Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Langsigtet undertrykkelse af Intersectin-1s i muselunger ved Gentagen leveringen af ​​en specifik siRNA via kationiske liposomer. Evaluering af Knockdown Effects ved elektronmikroskopi

Published: June 21, 2013 doi: 10.3791/50316
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,2
1Department of Pharmacology, Rush University, 2Pulmonary and Critical Care Department, Rush University
* These authors contributed equally

Summary

Gentagne retro-orbital injektioner af kationiske liposomes/siRNA/ITSN-1s komplekser i mus, hver 72. time i 24 dage effektivt levere siRNA dupleks til muselunge mikrovaskulatur reducere ITSN-1s-mRNA og protein ekspression ved 75%. Denne teknik er meget reproducerbar i en dyremodel, har ingen bivirkninger og undgår dødsfald.

Abstract

Tidligere undersøgelser har vist, at knockdown af ITSN-1s (KD ITSN), en endocytisk protein involveret i reguleringen af lunge vaskulær permeabilitet og endotelceller (EC'er) overlevelse, induceret apoptotisk celledød, en væsentlig hindring for udviklingen af en cellekultur-system med forlænget ITSN-1s hæmning 1.. Brug kationiske liposomer som bærere, vi udforskede undertrykkelse af ITSN-1s-genet i mus lunger ved systemisk administration af siRNA rettet ITSN-1-genet (siRNA ITSN). Kationiske liposomer har flere fordele for siRNA levering: sikker med gentagen dosering, immunogent, ikke-toksisk, og let at fremstille 2. Liposomer ydeevne og biologisk aktivitet afhænge af deres størrelse, ladning, lipid sammensætning, stabilitet dosis og administrationsvej 3 Her, effektiv og specifik KD ITSN i muselunger er opnået ved hjælp af en kolesterol og dimethyl dioctadecyl ammoniumbromid kombination. Intravenøs leveringaf siRNA ITSN / kationiske liposomkomplekser forbigående bankede ned ITSN-1s protein og mRNA i muselunger på dag 3, som inddrives efter yderligere 3 dage. Drage fordel af de kationiske liposomer som en gentagelig sikker bærer, undersøgelsen forlænges med 24 dage. Således blev retroorbitale behandling med frisk genererede komplekser administreret hver 3. dag, overtalelse vedvarende KD ITSN hele undersøgelsen 4.. Musevæv indsamlet på flere tidspunkter efter-siRNA ITSN blev underkastet elektronmikroskopi (EM) analyser for at vurdere virkningerne af kronisk KD ITSN, i lunge endotel. Høj opløsning EM imaging tilladt os at vurdere de morfologiske ændringer forårsaget af KDITSN i lungerne vaskulære seng (dvs. afbrydelse af endotel barriere, nedsat antal af caveolae og opregulering af alternative transportveje) egenskaber ikke-påviselige ved lysmikroskopi. Samlet disse fund etableret en vigtigtig rolle ITSN-1s i ECS funktion og lunge homeostase, mens illustrerer effektiviteten af siRNA-liposomer levering in vivo.

