थि सेल के अनुमानों के अध्ययन के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया मॉडल है. श्रवण प्रणाली, आठवीं कपाल तंत्रिका के भीतर श्रवण axons की चयनात्मक लेबलिंग केंद्रीय श्रवण सर्किट विकास के अध्ययन में वृद्धि होगी. इस दृष्टिकोण क्योंकि कई भीतरी कान की संवेदी अंगों को आठवीं 1 तंत्रिका योगदान के लिए चुनौतीपूर्ण है. इसके अलावा, अभी तक मार्करों कि मज़बूती एवियन आठवीं तंत्रिका भीतर axons के vestibular समूहों बनाम श्रवण भेद की पहचान की जा. श्रवण और vestibular रास्ते कार्यात्मक जल्दी भ्रूण में प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकते हैं, के रूप में संवेदी पैदा प्रतिक्रियाओं वर्तमान पहले सर्किट का गठन कर रहे हैं नहीं कर रहे हैं. केन्द्र पेश आठवीं तंत्रिका axons कुछ अध्ययनों में पता लगाया गया है, लेकिन श्रवण अक्षतंतु लेबलिंग अन्य आठवीं तंत्रिका 2,3 घटकों से लेबलिंग के साथ किया गया था. यहाँ, हम ध्वनिक नाड़ीग्रन्थि से चुनिंदा labe अग्रगामी पता लगाने के लिए एक विधि का वर्णनएल विकासशील आठवीं तंत्रिका भीतर श्रवण axons. सबसे पहले, एक लड़की 8 दिन oxygenated कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव में डूबे भ्रूण के पूर्वकाल मस्तक क्षेत्र के आंशिक विच्छेदन के बाद, कोकेलर नलिका संरचनात्मक स्थलों की पहचान की है. अगले, एक ठीक खींच लिया गिलास micropipette वाहिनी और आसन्न गहरी क्षेत्र में, जहां ध्वनिक नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं स्थित हैं में rhodamine dextran amine की एक छोटी राशि इंजेक्षन करने के लिए तैनात है. इंजेक्शन के बाद तीस मिनट के भीतर, श्रवण axons केन्द्र पश्चमस्तिष्क में पता लगाया जाता है और बाद में histologic तैयारी के बाद देखे जा सकते हैं. इस विधि केंद्रीय श्रवण सर्किट गठन परिधीय के विकास के अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है.
Protocol
1. निम्नलिखित विच्छेदन उपकरण और अभिकर्मकों तैयार
- कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (aCSF, 130 मिमी NaCl, 3 मिमी KCl, 1.2 मिमी KH 2 4 पीओ, 20 मिमी NaHCO 3, 3 मिमी HEPES, 10 मिमी ग्लूकोज, 2 मिमी CACL 2, 1.3 मिमी MgSO 4) लगातार 95% ओ के साथ संचार कमरे के तापमान पर 2/5% सीओ 2. जलसेक के लिए, 2/500 मिलीलीटर चौड़े मुंह एक ढक्कन में drilled छेद के साथ Nalgene जार 3 को भरने के लिए. टैंक टयूबिंग द्वारा एक गिलास स्टेम bubbler, जो जार ढक्कन में छेद के माध्यम से aCSF प्रवेश से जुड़ी होगी. बुलबुले कि तरल के / 3 1 के बारे में पहुंच है, लेकिन काफी सशक्त रिम पर splashing पैदा नहीं कर रहे हैं के एक निरंतर प्रवाह प्राप्त करने के दबाव को समायोजित करने के लिए. Nalgene जार करने के लिए एक दूसरे से और गैस प्रवाह अशांति से अलग व्यक्ति के नमूनों में डूब 5 मिलीलीटर कांच की शीशियों (6 तक). ACSF कम से कम 20 मिनट के लिए किसी भी ऊतक ऊष्मायन पहले oxygenated किया जाना चाहिए.
- लघु सिलिकॉन विच्छेदन (पकवान 35 मिमी x 10मिमी पेट्री Sylgard Elastomere किट दो विच्छेदन छोटे हेक्सागोनल polystyrene में रखा पिंस (47 मिमी नीचे) के साथ) का उपयोग कर लेपित नाव तौलना.
