Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

השתקה ארוכת טווח של Intersectin-1S בעכבר על ידי משלוח ריאות חוזר ונשנה של siRNA ספציפי באמצעות ליפוזומים קטיוני. הערכה של השפעות מציאה על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים

Published: June 21, 2013 doi: 10.3791/50316
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,2
1Department of Pharmacology, Rush University, 2Pulmonary and Critical Care Department, Rush University
* These authors contributed equally

Summary

זריקות רטרו מסלולית חוזרות ונשנות של מתחמי קטיוני liposomes/siRNA/ITSN-1s בעכברים, בכל 72 שעות למשך 24 ימים, ביעילות לספק דופלקס siRNA לmicrovasculature ריאות עכבר הפחתת mRNA ITSN-1S וביטוי חלבון על ידי 75%. טכניקה זו היא שחזור מאוד במודל של בעלי חיים, אין לו תופעות לוואי ונמנע הרוגים.

Abstract

מחקרים קודמים הראו כי מציאה של ITSN-1S (KD ITSN), חלבון endocytic המעורב בויסות חדירות כלי דם וריאות תאי האנדותל (ECS) הישרדות, מוות של תאי אפופטוטיים מושרה, מכשול עיקרי בפיתוח מערכת תרבית תאים עם ITSN-1S ממושך עיכוב 1. באמצעות ליפוזומים קטיוני כנשאים, בחן את ההשתקה של גן ITSN-1S בעכבר ריאות על ידי ממשל מערכתי של siRNA גן מיקוד ITSN-1 (ITSN siRNA). ליפוזומים קטיוני מציעים מספר יתרונות למסירת siRNA: בטוח במינון חוזר ונשנה, nonimmunogenic, רעילים, וקלים לייצור 2. ביצועים ליפוזומים ופעילות ביולוגית שלהם תלויות בגודל, תשלום, שומנים הרכב, יציבות, מינון ודרך מתן 3 הנה, יעיל והספציפי בITSN KD ריאות עכבר הושג באמצעות שילוב רומיד אמוניום dioctadecyl כולסטרול ודימתיל. משלוח תוך ורידישל ITSN siRNA / מתחמי liposome קטיוני דפקו transiently למטה חלבון ITSN-1S וmRNA בעכבר ריאות ביום 3, שהתאושש לאחר 3 ימים נוספים. מנצלים את יפוזומים קטיוני כמוביל בטוח הדיר, המחקר הוארך למשך 24 ימים. לפיכך, טיפול רטרו מסלולית עם מתחמים טריים שנוצרו היה מנוהל בכל יום 3, גרימת ITSN KD המתמשך לאורך כל תקופת המחקר 4. רקמות עכבר שנאספו במספר הנקודות ITSN לאחר זמן siRNA היו נתונים למיקרוסקופים אלקטרונים (EM) ניתוחים כדי להעריך את ההשפעות של KD ITSN הכרוני, בהאנדותל ריאות. רזולוציה גבוהה EM הדמיה אפשרה לנו להעריך את השינויים מורפולוגיים שנגרמו על ידי KDITSN במיטת כלי דם הריאה (כלומר שיבוש של מכשול אנדותל, מספר caveolae וupregulation של מסלולי תחבורה חלופיים ירד), מאפיינים שאינם לזיהוי על ידי מיקרוסקופ אור. בסך הכל ממצאים אלו הוקמו imporהתפקיד של TANT ITSN-1S בתפקוד ECs והומאוסטזיס ריאות, ואילו הממחיש את היעילות של ליפוזומים משלוח siRNA בin vivo.

Introduction

siRNA בלתי מזוינת לא יכול לחדור את קרום התא, שטעון שלילי, וזה בקלות מושפל על ידי אנזימים בדם, רקמות ותאים. אפילו עם לאחרונה שינויים מבניים לשיפור יציבות, הצטברות siRNA באתר היעד לאחר מתן היא נמוכה ביותר ודורשת רכב תאי יעיל 5. ליפוזומים קטיוני התפתחו כנשאים חומצות גרעין בטוחים עם הפוטנציאל להעברת חלקים גדולים של ה-DNA / RNA לתאים על ידי encapsulating והגנה על חומצות גרעין משפלה האנזימטית 6. כמו כן, ליפוזומים קטיוני אינטראקציה באופן ספונטני עם DNA / RNA, ובכך לקדם העברת גנים לתאים 2. לאחרונה יפוזומים יושמו כדי לספק חיסונים ותרופות מולקולריים נמוכה במשקל 7. משלוח liposomal של microRNA-7-להביע פלסמיד מתגבר על גורם הקולטן טירוזין קינאז מעכב גדילה באפידרמיס-התנגדות בתאי סרטן ריאות 8. כאשר מיקודהאנדותל של כלי דם, האספקה ​​תוך ורידי הוא חיוני משום המתחמים צפויים לחצות את מחסום האנדותל וextravasate לinterstitium 9. על ידי השוואה לאיברים אחרים, ECS מmicrovasculature של הריאה יש הספיגה הגדולה ביותר בשקיקה ולהפנים יפוזום קטיוני ומתחמי DNA / RNA, ואחריו את בלוטות הלימפה והטלאים של Peyer 9. משלוח תוך ורידי במודלים של מכרסמים של siRNA באמצעות זריקות וריד רטרו מסלולית או זנב הוכח בלתי מזיק גם בריכוזים גבוהים, כגון 50 מ"ג / ק"ג 10. בספרות שפורסמה בהרכב ליפוזומים קטיוני שונה, המבוסס על ניסוח שומנים והיחס שלהם equimolar 11, 12. יש מגוון רחב של יישומים אפשריים באמצעות ליפוזומים קטיוני למסירת גן in vivo, בין אם מיקוד down-regulation/over-expression של החלבונים, משלוח של חיסונים או טיפולים אנטי סרטניים 13-15. חשוב לזכורהוא שהיעילות של אינטראקציה קרום DNA / RNA-הסלולר מוסדרת על ידי צורת צימוד בין מתחמים שנוצרו ושומנים בממברנה. הדבר מצביע על כך חייטות הרכב שומנים לפרופילי הממברנה התאיים הממוקדים עשויה להיות מועילה ותוצאה בשיעור גבוה של transfection בסוג תא מסוים 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנה ליפוזומים cationic

  1. חיטוי בקבוק מסביב לתחתית נקי כדי לשמש להכנת lipososmes.
  2. הכן פתרונות מניות:
    1. - ממיסים 200 מ"ג של אמוניום ברומיד dioctadecyl דימתיל (DOAB) בכלורופורם 10 מ"ל באמצעות בקבוק זכוכית קטן.
    2. - ממיסים 200 מ"ג של כולסטרול בכלורופורם 10 מ"ל באמצעות בקבוק זכוכית קטן.
    3. - היכונו והחיטוי לעקר 5% גלוקוז ב100 מ"ל של רנ"א / מים מזוקקים חופשיים ה-DNA ASE.
  3. יש לשטוף את הבקבוק מסביב לתחתית עם כלורופורם. הוסף 5-10 מ"ל לבקבוק, המערבולת, ולתת לו לשבת במשך כמה דקות. שמור את הבקבוק מכוסה ברדיד אלומיניום בכל העת. רוקן את כלורופורם מהבקבוק.
  4. הכנת ליפוזומים:
    1. - הוספה 315 μl של פתרון מניות DOAB לבקבוק מסביב לתחתית.
    2. - הוספה 200 μl של פתרון מניות כולסטרול לבקבוק.
    3. - הוסף 9.5 מ"ל של כלורופורם לבקבוקND לערבב על ידי מערבולת.
  5. הגדר את rotavapor על 37 מעלות צלזיוס, 100 סיבובים לדקה (סל"ד) או יותר (100-120 סל"ד). Rotavapor צריך להיות מחובר לשליטת ואקום משאבת מים עם צינור יניקה המחוברת כמו שצריך.
  6. חבר את המכל גז הארגון וrotavapor.
  7. צרף את הבקבוק לrotavapor ולהתאים את ההגדרות האופטימליות לפני הורדתו באמבט המים. פתח את השסתום הראשון לארגון לחלוטין על ידי הפיכתו נגד כיוון השעון. תמיד לפתוח ולסגור את השסתום הזה ראשון. השסתום השני שולט בלחץ ניפוח בארגון לבקבוק. הלחץ צריך להיות עדין תמיד.
  8. מנמיכים את rotavapor באמבט המים, מספיק הבקבוק לגעת במים מבלי להיות שקוע לחלוטין ולהדליק את המהירות.
  9. חכה עד שכל מתאדה כלורופורם, כ -10 דקות. ואז לעצור את המכונה.
  10. כבה את מהירות rotavapor ואת שסתומי טנקי הארגון. עכשיו יש להוציא את הבקבוק.
  11. הוסף 2 מ"ל של 5% גלוקוז לבקבוק הדואר לפזר את השומנים.
  12. לגרד את תחתית הבקבוק ביסודיות באמצעות טיפ 1 מיליליטר פיפטה לפזר את כל השומנים. לאחר הגירוד, להסיר כל שומנים שנותרו מקצה 1 מ"ל לתוך הבקבוק, במידת צורך, עם קצה שני.
  13. דגירה הפתרון שהושג ב42 ° C אמבט מים תוך vortexing לאט (15 סל"ד) הבקבוק.
  14. מלא את מע"מ sonicator עם מים קרים. Sonicate הפתרון לפחות 20-30 דקות עם הבקבוק והרים את התחתית רק בקושי נוגע במים.
  15. מחממים את הבקבוק באמבט המים של rotavapor במשך 20 דקות על 42 מעלות צלזיוס, במהירות אפס, עם התחתית העגולה שקועה במים, הפעם.
  16. לסנן את יפוזומים דרך מיקרון 0.47 ולאחר מכן, 0.22 מסנני מזרק מיקרון.
  17. באמצעות מכבש קטן, לסנן את יפוזומים דרך קרום ננומטר 50 כדי לייצר אוכלוסייה הומוגנית של שלפוחית ​​liposome unilamellar.
  18. העבר את יפוזומים לצינור Eppendorf ולמקם אותו על קרח.

2. הכינו את יפוזומים: siRNA-ITSN-1 תסביכים

  1. Resuspend ITSN siRNA העכבר על היעד בחיץ siRNA המכיל 20 מ"מ וHEPES נתרן כלורי 150mm, pH 7.4, לריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / μl. שמור את זה על קרח לפני הערבוב.
  2. הכן את יפוזומים: מתחמי ITSN siRNA ביחס של 8 ליפוזומים nmol: 2 RNA מיקרוגרם (או 400 ליפוזומים nmol: ITSN siRNA מיקרוגרם 100). במחקר הנוכחי, שהוספנו 50 μl של ITSN siRNA מפתרון המניות (50 מיקרומטר) עד 100 μl של יפוזומים עתה הוכנו באמצעות צינור Eppendorf בחינם DNA-ASE RNA /. שימו לב שהריכוז של ITSN siRNA הוא מאוד חשוב, כי מקסימום של 150 μl של תערובת ניתן להזריק בילטרלי ורטרו מסלולית בעכבר בפעם אחת.
  3. שמור את התערובת על קרח בעת שהמתין כדי להזריק את העכברים.

3. הזרקה לוריד רטרו מסלולית עכבר (זווית פנימית של שקע העין)

jove_content "> כל ניסויי העכבר אושרו ובוצעו בהתאם להנחיות הטיפול של אוניברסיטת Rush בבעלי חיים המוסדיים ועדת שימוש.

  1. להרדים את העכבר על ידי הזרקה תוך הצפק של קטמין 50 מ"ג / ק"ג משקל גוף ומשקל גוף 5 xylazine מ"ג / ק"ג (תערובת זמינה מסחרי). בהתאם למשקל וגיל בעלי החיים, להתאים את עוצמת קול וריכוז ההרדמה. העכברים ששמשו במחקר העכברים הם CD1 עכברי זכרים, 6-8 שבועות ושוקלים סביב 25 גרם. את המזרקים הם סוג טוברקולין 1 מ"ל עם המחט מחוברת.
  2. החזק את אוזני עכבר ביד אחת ולהפוך את העכבר למטה בצד לחשוף את הזווית הפנימית של העין. המטרה המדיאלי לsemilunaris plica; להימנע מלגעת בגלגל העין.
  3. מתקרב לcaruncle הדמע של העין מחזיקה את המזרק המכיל את התערובת בזווית של 45 מעלות בכל שלושת הצירים.
  4. לאט לאט להזריק את התערובת ולתת לעכבר כדי להתאושש עם הצד המוזרק למעלה. אם נוזל גדולצורות רביב במקום החדרת המחט, לחזור בו מחט, שאיבה בחזרה הטיפה לתוך המזרק ונסו שוב. זריקות חוזרות ונשנות נעשות על ידי מיטב לסירוגין את העיניים, כדי לאפשר התאוששות מושלמת. אם אינך בטוח, ניתן לבדוק בטכניקה זו על ידי הזרקת צבע כחול (50 μl, סגול גביש 0.5% במתנול) וחושף את ריאות העכבר כדי לבחון את כלי הדם הכחולים.
  5. העכברים במחקר זה הוזרקו כל יום 3 rd במשך 3 שבועות ללא הרוגים או תופעות לוואי.

4. זלוף עכבר ריאות ואוסף רקמות ללימודים ביוכימיה

  1. הגדר את משאבת peristaltic לרוץ ב1.5 מ"ל / דקה.
  2. הכן את ההגדרה: מכונת הנשמה, שולחן ניתוחים, מכשירים, צמר גפן סטרילי, Q-טיפים, מחרוזות, כוסות, מים מזוקקים, מלח מאוזן של האנק, נותב.
  3. להרדים את העכבר על ידי זריקת intraperitoneal של תערובת ההרדמה (קטמין 100 מ"ג / ק"ג משקל גוף ומשקל הגוף xylazine 10 מ"ג / ק"ג). ברמת הצוואר, להסיר את בלוטות הרוק ולחשוף את קנה הנשימה.
  4. התחל עם laparotomy, בלו הסרעפת, ופעל עם פתיחת בית החזה, חושף את הריאות ואת הלב.
  5. הסר את התימוס.
  6. שימוש במיקרוסקופ האור לדיוק טוב יותר, לצנתר את העורק הריאתי.
  7. האם הנשמה וצנרר העכבר באמצעות tracheostoma. הגדר את מכונת ההנשמה לשיעור של 150 מקרי שבץ / דקה ונפח פעימה של 150 μl.
  8. כפורקן, לפתוח את הפרוזדור השמאלי.
  9. Perfuse כלי דם הריאה העכבר ללא דם במשך 5 דקות, תוך שימוש בפתרון של האנק המשאבה וperistaltic חימם על 37 ° C.
  10. Perfuse נותב (8 ננומטר זהב אלבומין 16) לתוספת 10 דקות באותו קצב הזרימה.
  11. לשטוף נותב מאוגד על ידי זלוף ריאות דקות 5 עם פתרונו של האנק.
  12. פעל עם קיבוע באתרו של הריאות על ידי 10 זלוף דקות של 4% (wt / כרך) פורמלדהיד, 2.5% glutaraldehyde, ו -1% חומצה טאני ב0.1 צינורותחיץ, pH 7.2.
  13. לאסוף את הריאות, להסיר את הרקמה המוגזמת, לחתוך קוביות קטנות (3/3 מ"מ), ומניח אותם לבקבוקון נצנץ כותרת המכיל 2 מ"ל של תערובת מקבע.

העכברים יפוגו בהרדמה מלאה במהלך ההליך.

5. עיבוד רקמת ריאה עכבר לEM

  1. הכינו פתרונות מניות: 1% Palade 4 oso, אצטט הוורונל, וחיץ קלנברגר.
    1. - 1% חיץ Palade-oso 4 מכיל: 1 מיליליטר מניית אצטט הוורונל, 1.25 מ"ל 4% 4 oso, 1 מ"ל של 0.1 N חומצה הידרוכלורית, ומים מזוקקים עד 5 מ"ל של נפח סופי.
    2. - פתרון מניות הוורונל אצטט מתקבל על ידי המסת 1.15 andydrous גרם נתרן אצטט ו2.94 g barbital ב100 מ"ל של מים מזוקקים.
    3. פתרון-קלנברגר מכיל 2 מ"ל של מניית הוורונל אצטט, 2.8 מ"ל של 0.1 N חומצה הידרוכלורית, 0.05 אצטט uranyl גרם, ו5.1 מ"לשל מים מזוקקים, pH = 6.
  2. שטוף את גושי הריאה ב0.1 מ 'נתרן cacodylate חיץ, pH = 7.4, 3 פעמים לזמן קצר.
  3. תקן את הדגימות ב4% (wt / כרך) פורמלדהיד, glutaraldehyde 2.5% בחיץ צינורות 0.1, pH 7.2, עבור שעה 1, בטמפרטורת חדר.
  4. פוסט לתקן עם Palade-אוסמיום 1% עבור שעה 1 במכסת המנוע, על קרח, בחושך.
  5. יש לשטוף פעם אחת עם חיץ קלנברגר.
  6. דגירה דגימות בקלנברגר חיץ במשך שעה 2 ללילה, בטמפרטורת חדר.
  7. יש לשטוף פעם אחת ב 50% אתנול.
  8. ליבש עם סדרה מדורגת של אתנול, 5 דקות / כל אחד: 70%, 95%, ולאחר מכן 2 x 15 דקות 100% אתנול.
  9. מעבר ל -100% פרופילן אוקסיד, 2 x 15 דקות.
  10. הסר פרופילן אוקסיד ולהוסיף תערובת של 50% פרופילן אוקסיד ו -50% EPON 812, דגירה הלילה, מסתובב על גלגל, בטמפרטורת חדר.
  11. למחרת בבוקר, להסיר את התערובת ולהוסיף 812 EPON הטרי, לפחות עבור שעות 4-5 על ההגה.
  12. שימוש בתבניות הוכפלו מחודדות, מלאותחצי דרך עם 100% טריים EPON 812, להוסיף דגימות נבחרות ולמקם אותם לקצוות.
  13. להעביר את התבניות לסט החממה ב 60 ° C ולתת להם לרפא במשך 48-72 שעות.
  14. כאשר polymerized, לשלוח את אבני להיות רזה (60-70 ננומטר עבה) מחולק.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

רמות חלבון וה-mRNA ITSN-1s היו במעקב במספר נקודות זמן לאחר לידת ITSN siRNA ידי כתם המערבי וPCR הקונבנציונלי וכמותית בכ4. רמות חלבון וה-mRNA ITSN-1S בעכבר ריאות שטופלו ITSN siRNA היו כ -75% נמוכים יותר על ידי התייחסות לבקרות במהלך מתמדת של מציאה ITSN-1S במשך 21 ימים. ללא ITSN-1S, dynamin-2, שותף אינטראקציה עיקרי של שחקן ITSN-1S והחיוני בניתוק של caveolae מקרום הפלזמה אינו יעיל גויס לאתר endocytic ובכך, ניתוק caveolae מקרום הפלזמה והיווצרות לפוחי החופשי ספקים מופר 1, 17. לכן, ביקוע קרום יעיל והיווצרות לקויה של ספקי לפוחי חינם גרמו אנדוציטוזה לקויה ותחבורה transendothelial, שיבוש של מכשול בין אנדותל ובצקת ריאות (איור 1). יתר על כן, למטה רגולציה של ITSN-1S עד מוסדרת החלופה transport משעולים כדי לפצות על אנדוציטוזה הלקויה. אנחנו הבחנו בטבעות קרומיות (איורים 2 א, 2A1), קשיות pleomorphic (איור 2), והורחב endosomes התמזגו עם caveolae הטיפוסי (איור 2 ג) מעורבת באופן פעיל בספיגה והובלת זהב אלבומין. ממצא משמעותי הוא הירידה במספר caveolae בהאנדותל ריאות לקויה עכבר ITSN-1S על ידי התייחסות לבקרות, טבלת 1. עיכוב ITSN-1S ממושך במשך 24 ימים על ידי משלוח חוזר ונשנה של יפוזומים קטיוני / ITSN siRNA הקטין את בצקת הריאות בעכברים על ידי השחזור באופן חלקי על שלמות המחסום בין אנדותל. EM מחקרים מורפולוגיים הראו שנותב זהב אלבומין 8nm לא הצלחתי לחדור את צמתים בין אנדותל-, בנקודה זו בזמן. במקום זאת, הם יצרו שאריות סינון בintroit luminal לצומת (איור 3). עם זאת, את חללי perivascular הראו כמה התרחבות ומתונהבצקת, טוען כי צמתים הם בלתי חדירים לגודל זה של החלקיקים, אבל עדיין דולפים. כמו כן, את חומרי ביניים המורפולוגיות של מסלולי endocytic חלופיים הם פעילים ובהווה במספרים גבוהים יותר. באופן ניכר, את ניתוחי morphometric ציינו כי מספר הטבעת / צינוריות קרומית מסומנת על ידי חלקיקי זהב אלבומין גדל ב -14 לקפל בהאנדותל לקוי ריאות כרוניות עכבר ITSN-1S בהשוואה לקבוצת ביקורת, טבלת 1. מספר Caveolae משוחזר באופן חלקי, רק 17.8% ירידה, על ידי התייחסות לבקרות. לפיכך, התוצאות שלנו מראות כי משלוח חוזר ונשנה של יפוזומים קטיוני / מתחמי ITSN siRNA הוא מתודולוגיה מתאימה כדי לחקור את ההשפעות של מציאה חלבון לטווח ארוך בגוף חי.

איור 1
איור 1. micrographs האלקטרונים הנציג מראה צמתים interendothelial פתוחים (IEJs) שכותרת הroughout אורכם על ידי 8 ננומטר חלקיקי זהב אלבומין. ראש חץ ובמוגדל A1, נקודות לשלוש עד ארבעה חלקיקי זהב אלבומין נמצאים קרוב זה לזה באותה התכנית, מעידים על הפתיחה רחבה של IEJ. חלקיקי זהב קשורים גם עם יציאת abluminal של IEJs (A, B - חיצים). שימו לב גם למספר המוגבל של caveolae והתרחבות של מחשבי חלל pericapillary; כוכביות). ברים: 200 ננומטר (א); 100 ננומטר (ב ', א 1).

איור 2
איור 2. הפרעות חריפות ביטוי ITSN-1S גורמת ביניים endocytic / transcytotic pleomorphic. נציג EM תמונות של טבעות (קרומיות, A1), אלמנטים צינוריים (B, חיצים) והורחב endosomes (C, ראשי חץ), עמוסות 8 ננומטר זהב ואלבומין קשור כמו caveolaeמורפולוגיה. שים לב גם התרחבות החמורה של חלל perivascular (PVS) ובצקת חלבוניים (). ברים: 250 ננומטר (א); 200 ננומטר (B) 100 ננומטר (A1, ג).

איור 3
איור 3. עיכוב כרוני של ביטוי ITSN-1S חלקית משחזר יושרת IEJ. שאריות סינון בintroit luminal של IEJ (ראש החץ). התרחבות מתונה (*) מPVS מרמזת leakiness של IEJs. גופי Multivesicular (MVB), בסמיכות של קרום הפלזמה יש כמה מהשלפוחית ​​קטנה הפנימית שלהם, שכותרתו על ידי 8 חלקיקי אלבומין זהב ננומטר. בר: 100 ננומטר.

טבלת מס '1. עיכוב כרוני של ביטוי ITSN-1S גורם להפעלה של מסלולי endocytic / transcytotic חלופיים באופן חלקי ומשחזר מספר caveolae. * תוצאות מנורמלות לכל 100 אורך EC מיקרומטר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בהתבסס על מחקרים קודמים שפורסמו על ידי אחרים ו9 1, 18 שפתחנו מתודולוגיה זו לטווח ארוך להפיל של ITSN-1S in vivo על ידי עירוי לוריד חזר (בכל שעה 72, במשך 24 ימים רצופים) של siRNA הספציפי / מתחמי liposome. גישה ניסויית זה היא יעילה, בטוח לשימוש ושוב ושוב וניתן להרחיב אותו בקלות כדי לחקור את מעורבותו של גן מקודד חלבון כלשהו של עניין בהאנדותל ריאות והומאוסטזיס ריאתי. תחת התנאים הניסיוניים שהוקמו על ידינו לsiRNA חזר / משלוח ליפוזומים, עכברים נראים נורמלי ללא סימני רעילות או תגובות חיסוניות. ניהול מערכתי של קומפלקסי ITSN / liposome siRNA הוא הדרך הכי הרלוונטית מבחינה קלינית להתוויות כמו סרטן ומחלות מטבוליות אחרות. הריאות היא מיטת הנימים הראשונה שנתקלה בו מתחמי siRNA / liposome המוזרקים לוריד וזה עשוי להסביר KD ITSN היעילהבריאות.

מגבלה אחת של המחקר היא הצבירה המתמשכת תלוית הזמן של יפוזומים קטיוני 2. כדי להתגבר על זה, מתחמי siRNA / liposome נמסרו זמן קצר (פחות משעה 2) אחרי הדור והשתמרו בקרח בכל העת לפני השימוש. ליפוזומים קטיוני קונבנציונליים, כגון אלה המשמשים במחקר שלנו מוצעים להיות מסומן על ידי מערכת reticulo-אנדותל. השיעור של עד-לקחת על ידי phagocytes יכול דה ירד ב PEGylation liposomal. ייצוב סטריים עם ציפוי פוליאתילן גליקול (PEG) מאריך את זמן מחזור "בזמן שיש ליפוזומים הפצה יותר אפילו tissular. גורמים אלה הפכו למאפיינים מאוד חשובים בטיפולים נגד הסרטן שבו הזרימה ממושכת של תרופות כימותרפיות היא רצויות 12.

בהקשר להליך EM, בכמויות הזעירות של רקמה נבחנת צריכים להיות מתוגמלים על ידי שיטתית ונרחב המורפולוגי ומוניתוח rphometric כמו גם על ידי בחינה של סעיפי סדרתי, בעת צורך.

בעוד המתודולוגיה שלנו מייעלת את לוח הזמנים של המינון למסירה מתמשכת ויעילות siRNA, דרושים מחקרים נוספים כדי להתמקד בזיהוי היעילות הגבוהה של המטרות הנכונות ועל הערכת הסיכון / תועלת פרמטרים מעורבות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות מענקי R01HL089462 לSP.

Materials

מבני endocytic / transcytotic לשלוט siRNA ITSN-1S, 72 שעות siRNA ITSN-1S, 24 ד
Caveolae לפתוח ללום * 106.6 ± 9.5 50.46 ± 4.8 87.15 ± 5.9
Caveolae כנראה חופשי בcytosol 173.5 ± 12.0 77.41 ± 6.3 143.0 ± 9.5
סה"כ caveolae (luminal וחופשי בcytosol) 280.1 ± 21.5 127.86 ± 11.1 230.14 ± 15.4
מבני endocytic נורמלים (הורחב endosomes) 2.65 ± 0.34 11.29 ± 2.7 14.93 ± 3.8
אשכולות Caveolae 3.95 ± 0.4 5.64 ± 1.6 11.3 ± 2.5
טבעות קרומי 1.33 ± 0.04 9.47 ± 2.4 12.8 ± 2.8
קשיות 0.88 ± 0.05 4.0 ± 1.3 18.84 ± 3.4
Name Company Catalog Number Comments
Dimethyl Dioctadecyl Ammonium Bromide (DOAB) Sigma-Aldrich D2779
LiposoFast stabilizer (mini-extruder) Avestin Inc. LF-STB
Polycarbonate membrane, 19 mm diameter, 50 nm pore Avestin Inc. LFM-50
Cholesterol Sigma-Aldrich C-8667
Chloroform Mallinckrodt Chemicals 4432-04
Hank's balanced salts Sigma-Aldrich H1387
Round-bottom flask Fisher Scientific FHB-275-030X
Mouse siRNAITSN - on target Dharmacon/ThermoScientific J-046912-11
Peristaltic pump Ismatec REGLO-CDF digital with RHOO pump head
Ventilator Hugo Sachs Electronik NA
Barbital Sigma-Aldrich B-0500
Uranyl acetate EM Sciences 22400
Epon812 EM Sciences Discontinued by the manufacturer
Propylene oxide EM Sciences 20400
Embedding molds EM Sciences 69923-05
Tannic acid EM Sciences 21710
8 nm gold-albumin tracer Prepared in the laboratory as in16
Comments
Equipped with 2 Avestin 1 ml gas-tight syringes (cat. # LF-1)
Pyrex, 100 ml
Modified siRNA, in vivo
Part of IDEX corp.
D-79232 March, Germany
Replaced with Embed812, cat. # 14120

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Predescu, S. A., Predescu, D. N., Knezevic, I., Klein, I. K., Malik, A. B. Intersectin-1s regulates the mitochondrial apoptotic pathway in endothelial cells. J. Biol. Chem. 282 (282), 17166-17178 (2007).
  2. Uddin, S. Cationic lipids used in non-viral gene delivery systems. Biotechnology and Molecular Biology Review. 2 (2), 58-67 (2007).
  3. Barenholz, Y., et al. Influence of lipid composition on the thermotropic behavior and size distribution of mixed cationic liposomes. J. Colloid Interface Sci. (356), 46-53 (2011).
  4. Predescu, D. N., Neamu, R., Bardita, C., Wang, M., Predescu, S. A. Impaired caveolae function and upregulation of alternative endocytic pathways induced by experimental modulation of intersectin-1s expression in mouse lung endothelium. Biochem. Res. Int.. (2012), 672705 (2012).
  5. Higuchi, Y., Kawakami, S., Hashida, M. Strategies for in vivo delivery of siRNAs: recent progress. BioDrugs. 24 (24), 195-205 (2010).
  6. Caracciolo, G., Amenitsch, H. Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes. Eur. Biophys. J. , (2012).
  7. Barnier Quer, C., Elsharkawy, A., Romeijn, S., Kros, A., Jiskoot, W. Cationic liposomes as adjuvants for influenza hemagglutinin: more than charge alone. Eur. J. Pharm. Biopharm. 81 (81), 294-302 (2012).
  8. Rai, K., et al. Liposomal delivery of MicroRNA-7-expressing plasmid overcomes epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor-resistance in lung cancer cells. Mol. Cancer Ther. (10), 1720-1727 (2011).
  9. McLean, J. W., et al. Organ-specific endothelial cell uptake of cationic liposome-DNA complexes in mice. Am. J. Physiol. (273), H387-H404 (1997).
  10. Soutschek, J., et al. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. (432), 173-178 (2004).
  11. Barenholz, Y. Liposomes enhance bioremediation of oil-contaminated soil. J. Liposome Res. (13), 1-8 (2003).
  12. Zamboni, W. C. Liposomal, nanoparticle, and conjugated formulations of anticancer agents. Clin. Cancer Res. (11), 8230-8234 (2005).
  13. Newman, M. S., Colbern, G. T., Working, P. K., Engbers, C., Amantea, M. A. Comparative pharmacokinetics, tissue distribution, and therapeutic effectiveness of cisplatin encapsulated in long-circulating, pegylated liposomes (SPI-077) in tumor-bearing mice. Cancer Chemother Pharmacol. (43), 1-7 (1999).
  14. Martino, S., et al. Efficient siRNA delivery by the cationic liposome DOTAP in human hematopoietic stem cells differentiating into dendritic cells. J. Biomed. Biotechnol. (2009), 410260 (2009).
  15. Zhang, G., et al. A delivery system targeting bone formation surfaces to facilitate RNAi-based anabolic therapy. Nat. Med. 18 (18), 307-314 (2012).
  16. Predescu, D., Palade, G. E. Plasmalemmal vesicles represent the large pore system of continuous microvascular endothelium. Am. J. Physiol. (265), H725-H733 (1993).
  17. Koh, T. W., Verstreken, P., Bellen, H. J. Dap160/intersectin acts as a stabilizing scaffold required for synaptic development and vesicle endocytosis. Neuron. (43), 193-205 (2004).
  18. Miyawaki-Shimizu, K., et al. Lung Cell Mol. Physiol. (290), L405-L413 (2006).

Tags

Bioengineering גיליון 76 ההנדסה ביו רפואית ביוכימיה גנטיקה ביולוגיה מולקולרית ביולוגיה תאית אנטומיה פיזיולוגיה רפואה אימונולוגיה פרמקולוגיה מודלים של בעלי חיים מחלות לב וכלי דם intersectin-1S siRNA ליפוזומים הזרקת רטרו מסלולית אקוטי וכרוני מציאה ITSN-1S עכברים מהונדסים תאי liposome אנדותל רקמה ריאות זלוף מיקרוסקופיה אלקטרונית מודל חיה
השתקה ארוכת טווח של Intersectin-1S בעכבר על ידי משלוח ריאות חוזר ונשנה של siRNA ספציפי באמצעות ליפוזומים קטיוני. הערכה של השפעות מציאה על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bardita, C., Predescu, D., Predescu, … More

Bardita, C., Predescu, D., Predescu, S. Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (76), e50316, doi:10.3791/50316 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter