Summary
重复眼窝的阳离子liposomes/siRNA/ITSN-1s的复合物在小鼠24天，每72小时注射，有效地传递siRNA双链由75％减少-1S ITSN的mRNA和蛋白表达的小鼠肺微血管。这种技术是高度重现性的动物模型中，没有不利影响，并避免了死亡。
Abstract
以往的研究表明，击倒的ITSN-1S（KD ITSN），内吞蛋白参与调节肺血管通透性和内皮细胞（ECS）的生存，诱导细胞凋亡，长时间ITSN-1的细胞培养系统开发的主要障碍抑制1。使用阳离子脂质体为载体，我们探讨了沉默的ITSN-1基因在小鼠肺组织全身的的siRNA靶向ITSN-1基因（的siRNA ITSN）的管理。阳离子脂质体siRNA传递提供了几个优点：重复给药的安全，无免疫原性，无毒，易产生2。脂质体的性能和生物活性取决于其大小，电荷，脂质成分，稳定，剂量和路由管理3在这里，效率和具体的KD ITSN在小鼠肺部已获得胆固醇和二甲基二十八烷基三甲基溴化铵的组合。静脉交付的的siRNA ITSN /阳离子脂质体复合物瞬间撞倒-1蛋白和mRNA ITSN在小鼠肺部的第3天，其中痊愈后3天。以利用作为一个可重复的安全载体的阳离子脂质体，研究的24天延长。因此，眼窝治疗刚生成的络合物每第三天，诱导持续KD ITSN的整个研究4。将进行小鼠组织收集的几个时间点后的siRNA ITSN的电子显微镜（EM）分析，以评估影响慢性KD ITSN，肺血管内皮细胞中。高分辨率EM成像使我们能够评估在肺血管床（ 即破坏内皮屏障由KDITSN引起的形态变化，数量减少的小窝和其他交通途径的上调），特点非光显微镜检测。总体而言，这些研究结果建立IMPOR桑特作用ITSN-1在内皮细胞功能和肺稳态，同时说明在体内的siRNA脂质体输送的有效性。
Introduction
裸siRNA的不能穿透细胞膜，被带负电荷的，它很容易降解酶在血液，组织和细胞。即使最近的结构修改，以提高稳定性，在目标站点的siRNA积累给药后非常低，需要一个高效的细胞内车辆5。阳离子脂质体成为安全核酸载体的电位转移到细胞中的DNA / RNA的大块的封装和保护核酸酶降解6。此外，自发的交互阳离子脂质体与DNA / RNA，从而促进基因转移到细胞2。最近的脂质体已被应用到提供疫苗和低分子量药物7。脂质体交付的microRNA-7表达质粒克服表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂的耐药性在肺癌细胞中8。当目标血管内皮细胞，静脉内发送的配合物是必不可少的，因为不可能穿过内皮屏障和外渗到间质9。到其他器官相比，从肺微血管内皮细胞有最大的吸收，贪婪地内在化的阳离子脂质体与DNA / RNA复合物，其次是淋巴结和Peyer氏斑9。静脉交付的siRNA通过后眼窝或尾静脉注射的啮齿动物模型中已证明是无害的，即使在高浓度，如50毫克/公斤10。在公开发表的文献中，在阳离子脂质体组合物，不同的基础上的脂质制剂和它们的等摩尔比11，12。有广泛的潜在的应用，使用阳离子脂质体在体内的基因传递，无论目标的蛋白质down-regulation/over-expression，交付的疫苗或抗肿瘤治疗13-15。重要的是记住是，DNA / RNA的细胞的膜相互作用的效率之间的耦合产生的复合物和膜脂质的形状受。这表明，定制的目标细胞膜公司的脂质组合物，可能是有益的，并导致在一个特定的细胞类型6的高转染率。
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Protocol
1。阳离子脂质体的制备
- 高压灭菌用于lipososmes制备一个干净的圆底烧瓶中，。
- 准备股票的解决方案：
- - 在10毫升氯仿中，使用一个小的玻璃瓶中溶解200毫克的二甲基二（十八烷基）溴化铵（DOAB）。
- - 200毫克的胆固醇溶解在10毫升氯仿，用一个小玻璃瓶。
- - 准备和高压灭菌器进行灭菌的5％葡萄糖，在100毫升的RNA / DNA酶的蒸馏水。
- 冲洗圆底烧瓶中，用氯仿。添加5-10毫升的烧瓶中，漩涡，并让它坐几分钟。用铝箔纸覆盖在任何时候都保持烧瓶。清空从烧瓶中的氯仿。
- 脂质体的制备：
- - 添加315微升的DOAB原液圆底烧瓶。
- - 胆固醇原液向烧瓶中加入200微升。
- - 添加9.5毫升氯仿烧瓶第二漩涡混合。
- 设置旋转蒸发仪在37℃，100每分钟转速（RPM）或更多（100-120转）。应连接到旋转蒸发器与吸入管连接正确的水泵的真空控制。
- 连接氩气槽和旋转蒸发仪。
- 将烧瓶旋转蒸发仪，并降低在水浴前调整最佳设置。氩气完全打开第一阀逆时针转动。务必打开和关闭该阀。第二阀控制吹在向烧瓶中的氩气压力。压力应该总是温柔。
- 在水中洗澡，足以放下旋转蒸发烧瓶碰水没有被完全淹没，和打开的速度。
- 等待，直到所有的氯仿蒸发，约10分钟。然后停止机器。
- 旋转蒸发速度和氩罐阀关闭。载入该烧瓶中应被删除。
- 加入2毫升的5％葡萄糖日ê烧瓶中溶解血脂。
- 刮开使用1毫升枪头彻底溶解血脂的烧瓶底部。划伤后，除去任何剩余的脂质从1毫升尖端到烧瓶中，如果必要的话，与第二前端。
- 一边慢慢涡旋（每分钟15转）的烧瓶中，将得到的溶液在42℃水浴中孵育。
- 填写超声波破碎大桶冷水。超声溶液与举起的烧瓶中，并刚好接触水的底部至少20-30分钟。
- 的烧瓶中，在旋转蒸发器中的水浴加热20分钟，在42℃下，在零速时，与浸在水中，这时候的圆底。
- 脂质体通过0.47微米，随后，0.22微米的针头式过滤器过滤。
- 使用一个小的挤出机中，过滤通过50 nm的膜脂质体的单室脂质体囊，以产生均匀的人口。
- 脂质体中转移至Eppendorf管中，并置于冰上。
2。准备脂质体：的siRNA ITSN的配合
- 重悬上的目标的小鼠的siRNA ITSN的 siRNA中含有20mM HEPES和150mm的氯化钠，pH值7.4的缓冲液至终浓度为2微克/微升。混合之前保持在冰上。
- 8 nmol脂质体：2微克RNA（400 nmol脂质体100微克的siRNA ITSN的 ），上面的比例制备的脂质体：的siRNA ITSN络合物。在本研究中，我们从储备溶液（50μM）的siRNA ITSN的 50微升新鲜制备的脂质体中使用的RNA / DNA的酶的Eppendorf管中，加入100μl。注意浓度的siRNA ITSN是非常重要的，因为最大为150微升的混合物，可以在同一时间在小鼠双边和眶注入。
- 等待注入小鼠的同时，保持该混合物在冰上。
3。鼠标眼窝静脉注射（内部角度眼圈）
jove_content“>所有小鼠实验进行了批准和执行根据拉什大学机构动物护理和使用委员会的指导方针。- 麻醉小鼠腹腔注射50毫克/公斤体重的氯胺酮和5毫克/公斤体重甲苯噻嗪（市售的混合物）。根据动物的体重和年龄的不同，调整的麻醉剂的量和浓度。所用小鼠在研究小鼠CD1雄性小鼠6-8周龄，体重约25克。结核菌素注射器1毫升型针头。
- 用一只手按住鼠标耳朵，并把鼠标的一侧的眼睛，露出内部的角度。瞄准内侧皱襞半月;避免接触眼球。
- 接近持注射器含有混合物在所有三个轴45度角的眼睛泪阜。
- 缓缓注入混合物让鼠标恢复注入侧。如果有大量液体液滴形式针头插入的地方，退针，倒吸液滴入注射器，然后再试一次。反复注射是最好由交替的眼睛来完成，让完美的复苏。如果不确定，这种技术可以检查，通过注入蓝色染料（50微升，甲醇0.5％龙胆紫）和暴露小鼠肺组织观察蓝色血管。
- 在这项研究中的小鼠注射每3周的第 3天，无死亡或不良影响。
4。生化研究小鼠肺灌注和组织收集
- 设置在蠕动泵运行在1.5毫升/分钟。
- 准备设置：呼吸机，手术台，器械，无菌棉签，棉签，字符串，烧杯，蒸馏水，汉克的平衡盐，示踪。
- 麻醉小鼠腹腔注射麻醉剂的混合物（100毫克/公斤体重的氯胺酮和10毫克/公斤体重甲苯噻嗪）。 的颈部，取出唾液腺暴露气管。
- 开始剖腹探查，切除隔膜，并按照与开胸，暴露肺和心脏的。
- 取出胸腺。
- 更准确地使用光镜，导尿肺动脉。
- 做气管切开及插管鼠标采用气管造口。将呼吸机的速度150次/分，每搏输出量150微升。
- 作为插座，打开左心房。
- 灌注的小鼠肺脉管血液5分钟，使用蠕动泵和Hank溶液在37℃下加热
- 灌注示踪剂（8 nm金白蛋白16）额外的10分钟，在相同的流速。
- 冲洗未结合的示踪肺灌注5分钟，汉克的解决方案。
- 关注的肺部原位固定10分钟的灌注4％（重量/体积）的甲醛，2.5％戊二醛，1％鞣酸0.1筒缓冲液，pH 7.2。
- 收集肺，除去多余的组织，切小块（3/3毫米），并把它们标记闪烁小瓶含2毫升混合固定液。
老鼠会在手术过程中麻醉完全失效。
5。小鼠肺组织处理EM
- 准备股票解决方案：1％醋酸巴比妥，帕拉德OSO 4，克伦贝格尔缓冲区。
- - 1％帕拉德-OSO 4缓冲液包含：1毫升醋酸巴比妥的库存，1.25毫升4％OSO 4，1毫升的0.1当量的盐酸，蒸馏水5毫升的最终体积。
- - 醋酸巴比妥库存溶液溶解1.15的乙酸钠andydrous和2.94克巴比妥在100毫升蒸馏水中通过以下方式获得。
- 克伦贝格尔溶液包含2毫升醋酸巴比妥库存，2.8毫升0.1N盐酸，醋酸双氧铀0.05克，和5.1毫升的蒸馏水，pH值= 6。
- 将猪肺洗净块中的0.1M的二甲胂酸钠缓冲液，pH = 7.4的，短暂的3倍。
- 固定在试样中的4％（重量/体积）的甲醛，2.5％戊二醛在0.1 PIPES缓冲液，pH值7.2，1小时后，在室温下。
- 修复后用1％锇帕拉德在引擎盖1小时，在冰上，在黑暗中。
- 冲洗一次与克伦贝格尔缓冲区。
- 2小时至过夜，在室温下孵育克伦贝格尔缓冲液标本。
- 在50％乙醇中冲洗一次。
- 梯度乙醇，5分钟/每：70％，95％，则2×15分钟100％乙醇脱水。
- 切换到100％的环氧丙烷，2×15分钟。
- 取出环氧丙烷的混合物加入50％的环氧丙烷和50％EPON 812，孵育过夜，旋转的车轮上，在室温下。
- 第二天早上，取出该混合物，并加入新鲜的EPON 812，至少在4-5小时在车轮上。
- 使用一倍锥形模具，填充半路上，新鲜的100％EPON 812，添加选定的标本，并把它们的边缘。
- 将模具在60℃的孵化器集，并让他们固化48-72小时。
- 聚合时，发送块要薄（60-70纳米厚）切片。
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Representative Results
在几个时间点后的siRNA ITSN的交付Western blot和常规和定量PCR 4-1S ITSN的蛋白和mRNA水平进行了监测。在处理的siRNA ITSN的小鼠肺组织的-1S ITSN的蛋白和mRNA水平低约75％控制在21天连续击倒ITSN-1S。如果没有-1 ITSN，动力2，一个主要的相互作用合作伙伴的1s和ITSN必不可少播放器脱离从质膜的小窝还没有有效的招募的内吞站点，从而小窝脱离质膜和形成自由水泡性口载流子被打乱1，17。因此，无效膜裂变和免费水疱载体形成受损造成缺陷的细胞内吞作用和跨内皮细胞运输，破坏内皮细胞间的屏障和肺水肿（ 图1）。此外，上调下调-1S ITSN的替代TRansport途径，以弥补缺乏的内吞作用。我们注意到膜质环（ 图2A 2A1），多形性小管（ 图2B），和扩大内涵体的融合，积极参与黄金白蛋白的摄取和运输的典型的小窝（ 图2C）。一个显着的发现是小窝在1S ITSN的缺陷的小鼠肺血管内皮细胞数量减少，参照控制， 见表1。减少反复交付阳离子脂质体/ siRNA ITSN的 24天延长ITSN-1抑制小鼠的肺水肿，部分恢复跨内皮屏障的完整性。 EM形态学研究表明，8nm的金白蛋白示踪剂不能穿透的内皮细胞间的结点，在该时间点。相反，它们形成的过滤残留物在管腔祭文的交界处（ 图3）。然而，血管周围的空间表现出一定的扩张和温和的水肿，这表明路口这种颗粒尺寸是不可渗透的，但仍漏。此外，形态中间体替代的内吞途径是活动的，目前在较高的数字。值得注意的是，形态分析表明标记的白蛋白金颗粒膜环/小管的数量增加了14倍，在慢性-1 ITSN的缺陷小鼠肺血管内皮细胞时相比，控制， 表1。小窝数部分恢复，只有17.8％的跌幅，参考控制。因此，我们的结果表明，重复交付阳离子脂质体/的siRNA ITSN配合物是一种合适的方法， 在体内长期蛋白敲除的影响进行研究。
图1。标记届代表电子显微照片，显示开放interendothelial路口（IEJs）roughout其长度由8 nm金白蛋白颗粒。箭头A和放大A1，点，三，四金白蛋白颗粒靠近彼此在相同的计划，宽的开口的调节IEJ的表示。金颗粒也与腔外退出的IEJs（A，B -箭头）。还要注意的有限数量小窝和的空间pericapillary片的扩张;星号）。酒吧：200纳米100纳米（A）（B，A1）。
图2。代表EM图像膜环（A，A1），管状元素（B，箭头）和扩大内涵体（C，箭头 ），装有8 nm金白蛋白和急性摄1S ITSN的表达诱导多形性胞吞/ transcytotic的中间体。小窝状形态。还要注意的严重扩张的血管周围空间（PVS）和蛋白质水肿（A）。酒吧：250纳米（A），200纳米（B）100海里（A1，C）。
图3。慢性抑制的1S ITSN的表达部分恢复调节IEJ的完整性。过滤残留在管腔祭文的一个调节IEJ（箭头）。轻度扩张（*）的PVS建议泄漏IEJs。多泡体（MVB），在邻近的等离子体薄膜有一些其内部的小囊泡，由8 nm金白蛋白颗粒标记。酒吧：100纳米。
| 胞吞/ transcytotic结构 | 控制 | ITSN-1S的siRNA，72小时 | ITSN-1的siRNA，24 D |
| 小窝打开流明* | 106.6±9.5 | （50.46±4.8） | （87.15±5.9） |
| 显然在细胞质小窝 | （173.5±12.0） | 77.41±6.3 | （143.0±9.5） |
| 合计小窝（管腔免费在细胞质中） | （280.1±21.5） | （127.86±11.1） | （230.14±15.4） |
| 异常的内吞结构（扩大内涵体） | （2.65±0.34） | 11.29±2.7 | 14.93±3.8 |
| 小窝集群 | 3.95±.4 | 5.64±1.6 | 11.3±2.5 |
| 膜环 | 1.33±0.04 | 9.47±2.4 | 12.8±2.8 |
| 肾小管 | （0.88±0.05） | 4.0±1.3 | 18.84±3.4 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimethyl Dioctadecyl Ammonium Bromide (DOAB) | Sigma-Aldrich | D2779 | |
| LiposoFast stabilizer (mini-extruder) | Avestin Inc. | LF-STB | |
| Polycarbonate membrane, 19 mm diameter, 50 nm pore | Avestin Inc. | LFM-50 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C-8667 | |
| Chloroform | Mallinckrodt Chemicals | 4432-04 | |
| Hank's balanced salts | Sigma-Aldrich | H1387 | |
| Round-bottom flask | Fisher Scientific | FHB-275-030X | |
| Mouse siRNAITSN - on target | Dharmacon/ThermoScientific | J-046912-11 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | REGLO-CDF digital with RHOO pump head | |
| Ventilator | Hugo Sachs Electronik | NA | |
| Barbital | Sigma-Aldrich | B-0500 | |
| Uranyl acetate | EM Sciences | 22400 | |
| Epon812 | EM Sciences | Discontinued by the manufacturer | |
| Propylene oxide | EM Sciences | 20400 | |
| Embedding molds | EM Sciences | 69923-05 | |
| Tannic acid | EM Sciences | 21710 | |
| 8 nm gold-albumin tracer | Prepared in the laboratory as in16 | ||
| Comments | |||
| Equipped with 2 Avestin 1 ml gas-tight syringes (cat. # LF-1) | |||
| Pyrex, 100 ml | |||
| Modified siRNA, in vivo | |||
| Part of IDEX corp. | |||
| D-79232 March, Germany | |||
| Replaced with Embed812, cat. # 14120 | |||
References
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Tags
生物工程，76期，生物医学工程，生物化学，遗传学，分子生物学，细胞生物学，解剖学，生理学，医学，免疫学，药理学，动物模型，心血管疾病，intersectin-1的siRNA，脂质体，眼窝注射，急性和慢性拦截-1 ITSN的，转基因小鼠，脂质体，内皮细胞，组织，肺，灌注，电子显微镜，动物模型; View Video
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