Introduction

Naked siRNA kan ikke trænge ind i cellemembranen, er negativt ladede og det er let nedbrydes af enzymer i blod, væv og celler. Selv med nylig strukturelle ændringer for at forbedre stabiliteten, er siRNA ophobning på målet stedet efter administration ekstremt lave og kræver en effektiv intracellulær køretøj 5.. Kationiske liposomer opstod som sikre nukleinsyrer bærere med potentiale til at overføre store stykker DNA / RNA i celler ved at indkapsle og beskytte nukleinsyrer fra enzymatisk nedbrydning 6.. Også kationiske liposomer spontant interagerer med DNA / RNA, således at fremme genoverførsel til cellerne 2. For nylig liposomer er blevet anvendt til at levere vacciner og lav molekylær vægt narkotika 7. Liposomal levering af microRNA-7-udtrykkende plasmid overvinder epidermal vækstfaktor receptor tyrosinkinase inhibitor-resistens i lungecancerceller 8. Når målrettevaskulære endotel, intravenøs levering er afgørende, fordi komplekserne er usandsynligt at krydse endotel barriere og ekstravasere ind i interstitium 9.. Ved sammenligning med andre organer, ECS fra mikrovaskulaturen af lungen har den største optagelse og ivrigt internalisere kationisk liposom og DNA / RNA-komplekser, efterfulgt af lymfeknuder og Peyers patches 9. Intravenøs levering i gnavermodeller for siRNA via retro-orbital eller haleveneinjektioner er bevist uskadelige selv i høje koncentrationer, såsom 50 mg / kg 10. I den offentliggjorte litteratur sammensætningen af kationiske liposomer adskiller baseret på lipider formulering og deres ækvimolært forhold 11, 12. Der er en bred vifte af mulige applikationer ved hjælp af kationiske liposomer til genadministration in vivo, hvorvidt målrettet down-regulation/over-expression af proteinerne, levering af vacciner eller anti-tumor terapier 13-15. Vigtigt at huskeer, at effektiviteten af ​​DNA / RNA-cellulære membran vekselvirkning reguleres af formen kobling mellem genererede komplekser og membranlipider. Dette tyder på, at skræddersy lipider sammensætning til målrettede cellulære membran profiler kan være gavnligt og resultere i høje transfektion i en bestemt celletype 6..

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Kationiske liposomer Forberedelse

  1. Autoklavér en ren rundbundet kolbe, der skal anvendes til lipososmes forberedelse.
  2. Forbered stamopløsninger:
    1. - Opløs 200 mg dimethyl dioctadecyl ammonium bromid (DOAB) i 10 ml chloroform ved hjælp af en lille glasflaske.
    2. - Opløs 200 mg kolesterol i 10 ml chloroform ved hjælp af en lille glasflaske.
    3. - Udarbejdelse og autoklaveres at sterilisere 5% glucose i 100 ml af RNA / DNA-ase fri destilleret vand.
  3. Skyl rundbundet kolbe med chloroform. Tilføj 5-10 ml til kolben, hvirvel, og lad det sidde i nogle minutter. Kolben dækket med aluminiumsfolie på alle tidspunkter. Tøm chloroform fra kolben.
  4. Fremstilling af liposomer:
    1. - Tilføj 315 ul DOAB stamopløsning til rundbundet kolbe.
    2. - Tilsæt 200 pi af kolesterol stamopløsning til kolben.
    3. - Tilføj 9,5 ml chloroform til kolben ennd mix af hvirvel.
  5. Indstil rotationsfordamperen ved 37 ° C, 100 omdrejninger i minuttet (rpm) eller mere (100-120 rpm). Rotationsfordamperen skal tilsluttes en vand-pumpe vakuum kontrol med et sugerør monteret korrekt.
  6. Slut argon gas tank og rotavapor.
  7. Fastgør kolben med rotavapor og justere de optimale indstillinger før sænkning det i vandbad. Åbn den første ventil for argon helt ved at dreje den mod uret. Altid åbne og lukke denne ventil først. Den anden ventil styrer argontryk blæser ind i kolben. Trykket skal altid være blid.
  8. Sænk rotavapor i vandbadet, nok til kolben for at røre vandet uden at være helt neddykket og tænd for hastigheden.
  9. Vent indtil alle kloroform fordamper, omkring 10 min. Derefter stoppe maskinen.
  10. Sluk rotavapor hastighed og argon tankventiler. Nu kolben bør fjernes.
  11. Tilsæt 2 ml 5% glucose til the kolbe at opløse lipiderne.
  12. Ridse bunden af ​​kolben grundigt med 1 ml pipettespids at opløse alle lipider. Efter ridser, fjerne enhver resterende lipid fra 1 ml spidsen ind i kolben, hvis det er nødvendigt, med en anden spids.
  13. Inkuber den opnåede opløsning i 42 ° C vandbad mens langsomt vortex (15 rpm) i kolben.
  14. Fyld ultralydsapparat kar med koldt vand. Sonikeres opløsning i mindst 20-30 minutter med kolben holdt op og bunden lige knap rører vandet.
  15. Kolben opvarmes i rotationsfordamperen s vandbad i 20 minutter ved 42 ° C ved hastigheden nul med rund bund nedsænket i vand, denne gang.
  16. Filtreres liposomer gennem en 0,47 mikron, og efterfølgende 0,22 micron sprøjtefiltre.
  17. Ved hjælp af en lille ekstruder, liposomerne filtrere gennem en 50 nm membran til at generere en homogen population af unilamellare liposomvesikler.
  18. Overfør liposomer til et Eppendorf-rør og placere den på is.