- दो ठीक टिप संदंश, एक संदंश घुमावदार टिप, एक 50 मिलीलीटर बीकर, और ऊतकों को बर्बाद करने के लिए एक कंटेनर.
- टिप में लगभग 20-50 खोलने सुक्ष्ममापी को तोड़ा और 6.25% के साथ समाधान में rhodamine dextran amine (RDA, = 3000 मेगावाट, Invitrogen) के साथ भरा गिलास (1.2 / 0.9 आयुध डिपो आईडी) micropipette खींचा 0.4% ट्राइटन पीबीएस में X-100 . ठीक टयूबिंग द्वारा संलग्न करने के लिए picospritzer और micromanipulator को स्थिर करने के लिए.
2. माइक्रो विच्छेदन 4,5 E8 आधारी papilla प्रकट करने के लिए
- घुमावदार संदंश के साथ, brainstem नीचे सिर्फ E8 भ्रूण में कटौती, सिर सीधे नाव तौलना भीतर सिलिकॉन लेपित विच्छेदन पकवान पर रखकर.
- विच्छेदन पिन का उपयोग कर, एक ventral दृश्य के साथ सिर की स्थिति तो ब्याज की तरफ कान थोड़ा दिखाई देता है, सिर थोड़ा पीछे की ओर झुका हुआ है और 10-30 डिग्री ce से दूर ओर इशारा करते हुएnter (2A चित्रा). तुरंत पिन के साथ सिर सुरक्षित. यदि द्विपक्षीय अनुरेखण वांछित है, तो केंद्र 0 डिग्री पर सिर, या एक पूर्ण उदर दृश्य दोनों पक्षों तक पहुँचा जा सकता है. इसी तरह, एक बाईं तरफा इंजेक्शन के लिए केंद्र से -10 में -30 डिग्री करने के लिए सिर सुरक्षित तो बाईं ओर पहुँचा जा सकता है.
- 50 मिलीलीटर बीकर का उपयोग, पकवान में oxygenated aCSF की 30 मिलीलीटर हस्तांतरण, पूरी तरह से ऊतक submerging.
- धीरे समझ और निचले जबड़े के नीचे ठीक टिप संदंश का उपयोग छील, तो ब्याज की तरफ निचले पलक हटाने.
- सहित किसी भी शेष तालू और नरेटी, overlying संवहनी ऊतक निकालें. ये कोमल ऊतकों दूर छील इसकी सतह पर विशिष्ट कशेरुका धमनियों के साथ उपास्थिकरोटि के विकास की चिकनी सतह का खुलासा करना चाहिए. इस बिंदु से, विशेषता सफेद otoconial जन दिखाई जानी चाहिए.
- बाहरी meatus, जबड़े संयुक्त की उपास्थि, और मध्य कान के चारों ओर ध्यान से त्वचा टुकड़े करना समय में छोड़नेनेर कान बरकरार. संदंश का प्रयोग धीरे दूर इन कार्टिलेजीनस संरचनाओं में कटौती.
- कशेरुका धमनियों और रक्त pooling ठीक संदंश सुझावों के साथ एक सज्जन व्यापक प्रस्ताव का उपयोग कर निकालें. रक्त दृश्य अस्पष्ट और की जमावट इंजेक्शन विंदुक खोलने प्लग कर सकते हैं कर सकते हैं.
- आसन्न संवेदी (आधारी papilla) उपकला और ध्वनिक नाड़ीग्रन्थि साथ कोकेलर नलिका सीधे 6 उपास्थिकरोटि नीचे स्थित है और एक लम्बी उंगली की तरह भीतरी कान से औदरीयता पूर्वकाल के पास बाहर का सबसे टिप (अपैक्स) के साथ, विस्तार प्रक्षेपण के रूप में देखे जा सकते हैं 5 midline. खून की एक छोटी पूलिंग (लाल) विच्छेदन और / या cochlear वाहिनी (चित्रा 2B) है कि दृश्य में सहायता कर सकते हैं शीर्ष पर otolithic calcifications (सफेद) से हो सकता है. सुप्रीम कम lagenar मैक्युला है, एक संवेदी पैच vestibular 7,8 समारोह की सोचा.
3. CN आठवीं श्रवण फाइबर के चुनिंदा लेबलिंग
- धीरे धीरे कम 1 पंचर कपाल micropipette. यह कपाल क्षेत्र के आसपास के क्षेत्रों की तुलना में पतली है और कम बल घुसना करने की आवश्यकता है. micropipette अब कोकेलर नलिका के अंदर होना चाहिए. वैकल्पिक: अनुरेखण डाई का एक छोटा सा इंजेक्शन यहाँ बनाया जा से आधारी papilla visualizing में सहायता कर सकते हैं.
- Micropipette repositioning के बिना, यह सिर्फ कोकेलर नलिका की गहरी सीमा उल्लंघनों (1 चित्रा) तक कम जारी है. एक इंजेक्शन यहाँ प्रदर्शन और आधारी papilla (आंकड़े 2C, 2 डी) की लंबाई के साथ कई क्षेत्रों में दोहराने के लिए, सबसे समीपस्थ टिप जहां vestibular lagena स्थित है को छोड़कर. Picospritzer 10-30 साई के बीच सेट के साथ, कई इंजेक्शन बना रहे हैं. इंजेक्शन डाई तरल पदार्थ की मात्रा को बदलता है, और वांछित लेबलिंग की सीमा पर निर्भर करता है. प्रत्येक इंजेक्शन एक फ्लोरोसेंट रंजक ला में परिणाम चाहिएलगभग 200 के beled जगह 400 सुक्ष्ममापी व्यास (चित्रा 2 डी).
- एक बार इंजेक्शन पूरा हो गया है, संदंश का उपयोग करने के लिए brainstem ऊपर नमूना आड़ा काट और एक हस्तांतरण विंदुक का उपयोग करने के लिए एक छोटे जार में aCSF के कंटेनर के भीतर लांगुलिय भाग लगातार 95% 2 हे / 5% सीओ 2 के साथ perfused किया जा रहा है जगह.
- प्रत्येक भ्रूण, वांछित केंद्रीय अनुरेखण की दूरी पर निर्भर करता है डाई हस्तांतरण के लिए 20-30 मिनट की अनुमति देते हैं.
- के ऊतक को हटाने और histological सेक्शनिंग के लिए तैयार है. यहां दिखाए गए उदाहरण में, ऊतक (1X पीबीएस में 4%) रातोंरात, 30% (1X पीबीएस में) रातोंरात sucrose paraformaldehyde में डूब जाता है.
4. Counterstaining और विश्लेषण
- Counterstaining पूरबी संरचनात्मक स्थान पर पर्यवेक्षक के रूप में अच्छी तरह के रूप में ब्याज की विशेष क्षेत्रों की पहचान में मदद करने के लिए उपयोगी है. इस तैयारी में एक प्रभावी counterstain neurofilament (1 आंकड़े, 3B, 3E) immunolabeling, जो दृढ़ता एलabels axons और CNS में axonal इलाकों के सीमांकन के लिए अनुमति देता है.
- विश्लेषण लेबल क्षेत्र भर में प्रदर्शन किया जाना चाहिए, क्योंकि अनुमानों rostrocaudal अक्ष के साथ कई सौ microns या अधिक का विस्तार कर सकते हैं. समय लक्ष्यीकरण त्रुटि दर, और / या प्रक्षेपण पैटर्न के विचलन में परिवर्तन: बुनियादी विश्लेषण के कुछ उदाहरण हैं. RDA लेबल axons उच्च संकल्प (आंकड़े 3A, 3 डी) के साथ परिधीय और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में कल्पना कर रहे हैं.
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Representative Results
आठवीं तंत्रिका और तंत्रिका खुद के शरीर रचना विज्ञान के घटकों के जटिल और जटिल (आंकड़े 1, 3) हैं. चुनिंदा ध्वनिक नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं से उत्पन्न होने वाले तंतुओं अनुरेखण, आठवीं रूप में के रूप में अच्छी तरह से तंत्रिका brainstem के भीतर प्राथमिक श्रवण afferents के क्षेत्रों सफाई से और पता लगाया जा सकता है उनके vestibular समकक्षों (2 आंकड़े, 3) से प्रतिष्ठित. इसी तरह, इस तकनीक ध्वनिक नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं का परिधीय अनुमानों (3 जी चित्रा) का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या व्यक्तिगत vestibular अंगों से उत्पन्न होने वाले अनुमानों का अध्ययन करने के लिए संशोधित. क्योंकि axons सफाई से अपनी पूरी लंबाई के साथ पता लगाया जाता है, सटीक मात्रात्मक विश्लेषण सटीक और प्रारंभिक innervation के समय पैटर्न सहित विकास के दौरान vestibular अनुमानों, लक्ष्यीकरण त्रुटि दर, आदि से श्रवण भेद किया जा सकता है इसके अतिरिक्त, श्रवण फाइबर लेबलिंग की पिछले दृष्टिकोण के विपरीत, प्रदर्शन इस दृष्टिकोण है कामकाजमेड गैर तय, ऊतक रहने पर है और इस तरह इन विट्रो प्रयोग में अन्य के लिए एक साथ इस्तेमाल किया जा सकता है.
हालांकि इस तकनीक E6-E9 से भ्रूण के लिए उपयुक्त है, सबसे अच्छा परिणाम E8 पर शुरू जब श्रवण axons उनके प्राथमिक केंद्रीय 3 लक्ष्य innervated है. इसके विपरीत, vestibular अनुमानों के पहले 9,10 brainstem में आने और पहले पता लगाने के लिए बेहतर उम्मीदवार के रूप में इस तरह की सेवा करेंगे, हालांकि तकनीकी रूप से छोटे आकार और इस उम्र में वेस्टिब्युलर तंत्र के सापेक्ष अपरिपक्वता की वजह से चुनौती दे. Histological वर्गों डाई इंजेक्शन के स्थान की पुष्टि करने के लिए, शिखर सबसे आधारी papilla के क्षेत्र के रूप में एक छोटे से संवेदी vestibular समारोह हो सकता है और यदि लेबल संभावित परिणाम दूषित सकता सोचा पैच शामिल करने के लिए जांच की जानी चाहिए.
एक बार अन्वेषक शारीरिक रचना के साथ परिचित है, सबसे अधिक सामना करना पड़ा समस्याओं के तीन प्रकार के रूप में कर रहे हैं:
- कर्णावत duसीटी डाई अनुरेखण के साथ भरा है, लेकिन नाड़ीग्रन्थि सेल axons लेबल नहीं हैं. इस समस्या की संभावना इंगित करता है कि इंजेक्शन कोकेलर नलिका, जहां नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं और तंत्रिका तंतुओं रहते गहरी नहीं प्रदर्शन किया गया था. इस समस्या को सुनिश्चित करना है कि इंजेक्शन micropipette 1 उपास्थिकरोटि punctures, फिर धीरे से वाहिनी के दूसरे पक्ष के माध्यम से सिर्फ पंचर इतनी उन्नत द्वारा सुधारा जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, इंजेक्शन विंदुक सही ढंग से किया गया है तैनात हो सकता है, लेकिन रंग की अपर्याप्त मात्रा दिया. इंजेक्शन या इंजेक्शन के दबाव संख्या बढ़ाने से भी इस मुद्दे को दूर कर सकते हैं.
- तंत्रिका को अनजाने में अत्यधिक विच्छेदन के दौरान कार्टिलेजीनस भूलभुलैया पर खींच के परिणाम के रूप में transected है. इस कठिनाई ठीक विच्छेदन तकनीक और मध्य कान की सीमित विच्छेदन का उपयोग करके बचा जा सकता है.
- इंजेक्शन बहुत व्यापक है और अनजाने में अन्य संवेदी नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं या अन्य तंत्रिका घटकों से उत्पन्न होने वाली तंतुओं लेबल. गुसमस्या इंजेक्शन प्रोटोकॉल अनुकूलन के द्वारा कम से कम किया जा सकता है, और इंजेक्शन दबाव या दालों की संख्या को कम करने की आवश्यकता हो सकती है, या इंजेक्शन के स्थान बदलता.
संभावित विश्लेषण के दो उदाहरण हैं:
- प्रक्षेपण पैटर्न के विचलन: एक विशेष अक्ष के साथ लेबल axons और कैसे वे निम्नलिखित प्रयोग प्रभावित किया जा सकता है की हद तक निर्धारित करता है. Rostrocaudal विचलन के रूप में वर्णित किया जा सकता है:
(संख्या वर्गों लेबल axons युक्त) x (प्रत्येक अनुभाग की मोटाई) आधारी papilla के अनुपात के रूप में डाई लेबल की हद तक के लिए इस उपाय को सही किया जा सकता है, या ऊतक में counterstained, आठवीं तंत्रिका axons लेबल के अनुपात के लिए. यह स्थलाकृतिक अनुमानों का विश्लेषण, के रूप में लेबल axons सफाई से उनके पश्चमस्तिष्क में टर्मिनल क्षेत्रों से पता लगाया जा सकता है के लिए एक उपयोगी उपकरण है. Tonotopy की माप के लिए, डाई इंजेक्शन बस साथ हित के क्षेत्र के लिए सीमित किया जाना चाहिएilar papilla.
- त्रुटियों का लक्ष्य निर्धारण: विश्लेषण ऊतक के हर पूर्व निर्धारित क्षेत्र (अनुभाग प्रति भ्रूण, आदि के प्रति हो सकता है, कर सकते हैं) के लिए mistargeted axons की आवृत्ति निर्धारित करता है. Perturbations axons में एक असामान्य प्रक्षेपण पथ के बाद या एक अनुचित क्षेत्र में समाप्त हो सकता है. जब त्रुटियों बढ़ाता संख्या भ्रूण के बीच इंजेक्शन मात्रा में अंतर के लिए खाते में सामान्यीकृत किया जाना चाहिए. छोटे इंजेक्शन अधिक एकल axons स्कोर करने की क्षमता में परिणाम की संभावना है. एक बुनियादी लक्ष्य त्रुटि विश्लेषण के रूप में वर्णित किया जा सकता है:
चित्रा 1. साथ सरलीकरण के लिए E6 brainstem के कोरोनल दृश्यद्विपक्षीय ध्वनिक बरकरार ganglia Schematized लाल विंदुक. सही दिखाता है एक dorsolateral प्रवेश बिंदु से ध्वनिक नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं का लक्षित. धारा विरोधी neurofilament के साथ immunolabeled हैं axonal अनुमानों पर प्रकाश डाला. Vestibular अंगों दिखाया वर्गों को विजय - स्तम्भ हैं. चयनात्मक श्रवण फाइबर के लिए RDA इंजेक्शन के क्षेत्र लाल विंदुक चित्रण के साथ प्रदर्शन की अनुरेखण. आठवीं = vestibulocochlear तंत्रिका, एजी = ध्वनिक नाड़ीग्रन्थि, VG = vestibular नाड़ीग्रन्थि. पृष्ठीय है. पैमाने बार = 300 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 2. Microdissection और लक्ष्य क्षेत्र के इंजेक्शन (ए) विच्छेदन पकवान पर भ्रूण की उपयुक्त स्थिति, पीछे की ओर झुका हुआ सिर के साथ उदर दृश्य और पक्ष को थोड़ा बदल गया सही पक्ष को बेहतर उपयोग की अनुमति. को राइट ईगिरफ्तारी दिखाया जाता है और अंतर्निहित आधारी papilla एक टकराया लाइन के साथ संकेत दिया है. Arrowhead में (ए) और (बी) विंदुक प्रविष्टि (ख) निम्नलिखित विच्छेदन की प्रारंभिक स्थिति को दिखाता है, एक सफेद otoconial जन दिखाई देता है, आधारी papilla (तीर) के शिखर सीमा Demarcating (सी, डी) पहले इंजेक्शन एक प्रदान करना चाहिए कोकेलर नलिका की रूपरेखा (डी) बाद इंजेक्शन सिर्फ कोकेलर नलिका ध्वनिक नाड़ीग्रन्थि क्षेत्र में और आधारी papilla गहरा बनाया जाना चाहिए. RDA प्रतिदीप्ति बढ़ाने के इंजेक्शन गहराई धारणा में उपयोगी है और लगभग 200 के प्रत्येक व्यक्ति इंजेक्शन एक फ्लोरोसेंट रंजक लेबल जगह बनाने चाहिए - 400 सुक्ष्ममापी व्यास के रूप में यहाँ देखा. पैमाने बार = 2 मिमी.
एफ3 igure. चयनात्मक श्रवण एक E8 भ्रूण में अनुरेखण फाइबर के प्रतिनिधि (एसी) कम बिजली और (डीजी) उच्च शक्ति छवियों 25 सुक्ष्ममापी राज्याभिषेक विभिन्न विमानों में एक ही भ्रूण से एकत्र वर्गों (ए) RDA लेबल axons इंजेक्शन साइट (arrowhead से पता लगाया जा सकता है. ), कपाल तंत्रिका (तीर) के माध्यम से और दुमदारी से प्राथमिक श्रवण नाभिक लक्ष्यों (डबल arrowhead) की ओर विरोधी neurofilament एंटीबॉडी के साथ प्रकाश डाला Immunolabeling (बी) सभी axonal अनुमानों और () से फाइबर RDA का पता लगाया श्रवण प्रक्षेपण के भीतर हैं मार्ग. अलग ओवरले (ए) और (बी) एक रंग के रूप में दिखाया चैनलों (सी) (लोमो) एक अधिक लांगुलिय स्थिति में एक ही भ्रूण के उच्च शक्ति छवि को दर्शाता है (ए) तंत्रिका प्रवेश बिंदु पर फाइबर की उच्च संकल्प (विलय ) तीर और केंद्रीय मार्ग के साथ (डबल arrowhead) (ई) </> सभी axons की दाग neurofilament मजबूत पीएन सीएनएस के सीमांकन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से vestibular अनुमानों बनाम ख्यात श्रवण की अनुमति देता है. एपी और उपाध्यक्ष संबंधित श्रवण और vestibular तंत्रिका प्रवेश बिंदु परिधीय उपकरणों से संकेत मिलता है, जबकि एसी और कुलपति संबंधित श्रवण और vestibular तंत्रिका प्रवेश बिंदु केंद्रीय अनुमानों से संकेत मिलता है. अलग ओवरले (डी) और (ई) एक रंग के रूप में दिखाया चैनलों में विलय (एफ) (G) ध्वनिक नाड़ीग्रन्थि के histologic परीक्षा लेबल ध्वनिक नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के स्थान (में दिखाया गया है (वायुसेना) अनुरेखण और उनके परिधीय अनुमानों से पता चलता है तारांकन) प्रतिगमनपूर्वक आधारी papilla पता लगाया जाता है () एच एक 700 सुक्ष्ममापी अनुरेखण मार्ग का चित्रण E8 श्रवण विशिष्ट आठवीं लेबलिंग की उम्मीद के साथ. इंजेक्शन साइट (लाल वृत्त) तंत्रिका प्रवेश बिंदु दुम का है, और केंद्रीय अनुमानों व्याख्यान चबूतरे वाला और पश्चमस्तिष्क में दुमदारी से एक बार यात्रा. वी.पी. = परिधीय बनियानibular, एपी = परिधीय श्रवण, कुलपति = केंद्रीय vestibular, एसी = केंद्रीय श्रवण, एजी = ध्वनिक नाड़ीग्रन्थि, बी.पी. = आधारी papilla, एलएम = lagenar मैक्युला, एसवीजी = बेहतर vestibular नाड़ीग्रन्थि, = अवर vestibular नाड़ीग्रन्थि IVG. पैमाने बार = एसी के लिए 300 मीटर, 100 सुक्ष्ममापी DF के लिए, जी और एच में 500 सुक्ष्ममापी में 100 सुक्ष्ममापी.
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Discussion
आठवीं तंत्रिका के प्रारंभिक विकास के अध्ययन भ्रूण कई अलग ganglia से उत्पन्न होने वाले axons की पहचान करने में कठिनाई की वजह से भाग में सीमित किया गया है. कई अध्ययनों से आणविक जल्दी विकास के दौरान श्रवण और vestibular संवेदी सेल और नाड़ीग्रन्थि सेल भाग्य का मार्गदर्शन संकेतों, 5,11,12 का पता लगाया है, लेकिन अभी तक केंद्रीय innervation विनियमन प्रक्रियाओं तक निर्धारित किया जाना है. ध्वनिक नाड़ीग्रन्थि सेल अनुमानों की रिपोर्ट को आम तौर पर संवेदी 13-15 उपकला परिधीय प्रक्रियाओं का वर्णन है, जबकि कम से कम केंद्रीय प्राथमिक नाभिक को पेश करने की प्रक्रिया के बारे में जाना जाता है. Embryogenesis दौरान केन्द्र पेश आठवीं subdivisions के अध्ययन electrophysiological अक्सर होते हैं, लेकिन एक स्तनधारी ऊतक 17 टुकड़ा में भ्रूण लड़की 16 या कैल्शियम इमेजिंग पश्चमस्तिष्क में ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग के रूप में नहीं किया जा सकता तंत्रिका सर्किट का पूरा करने के लिए पहले. प्रतिरक्षाविज्ञानी मार्करों के लेबल के लिए उपयोगलड़की आठवीं तंत्रिका में श्रवण axons वर्तमान में संभव नहीं है. प्रतिलेखन कारकों के अलग समूहों की पहचान की गई है कि vestibular 18-23 न्यूरॉन्स बनाम श्रवण के साथ सहसंबंधी, इन कारकों की अभिव्यक्ति axons से बाहर रखा गया है. चूहों में, मतभेद सर्पिल ganglia और जीन अभिव्यक्ति में vestibular ganglia सहित कुछ होनहार उम्मीदवारों कि तौर तरीकों के बीच अक्षतंतु विकास अंतर 23 जीन इन उत्पादों के आगे के अध्ययन के दोनों स्तनधारी और एवियन अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण उपकरणों की उपज हो सकती है. सकता, के बीच पाया गया है. तरीके यहाँ वर्णित, एक बरकरार श्रवण सर्किट के साथ भ्रूण ऊतक में रहने वाले श्रवण फाइबर चुनिंदा उनके केंद्रीय लक्ष्य को पता लगाया जा सकता है.
चिकन भ्रूण विकासात्मक जीव के लिए एक विशेष रूप से उपयोगी हड्डीवाला प्रणाली और स्तनधारी प्रणालियों में पाया सीमाओं के कुछ पर काबू पाने में सक्षम है. जल्दी भीतरी कान patterning और morphogenesis का विनियमनपक्षियों 1,12 स्तनधारियों के लिए उल्लेखनीय समानता से पता चलता है, जबकि लड़की भ्रूण बड़ा और कृंतक भ्रूण की तुलना में अधिक आसानी से सुलभ प्रारंभिक अवस्था में जब परिधीय श्रवण प्रणाली का गठन किया जा रहा है. श्रवण फाइबर के चुनिंदा अनुरेखण के लिए यहाँ प्रस्तुत पद्धति विकासशील भीतरी कान के केंद्रीय अनुमानों पर जल्दी प्रयोग की सुविधा है.
हम एक के लिए विभिन्न प्रकार से आठवीं तंत्रिका के केंद्रीय श्रवण अनुमानों की पहचान के प्रयास में इस प्रोटोकॉल विकसित की है, लेकिन इसी तरह यह करने के लिए चुनिंदा भीतरी कान की अन्य संवेदी अंगों से तंतुओं लेबल के लिए संशोधित किया जा सकता है. पहले वर्णित विधियों के विपरीत, इस प्रक्रिया पूरे बरकरार सर्किट के साथ जीवित ऊतक पर किया जाता है. एक समान प्रदर्शन विधि एवियन embryogenesis दौरान आठवीं श्रवण अभिवाही innervation के समय का वर्णन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, लेकिन, vestibular फाइबर भी अनजाने थे लेबल 3 यहाँ हम एक तरीका प्रदान करने के लिए स्पष्ट रूप से क्षेत्र की पहचान या.का चयन करें igin और समाप्ति, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उच्च फाइबर एकल संकल्प हड्डीवाला embryogenesis दौरान श्रवण afferents केन्द्र पेश.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा कर रहे हैं.
Acknowledgments
लेखकों के लिए सुझाव और इमेजिंग तकनीक और डॉ. डोरिस वू के साथ सहायता के लिए डा. Candace Hsieh जल्दी embryogenesis दौरान धन्यवाद लड़की भीतरी कान शरीर रचना विज्ञान पर विशेषज्ञता के लिए कामना करता हूं. यह काम IOS-0642346 NSF T32 - DC010775 एनआईएच, एनआईएच T32 GM008620, R01 DC010796 NIH, और डो P200A120165 GAANN द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene Weigh Dish | Fisher Scientific | 02-202-101 | |
| Petri Dish, 35 X 10 mm | Fisher Scientific | 50820644 | Use to make silicone dissection dish |
| Sylgard Silicone Elastomer Kit | World Precision Instruments | SYLG184 | Coat Petri to make dissection dish |
| Dissection Pins | Various | Holds embryo in place during dissection | |
| NaCL | Various | part of aCSF recipe | |
| KCl | Various | part of aCSF recipe | |
| KH2PO4 | Various | part of aCSF recipe | |
| NaHCO3 | Various | part of aCSF recipe | |
| Glucose | Various | part of aCSF recipe | |
| CaCl2 | Various | part of aCSF recipe | |
| MgSO4 | Various | part of aCSF recipe | |
| Container for aCSF. Suggest translucent wide-mouth Nalgene jar, 500 ml (16 oz) with lid. | CPLabSafety | QP-PLC-03717 | Drill hole opening in top of lid for glass bubling stem to penetrate liquid |
| Empty 5 ml glass vial or comparable transparent vial | American Pharmaceutical Partners, Inc | 6332300105 | Use during aCSF incubation to keep samples separate from each other and from the bubbling stream |
| Tank of carbogen (95%O2 / 5%CO2) connected by tubing to bubbler | Various | Attach by tubing to glass stem bubbler for infusion into aCSF | |
| Glass stem bubbler | Various | To infuse carbogen into aCSF | |
| Curved-tip forceps | World Precision Instruments | 501008 | To remove embryo head from egg |
| Two fine-tip forceps | World Precision Instruments | 501985 | For micro-dissection |
| 50 ml Beaker | various | ||
| Rhodamine Dextran Amine (RDA) | Invitrogen | various | Fluorescent axon tracer |
| Triton X-100 | ICN Biomedicals | ||
| Phosphate Buffered Saline, (1X PBS) | Various | Standard lab reagent | |
| Thin Wall Glass Capillaries, 1.2 OD, .9 ID 4" (100 mm) length | World Precision Instruments | TW120F-4 | Load with RDA. Each capillary makes two glass micropipettes |
| Needle / Pipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | Settings used: Heat 16.4, Solenoid 2.2 |
| Picospritzer | Parker Instrumentation | various | Attach by fine tubing to glass micropipette |
| Micromanipulator | Narishige | various | |
| Dissection microscope with fluorescence | Various | ||
| 4% Paraformaldehyde | Various | Standard lab reagent | |
| anti-Neurofilament antibody, optional | Millipore | AB1991 | Follow histological protocol recommended by manufacturer |
| Cryostat and associated materials for sectioning | Leica | various | |
| Epifluorescent microscope for imaging | Zeiss, various |
References
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