2.. Forbered Liposomer: siRNA-ITSN-1 Komplekser

  1. Resuspender on target mus siRNA ITSN i siRNA puffer indeholdende 20 mM HEPES og 150 mM natriumchlorid, pH 7,4, til en slutkoncentration på 2 ug / ul. Hold det på is før blanding.
  2. Forbered liposomerne: siRNA ITSN komplekser i et forhold på 8 nmol liposomer: 2 ug RNA (eller 400 nmol liposomer: 100 ug siRNA ITSN). I den foreliggende undersøgelse har vi tilføjet 50 pi siRNA ITSN fra stamopløsningen (50 uM) til 100 pi af frisklavet liposomer ved hjælp af en RNA / DNA-ase fri Eppendorf-rør. Bemærk, at koncentrationen af siRNA ITSN er meget vigtigt, fordi et maksimum af 150 pi af blandingen kan være bilateralt og retroorbital injicerede i mus på én gang.
  3. Hold blandingen på is, mens man venter at injicere musene.

3.. Mus retroorbitale Vein Injection (Internal Vinkel øjenhulen)

jove_content "> Alle mus eksperimenter blev godkendt og udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra Rush University Institutional Animal Care og brug Udvalg.

  1. Anesthetize mus ved intraperitoneal injektion af en 50 mg / kg legemsvægt ketamin og 5 mg / kg legemsvægt xylazin (kommercielt tilgængelig blanding). Afhængigt af dyrets vægt og alder, bedøvelsesmidler volumen og koncentration justere. Musene i undersøgelsen anvendte mus er CD1 hanmus, 6-8 uger gamle og vejer omkring 25 gram. Sprøjterne er tuberkulin 1 ml type med nålen vedlagt.
  2. Hold musen ører med den ene hånd og drej musen ned på en side for at udsætte det indre vinkel af øjet. Sigt medialt til plica semilunaris, undgå at røre øjeæblet.
  3. Approach lacrimal caruncle i øjet holde sprøjten indeholdende blandingen i en 45 graders vinkel i alle tre akser.
  4. Injicer langsomt blandingen og lad musen for at komme til den indsprøjtede opad. Hvis et stort likvidtdråbe formularer på nålen indsættelse sted, trække nålen, suge tilbage dråben i sprøjten, og prøv igen. Gentagne injektioner er bedst gøres ved skiftevis øjnene, at tillade perfekt opsving. Hvis usikker, kan denne teknik kontrolleres ved injektion blåt farvestof (50 ul, 0,5% krystalviolet i methanol) og udsætte muselunger at observere den blå vaskulatur.
  5. Musene i denne undersøgelse blev injiceret hver 3. dag i 3 uger uden dødsfald eller bivirkningerne.

4.. Mus Lung perfusion og Tissue Collection Biokemiske Studies

  1. Indstil den peristaltiske pumpe til at køre ved 1,5 ml / min.
  2. Forbered indstilling: ventilatoren operationsbordet, instrumenter, sterile vatpinde, q-tips, strygere, bægre, destilleret vand, Hanks balanceret salt, sporstof.
  3. Anesthetize mus ved intraperitoneal injektion af bedøvelsesmiddel blanding (100 mg / kg legemsvægt ketamin og 10 mg / kg legemsvægt xylazin). På halsen niveau, fjern spytkirtler og eksponere luftrøret.
  4. Start med laparotomi, punktafgifter mellemgulvet, og følg med torakotomi, udsætter lungerne og hjertet.
  5. Fjern thymus.
  6. Brug af lysmikroskopi for bedre nøjagtighed, kateteriserer lungepulsåren.
  7. Gør trakeostomi og intubere musen vha. tracheostoma. Indstil ventilatoren til en hastighed på 150 slag / min og slaglængde volumen på 150 ul.
  8. Som stikkontakten, åbne venstre atrium.
  9. Perfundere musen lunge vaskulaturen uden blod i 5 minutter, ved hjælp af peristaltiske pumpe og Hanks opløsning opvarmes ved 37 ° C.
  10. Perfundere sporstof (8 nm guld-albumin 16) for yderligere 10 minutter ved den samme flow.
  11. Skyl den ubundne sporstof med 5 min lunge perfusion med Hanks opløsning.
  12. Følg med in situ fiksering af lungerne med 10 min perfusion af 4% (vægt / vol) formaldehyd, 2,5% glutaraldehyd og 1% garvesyre i 0,1 PIPESpuffer, pH 7,2.
  13. Saml lungerne, fjerne den overdrevne væv, skære små blokke (3/3 mm), og læg dem i en mærket scintillationsglas indeholdende 2 ml fixativ blanding.

Musene udløber fuldt bedøvet under proceduren.

5.. Mus Lung vævsbehandling for EM

  1. Forbered stamopløsninger: 1% Palade Oso 4, acetat veronal og Kellenberger buffer.
    1. - 1% Palade-oso 4 puffer indeholder: 1 ml acetat veronal lager, 1,25 ml 4% oso 4, 1 ml 0,1 N saltsyre, og destilleret vand op til 5 ml slutvolumen.
    2. - Acetate veronal stamopløsning fremstilles ved at opløse 1,15 g natriumacetat andydrous og 2,94 g barbital i 100 ml destilleret vand.
    3. -Kellenberger opløsning indeholder 2 ml acetat veronal bestand, 2,8 ml 0,1 N saltsyre, 0,05 g uranylacetat, og 5,1 mldestilleret vand, pH = 6.
  2. Vask lung blokke i 0,1 M natriumcacodylatbuffer, pH = 7,4, kortvarigt 3 gange.
  3. Fastgør enheder i 4% (vægt / vol) formaldehyd, 2,5% glutaraldehyd i 0,1 PIPES-puffer, pH 7,2, i 1 time ved stuetemperatur.
  4. Post-fix med 1% Palade-osmium i 1 time i hætten, på is i mørke.
  5. Skyl gang med Kellenberger puffer.
  6. Inkuber prøver i Kellenberger puffer i 2 timer til natten over ved stuetemperatur.
  7. Skyl gang i 50% ethanol.
  8. Dehydrer med gradueret serie af ethanol, 5 min / hver: 70%, 95%, derefter 2 x 15 min 100% ethanol.
  9. Skifte til 100% propylenoxid, 2 x 15 min.
  10. Fjern propylenoxid og tilføje en blanding af 50% propylenoxid og 50% Epon 812, inkuberes natten, roterer på et hjul, ved stuetemperatur.
  11. Næste morgen, fjerne blandingen og tilsæt frisk Epon 812, i det mindste for 4-5 hr på hjulet.
  12. Brug fordoblet koniske forme, fyldthalvvejs med frisk 100% Epon 812, tilsættes udvalgte prøver og placere dem på kanterne.
  13. Flyt formene til inkubatoren sæt ved 60 ° C og lade dem hærde i 48-72 timer.
  14. Når polymeriseret, sende blokkene til at være tynd (60-70 nm tyk) sektioneret.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ITSN-1s protein og mRNA-niveauer blev overvåget ved flere tidspunkter efter siRNA ITSN levering ved Western blot og konventionelle og kvantitativ PCR som i 4.. ITSN-1s protein og mRNA niveauer i siRNA ITSN-behandlede muselunger var omkring 75% lavere i forhold til kontrol under kontinuerlig knockdown af ITSN-1s i 21 dage. Uden ITSN-1s, dynamin-2 er en vigtig interagerende partner ITSN-1s og afgørende spiller i frigørelse af caveolae fra plasmamembranen ikke effektivt rekrutteret til den endocytiske stedet og derved, caveolae løsrivelse fra plasmamembranen og dannelse af frie vesikulær luftfartsselskaber er forstyrret 1. 17.. Derfor ineffektiv membran fission og nedsat dannelse af frie vesikulære bærere forårsagede mangelfuld endocytose og transendotele transport, afbrydelse af indbyrdes endotel barriere og lungeødem (figur 1). Desuden nedregulering af ITSN-1s opreguleret alternative transport veje for at kompensere for mangelfuld endocytose. Vi har bemærket hindeagtige ringe (figur 2A og 2A1), polymorfe tubuli (figur 2B), og forstørrede endosomer fusioneret med typiske caveolae (Figur 2C) aktivt involveret i optagelse og transport guld-albumin. En væsentlig konstatering er faldet i caveolae nummer i ITSN-1s mangelfuld muselunge endotel med henvisning til kontrol, tabel 1.. Langvarig ITSN-1s hæmning for 24 dage ved at gentagen levering af kationiske liposomer / siRNA ITSN reducerede lungeødem i mus ved delvist at genoprette den inter-endotel barriere integritet. EM morfologiske undersøgelser viste, at 8nm guld albumin sporstof ikke kunne trænge ind i inter-endotel kryds på nuværende tidspunkt. I stedet dannede de filtration rester i den luminale introit af krydset (figur 3). Men perivaskulære rum viste nogle dilatation og mildødem, hvilket tyder på, at junctions er uigennemtrængelige for denne størrelse af partiklerne, men stadig utæt. Også de morfologiske mellemprodukter med alternative endocytiske veje er aktiv og til stede i højere tal. Mærkbart, de morfometriske analyser indikerede, at antallet af membranøs ring / tubuli mærket ved guld-albumin partikler steg med 14 gange i ITSN-1s kronisk mangelfuld muselunge endotel sammenlignet med kontroller, tabel 1.. Caveolae nummer er delvist genoprettet, kun 17,8% fald, med henvisning til kontrol. Således er vores resultater viser, at gentagen levering af kationiske liposomer / siRNA ITSN komplekser er en egnet metodologi for at studere virkningerne af langvarig protein knockdown in vivo.

Figur 1
Figur 1. Repræsentative elektronmikrofotografier viser åbne interendothelial vejkryds (IEJs) mærket throughout deres længde med 8 nm guld-albumin partikler. Arrowhead i A og forstørret a1, peger på 3-4 guld-albumin partikler placeret tæt på hinanden i samme plan, indikative af den brede åbning af IEJ. Guldpartikler er også forbundet med den abluminale afgangen fra IEJs (A, B - pile). Bemærk også det begrænsede antal caveolae og dilatation af perikapillær rummet pcs, asterisker). Barer: 200 nm (A), 100 nm (B, a1).

Figur 2
Figur 2. Akut forstyrrelse af ITSN-1s udtryk inducerer pleomorfe endocytiske / transcytotic mellemprodukter. Repræsentant EM billeder af hindeagtige ringe (A, a1), rørformede elementer (B, pile) og udvidede endosomer (C, pilespidser), fyldt med 8 nm guld albumin og forbundet med caveolae-lignendemorfologi. Bemærk også alvorlige dilatation af perivaskulær rum (PVS-) og proteinholdige ødem (A). Bjælker: 250 nm (A), 200 nm (B) 100 nm (a1, C).

Figur 3
Figur 3. Kronisk hæmning af ITSN-1s udtryk delvist genskaber IEJ integritet. Filtration rester i den luminale introit en IEJ (pilespids). Mild dilatation (*) i PVS tyder leakiness af IEJs. Multivesikulære organer (MVB), i umiddelbar nærhed af plasmamembranen har nogle af deres interne små blærer, mærkes med 8 nm guld albumin partikler. Bar: 100 nm.

Tabel 1. Kronisk hæmning af ITSN-1s ekspression forårsager aktivering af alternative endocytic / transcytotic veje og delvist genskaber caveolae nummer. * Resultaterne er normaliseret pr 100 um EF længde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Baseret på tidligere undersøgelser offentliggjort af andre 9 og os 1, 18 vi udviklet denne metode for langsigtet vælte af ITSN-1s in vivo ved gentagen intravenøs administration (hver 72 timer for 24 på hinanden følgende dage) for specifik siRNA / liposomkomplekser. Denne eksperimentelle fremgangsmåde er effektiv, kan anvendes sikkert og gentagne gange, og det kan nemt udvides til at studere inddragelse af et gen kodende for ethvert protein af interesse i lunge endotel og pulmonal homeostase. Under de eksperimentelle betingelser nedsat af os for gentagen siRNA / liposomer levering, optrådte mus normalt med ingen tegn på toksicitet eller immunrespons. Systemisk administration af siRNA ITSN / liposom komplekser er det mest klinisk relevant rute for indikationer som kræft og andre stofskiftesygdomme. Lungen er den første kapillærbane stødt af siRNA / liposom komplekser intravenøst, og dette kan forklare en effektiv KD ITSNi lungen.

En begrænsning af undersøgelsen er tidsafhængige kontinuerlig sammenlægning af kationiske liposomer 2. For at overvinde det blev siRNA / liposom komplekser leveret kort tid (mindre end 2 timer) efter generation og opbevares på is på alle tidspunkter før brug. Konventionelle kationiske liposomer, såsom dem, der anvendes i vores undersøgelse foreslås at blive ryddet af retikuloendoteliale system. Satsen for up-tage ved fagocytter kan de faldt med liposomal pegylering. Sterisk stabilisering med polyethylenglycol (PEG) coating forlænger liposomer cirkulation tid og samtidig have en mere jævn tissular fordeling. Disse faktorer bliver meget vigtige egenskaber i anti-cancer behandlinger, hvor langvarig omsætning kemoterapeutiske midler ønskes 12.

Med hensyn til EM procedure, bør små mængder af væv undersøgte blive kompenseret for ved systematisk og omfattende morfologiske og morphometric analyse samt ved undersøgelse af serielle sektioner, når det er nødvendigt.

Mens vores metodik optimerer dosering for vedvarende levering og siRNA effekt er yderligere undersøgelser nødvendige for at fokusere på høj effektivitet identifikation af de rigtige mål og vurderingen af ​​risici / fordele parametre inddrages.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Institute of Health Tilskud R01HL089462 til SP.

Materials

Endocytiske / transcytotic strukturer Kontrol ITSN-1s siRNA, 72 timer ITSN-1s siRNA, 24 d
Caveolae åbne for lumen * 106,6 ± 9,5 50,46 ± 4,8 87.15 ± 5,9
Caveolae tilsyneladende frit i cytosolen 173,5 ± 12,0 77.41 ± 6,3 143,0 ± 9,5
Samlet caveolae (luminale og gratis i cytosolen) 280,1 ± 21,5 127,86 ± 11,1 230,14 ± 15,4
Unormale endocytiske strukturer (forstørret endosomer) 2,65 ± .34 11,29 ± 2,7 14,93 ± 3,8
Caveolae klynger 3,95 ± .4 5,64 ± 1,6 11,3 ± 2,5
Hindeagtige ringe 1,33 ± .04 9,47 ± 2,4 12,8 ± 2,8
Tubuli .88 ± .05 4,0 ± 1,3 18,84 ± 3,4
Name Company Catalog Number Comments
Dimethyl Dioctadecyl Ammonium Bromide (DOAB) Sigma-Aldrich D2779
LiposoFast stabilizer (mini-extruder) Avestin Inc. LF-STB
Polycarbonate membrane, 19 mm diameter, 50 nm pore Avestin Inc. LFM-50
Cholesterol Sigma-Aldrich C-8667
Chloroform Mallinckrodt Chemicals 4432-04
Hank's balanced salts Sigma-Aldrich H1387
Round-bottom flask Fisher Scientific FHB-275-030X
Mouse siRNAITSN - on target Dharmacon/ThermoScientific J-046912-11
Peristaltic pump Ismatec REGLO-CDF digital with RHOO pump head
Ventilator Hugo Sachs Electronik NA
Barbital Sigma-Aldrich B-0500
Uranyl acetate EM Sciences 22400
Epon812 EM Sciences Discontinued by the manufacturer
Propylene oxide EM Sciences 20400
Embedding molds EM Sciences 69923-05
Tannic acid EM Sciences 21710
8 nm gold-albumin tracer Prepared in the laboratory as in16
Comments
Equipped with 2 Avestin 1 ml gas-tight syringes (cat. # LF-1)
Pyrex, 100 ml
Modified siRNA, in vivo
Part of IDEX corp.
D-79232 March, Germany
Replaced with Embed812, cat. # 14120

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Predescu, S. A., Predescu, D. N., Knezevic, I., Klein, I. K., Malik, A. B. Intersectin-1s regulates the mitochondrial apoptotic pathway in endothelial cells. J. Biol. Chem. 282 (282), 17166-17178 (2007).
  2. Uddin, S. Cationic lipids used in non-viral gene delivery systems. Biotechnology and Molecular Biology Review. 2 (2), 58-67 (2007).
  3. Barenholz, Y., et al. Influence of lipid composition on the thermotropic behavior and size distribution of mixed cationic liposomes. J. Colloid Interface Sci. (356), 46-53 (2011).
  4. Predescu, D. N., Neamu, R., Bardita, C., Wang, M., Predescu, S. A. Impaired caveolae function and upregulation of alternative endocytic pathways induced by experimental modulation of intersectin-1s expression in mouse lung endothelium. Biochem. Res. Int.. (2012), 672705 (2012).
  5. Higuchi, Y., Kawakami, S., Hashida, M. Strategies for in vivo delivery of siRNAs: recent progress. BioDrugs. 24 (24), 195-205 (2010).
  6. Caracciolo, G., Amenitsch, H. Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes. Eur. Biophys. J. , (2012).
  7. Barnier Quer, C., Elsharkawy, A., Romeijn, S., Kros, A., Jiskoot, W. Cationic liposomes as adjuvants for influenza hemagglutinin: more than charge alone. Eur. J. Pharm. Biopharm. 81 (81), 294-302 (2012).
  8. Rai, K., et al. Liposomal delivery of MicroRNA-7-expressing plasmid overcomes epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor-resistance in lung cancer cells. Mol. Cancer Ther. (10), 1720-1727 (2011).
  9. McLean, J. W., et al. Organ-specific endothelial cell uptake of cationic liposome-DNA complexes in mice. Am. J. Physiol. (273), H387-H404 (1997).
  10. Soutschek, J., et al. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. (432), 173-178 (2004).
  11. Barenholz, Y. Liposomes enhance bioremediation of oil-contaminated soil. J. Liposome Res. (13), 1-8 (2003).
  12. Zamboni, W. C. Liposomal, nanoparticle, and conjugated formulations of anticancer agents. Clin. Cancer Res. (11), 8230-8234 (2005).
  13. Newman, M. S., Colbern, G. T., Working, P. K., Engbers, C., Amantea, M. A. Comparative pharmacokinetics, tissue distribution, and therapeutic effectiveness of cisplatin encapsulated in long-circulating, pegylated liposomes (SPI-077) in tumor-bearing mice. Cancer Chemother Pharmacol. (43), 1-7 (1999).
  14. Martino, S., et al. Efficient siRNA delivery by the cationic liposome DOTAP in human hematopoietic stem cells differentiating into dendritic cells. J. Biomed. Biotechnol. (2009), 410260 (2009).
  15. Zhang, G., et al. A delivery system targeting bone formation surfaces to facilitate RNAi-based anabolic therapy. Nat. Med. 18 (18), 307-314 (2012).
  16. Predescu, D., Palade, G. E. Plasmalemmal vesicles represent the large pore system of continuous microvascular endothelium. Am. J. Physiol. (265), H725-H733 (1993).
  17. Koh, T. W., Verstreken, P., Bellen, H. J. Dap160/intersectin acts as a stabilizing scaffold required for synaptic development and vesicle endocytosis. Neuron. (43), 193-205 (2004).
  18. Miyawaki-Shimizu, K., et al. Lung Cell Mol. Physiol. (290), L405-L413 (2006).

Tags

Bioteknik Biomedical Engineering Biokemi Genetik Molekylærbiologisk Institut cellebiologi anatomi fysiologi medicin Immunologi Farmakologi dyremodeller hjertekarsygdomme intersectin-1s siRNA liposomer retro-orbital injektion akut og kronisk ITSN-1s knockdown transgene mus liposom endotelceller væv lunge perfusion elektronmikroskopi dyremodel
Langsigtet undertrykkelse af Intersectin-1s i muselunger ved Gentagen leveringen af ​​en specifik siRNA via kationiske liposomer. Evaluering af Knockdown Effects ved elektronmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bardita, C., Predescu, D., Predescu, … More

Bardita, C., Predescu, D., Predescu, S. Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (76), e50316, doi:10.3791/50316 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter