Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Langsiktig stanse av Intersectin-1s i muselunger etter Gjentatt Levering av en spesifikk siRNA via Kationiske Liposomes. Evaluering av Knockdown Effekter av elektronmikroskopi

Published: June 21, 2013 doi: 10.3791/50316
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,2
1Department of Pharmacology, Rush University, 2Pulmonary and Critical Care Department, Rush University
* These authors contributed equally

Summary

Gjentatte retro-orbital injeksjoner av kationiske liposomes/siRNA/ITSN-1s komplekser i mus, hver 72. time i 24 dager, effektivt levere siRNA duplex til musen lunge microvasculature redusere ITSN-1s mRNA og protein uttrykk med 75%. Denne teknikken er svært reproduserbare i en dyremodell, og har ingen bivirkninger og unngår tap av menneskeliv.

Abstract

Tidligere studier viste at knockdown av ITSN-1s (KD ITSN), en endocytic protein som er involvert i regulering av lunge vaskulær permeabilitet og endotelceller (ECS) overlevelse, indusert celledød ved apoptose, et stort hinder i å utvikle en cellekultur system med langvarig ITSN-1s hemming en. Ved hjelp av kationiske liposomer som bærere, utforsket vi stanse all ITSN-1s genet i mus lungene ved systemisk administrasjon av siRNA rettet ITSN-1 genet (siRNA ITSN). Kationiske liposomer tilbyr flere fordeler for siRNA levering: safe med gjentatt dosering, nonimmunogenic, ikke giftig, og lett å produsere to. Liposomer ytelse og biologisk aktivitet avhenge av deres størrelse, ladning, lipidsammensetning, stabilitet, dose og administreringsmåten 3 Her, effektiv og spesifikk KD ITSN i muselunger har blitt oppnådd ved bruk av en kolesterol-og dimetyl dioctadecyl ammoniumbromid kombinasjon. Intravenøs leveringav siRNA ITSN / kationiske liposomoppløsninger komplekser forbigående slått ned ITSN-1s protein og mRNA i muselunger på dag 3, som utvinnes etter ytterligere tre dager. Benytte seg av de kationiske liposomer som en repeterbare sikker transportør, utvidet studie i 24 dager. Dermed ble retro-orbital behandling med fersk genererte komplekser administrert hver tredje dag, indusere vedvarende KD ITSN gjennom hele studien fire. Mus vev samlet på flere tidspunkter etter siRNA ITSN ble utsatt for elektronmikroskopi (EM) analyser for å evaluere effektene av kronisk KD ITSN, i lunge endotel. Høyoppløselig EM bildebehandling tillatt oss å vurdere morfologiske endringer forårsaket av KDITSN i lungene vaskulære sengen (dvs. forstyrrelser i endotelial barriere, redusert antall caveolae og oppregulering av alternative transportløsninger trasé), egenskaper som ikke påvises ved lysmikroskopi. Totalt disse funnene etablert et viktigtig rolle ITSN-1s i egenkapitalbevis funksjon og lunge homeostase, mens illustrerer effekten av siRNA-liposomer levering in vivo.

Introduction

Naken siRNA kan ikke trenge gjennom cellemembranen, blir negativt ladet, og det er lett degradert av enzymer i blod, vev og celler. Selv med nylig strukturelle modifikasjoner for å øke stabiliteten, er siRNA opphopning ved målsetet etter administrering ekstremt lav og krever en effektiv intracellulær kjøretøy 5.. Kationiske liposomer fremkom som trygge nukleinsyrer bærere med mulighet for å overføre store biter av DNA / RNA i celler ved å innkapsle og beskytte nukleinsyrer fra enzymatisk degradering 6.. Også kationiske liposomer spontant samhandle med DNA / RNA, noe som fremmer genoverføring til cellene 2. Mer nylig liposomer har blitt brukt til å levere vaksiner og lav-molekylær-vekt narkotika syv. Liposomal levering av microRNA-7-uttrykkende plasmid overvinner epidermal vekstfaktor-reseptor-tyrosinkinase-inhibitor-resistens i lungekreft celler 8. Når rettet motvaskulær endotel, er det intravenøs levering vesentlig fordi kompleksene er usannsynlig å krysse den endoteliske barrieren og extravasate inn til interstitium 9.. Ved sammenligning med andre organer ECS fra microvasculature av lungen har størst opptak og ivrig internalisere kationisk liposom og DNA / RNA-komplekser, etterfulgt av lymfeknuter og Peyer sin flekker 9. Intravenøs levering i gnager modeller av siRNA via retro-orbital eller hale vein injeksjoner har blitt bevist ufarlig selv i høye konsentrasjoner, for eksempel 50 mg / kg 10. I den publiserte litteratur sammensetningen av kationiske liposomer forskjellig, basert på formulering lipider og deres ekvimolart forhold 11, 12. Det er et bredt spekter av mulige bruksområder ved hjelp av kationiske liposomer for genet levering in vivo, enten målretting down-regulation/over-expression av proteiner, levering av vaksiner eller anti-tumor terapi 13-15. Viktig å huskeer at effektiviteten av DNA / RNA-cellulære membran interaksjon reguleres av formen kopling mellom tilført komplekser og membranlipider. Dette tyder på at skreddersy lipider sammensetningen til målrettede cellulære membransystemer profiler kan være gunstig og resultere i høye priser av transfeksjon i en bestemt celletype seks.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Kationiske Liposomes Forberedelse

  1. Autoklaver en ren rundkolbe som skal brukes for fremstilling lipososmes.
  2. Forbered lager løsninger:
    1. - Oppløs 200 mg dimetyl-dioctadecyl ammoniumbromid (DOAB) i 10 ml kloroform ved hjelp av en liten glassflaske.
    2. - Oppløs 200 mg kolesterol i 10 ml kloroform ved hjelp av en liten glassflaske.
    3. - Utarbeide og autoklaver å sterilisere 5% glukose i 100 ml av RNA / DNA-ase gratis destillert vann.
  3. Skyll rundkolbe med kloroform. Legg 5-10 ml til kolben, virvel, og la den sitte i noen minutter. Hold flasken dekket med aluminiumsfolie til enhver tid. Tømme kloroform fra kolben.
  4. Utarbeidelse av liposomer:
    1. - Til 315 mL av DOAB stamoppløsning til den rundkolbe.
    2. - Tilsett 200 pl av kolesterol stamløsning til kolben.
    3. - Til 9.5 ml kloroform til kolben ennd mix av virvel.
  5. Sett rotavapor ved 37 ° C, 100 omdreininger per minutt (rpm) eller mer (100-120 rpm). Den rotavapor skal kobles til en vann-pumpe vakuum kontroll med et sugerør skikkelig festet.
  6. Koble argon gass tank og rotavapor.
  7. Fest kolbe til rotavapor og justere de optimale innstillingene før du senker den i vannbad. Åpne den første ventilen for argon helt ved å vri den mot klokken. Alltid åpne og lukke ventilen først. Den andre ventil styrer argon trykket blåser inn til kolben. Trykket skal alltid være forsiktig.
  8. Senk rotavapor i vannbadet, nok til kolben for å berøre vannet uten å bli helt under vann og slå på hastigheten.
  9. Vent inntil all kloroformen fordampes, omtrent 10 min. Deretter stopper maskinen.
  10. Slå av rotavapor hastighet og argon tankventiler. Nå kolben bør fjernes.
  11. Tilsett 2 ml 5% glukose til the kolben for å oppløse lipidene.
  12. Skrap på bunnen av kolben grundig med 1 ml pipette for å oppløse alle lipidene. Etter skrape, fjerne eventuelle gjenværende lipid fra 1 ml tuppen inn i kolben, om nødvendig, med en andre spiss.
  13. Inkuber den erholdte oppløsning i 42 ° C vannbad mens sakte virvling (15 rpm) i kolben.
  14. Fyll sonicator vat med kaldt vann. Sonicate løsningen i minst 20-30 min med kolben holdt opp og bunnen så vidt i kontakt med vannet.
  15. Varm opp kolben i rotavapor sin vannbad i 20 min ved 42 ° C, ved null hastighet, med rund bunn nedsenket i vann, denne gang.
  16. Filtrer liposomene gjennom en 0,47 mikron og 0,22 mikron Deretter sprøytefiltre.
  17. Ved hjelp av en liten ekstruder, filtrer liposomene gjennom en 50 nm membran for å generere en homogen populasjon av unilamellære liposom-vesikler.
  18. Overfør liposomer til en Eppendorf rør og plassere den på is.

2. Forbered Liposomes: siRNA-ITSN-en Komplekser

  1. Resuspender på målet mus siRNA ITSN i siRNA-buffer inneholdende 20 mM HEPES og 150 mM natriumklorid, pH 7,4, til en sluttkonsentrasjon på 2 mg / mL. Hold det på is før blanding.
  2. Forbered liposomer: siRNA ITSN komplekser i forholdet 8 nmol liposomer: 2 mikrogram RNA (eller 400 nmol liposomer: 100 mikrogram siRNA ITSN). I denne studien har vi lagt 50 pl av siRNA ITSN fra stamløsning (50 mm) til 100 ul av nylagde liposomer ved hjelp av en RNA / DNA-ase gratis Eppendorf tube. Legg merke til at konsentrasjonen av siRNA ITSN er meget viktig fordi en maksimalt 150 pl av blandingen kan være bilateralt og retro-orbital injisert i mus på en gang.
  3. Hold blandingen på is i påvente av å injisere mus.

3. Mus Retro-orbital Vein Injection (Intern Vinkel av øyehulen)

jove_content "> Alle mus eksperimenter ble godkjent og utført i samsvar med retningslinjene fra Rush University Institutional Animal Care og bruk Committee.

  1. Anesthetize mus ved intra-peritoneal injeksjon av en 50 mg / kg kroppsvekt ketamin og 5 mg / kg kroppsvekt xylazin (kommersielt tilgjengelig blanding). Avhengig av dyrets vekt og alder, juster anestetika volum og konsentrasjon. Musene som brukes i studien mus er CD1 hannmus, 6-8 uker gamle og veier rundt 25 gram. Sprøytene er tuberkulin 1 ml type med kanylen på.
  2. Hold mus ører med den ene hånden og slå på mus ned på en side for å eksponere den indre vinkelen på øyet. Sikt medial til plica semilunaris, unngå å berøre øyeeplet.
  3. Nærmer lacrimal caruncle i øyet holde sprøyten inneholder blandingen i en 45 graders vinkel i alle tre akser.
  4. Sakte injisere blandingen og la musen til å gjenopprette med den injiserte siden opp. Hvis en stor væskedråpe former på nålen innsetting sted, trekke nålen, sug tilbake dråpen i sprøyten og prøv igjen. Gjentatte injeksjoner er best gjøres ved vekslende øynene, for å tillate perfekt utvinning. Hvis du er usikker, kan denne teknikken kontrolleres ved å injisere blått fargestoff (50 pl, 0,5% krystallfiolett i metanol) og utsette muselunger å observere den blå blodkar.
  5. Musene i studien ble injisert hver 3. dag i 3 uker uten dødsfall eller bivirkninger.

4. Mus Lung Perfusjons og Tissue Collection for biokjemiske studier

  1. Sett den peristaltiske pumpe for å kjøre ved 1,5 ml / min.
  2. Forbered innstillingen: ventilator, operasjonsbordet, instrumenter, sterile bomullspinner, q-tips, strenger, begre, destillert vann, Hank balanserte salt, tracer.
  3. Anesthetize mus ved intraperitoneal injeksjon av det anestetiske blandingen (100 mg / kg kroppsvekt ketamin og 10 mg / kg kroppsvekt xylazin). I halsen nivå, fjerne spyttkjertlene og avsløre luftrøret.
  4. Begynn med laparotomi, avgiftsdirektoratet mellomgulvet, og følg med Thoracotomi, utsette lungene og hjertet.
  5. Fjern thymus.
  6. Bruke lysmikroskopi for bedre nøyaktighet, kateteriserer lungearterien.
  7. Gjør tracheostomy og intubere musen bruker tracheostoma. Sett ventilator til en hastighet på 150 slag / min og slagvolum på 150 ul.
  8. Som uttak, åpne venstre atrium.
  9. Perfuse musen lunge vaskulaturen fri for blod i 5 min, ved hjelp av den peristaltiske pumpe og Hanks løsning ble oppvarmet ved 37 ° C.
  10. Perfuse sporstoffet (8 nm gull-albumin 16) for ytterligere 10 min ved samme strømningsrate.
  11. Skyll ubundet tracer etter 5 min lunge perfusjon med Hank løsning.
  12. Følg med in situ fiksering av lungene etter 10 min perfusjon av 4% (vekt / volum) formaldehyd, 2,5% glutaraldehyd og 1% garvesyre i 0,1 PIPESbuffer, pH 7,2.
  13. Samle lungene, fjerne overdreven vev, skjære små blokker (3/3 mm), og legg dem i en merket scintillasjonsflaske inneholder 2 ml av bindemiddel blanding.

Musene vil utløpe fullt bedøvet under inngrepet.

5. Mus Lung Tissue Processing for EM

  1. Forbered lager løsninger: 1% Palade 4 Oso, acetat veronal, og Kellenberger buffer.
    1. - 1% Palade-OSO 4 buffer inneholder: 1 ml acetat veronal lager, 1,25 ml 4% 4 OSO, 1 ml 0,1 N saltsyre, og destillert vann opp til 5 ml sluttvolum.
    2. - Acetat veronal-ningen blir oppnådd ved oppløsning av 1,15 g natriumacetat, andydrous og 2,94 g barbital i 100 ml destillert vann.
    3. -Kellenberger oppløsning inneholder 2 ml acetat veronal lager, 2,8 ml 0,1 N saltsyre, 0,05 g uranyl-acetat, og 5,1 mldestillert vann, pH = 6.
  2. Vask den tette blokkene i 0,1 M natrium-kakodylat-buffer, pH = 7,4, kort tre ganger.
  3. Fest prøvene i 4% (vekt / volum) formaldehyd, 2,5% glutaraldehyd i 0,1 PIPES-buffer, pH 7,2, i 1 time, ved romtemperatur.
  4. Post-fikse med 1% Palade-Osmium i 1 time i hetten, på is i mørket.
  5. Skyll en gang med Kellenberger buffer.
  6. Inkuber prøver i Kellenberger-buffer i 2 timer til over natten ved romtemperatur.
  7. Skyll en gang i 50% etanol.
  8. Dehydrate med gradert serie av etanol, 5 min / hver av: 70%, 95%, deretter 2 x 15 min 100% etanol.
  9. Bytte til 100% propylenoksyd, 2 x 15 min.
  10. Fjern propylenoksyd og tilsett en blanding av 50% propylenoksyd og 50% Epon 812, inkuberes over natten, roterer på et hjul, ved romtemperatur.
  11. Neste morgen, fjerne blandingen og tilsett frisk 812 Epon, i hvert fall for 4-5 timer på rattet.
  12. Ved hjelp doblet koniske former, fylthalvveis med frisk 100% Epon 812, legg utvalgte prøver og plassere dem til kantene.
  13. Beveg formene til inkubatoren satt til 60 ° C og la dem herde i 48-72 timer.
  14. Når polymerisert, sende blokkene til å være tynn (60-70 nm tykk) seksjoneres.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ITSN-1s protein og mRNA nivåene ble målt på flere tidspunkter etter siRNA ITSN levering av Western blot og konvensjonell og kvantitativ PCR som i fire. ITSN-1s protein og mRNA nivåer i siRNA ITSN-behandlede muselunger var omtrent 75% lavere ved henvisning til kontroller under kontinuerlig knockdown av ITSN-1s i 21 dager. Uten ITSN-1s, dynamin-2, er en viktig samspill partner av ITSN-1s og viktig aktør i avløsning av caveolae fra plasma membranen ikke effektivt rekruttert til endocytic området og dermed caveolae løsrivelse fra plasma membranen og dannelse av gratis vesicular bærere blir forstyrret 1, 17. Derfor, forårsaket ineffektive membran fisjon og nedsatt dannelse av frie vesikuløst bærere mangelfull endocytose og transendothelial transport, forstyrrelse av inter-endotelial barriere og lungeødem (figur 1). Videre nedregulering av ITSN-1s opp regulert alternativ transport trasé for å kompensere for mangelfull endocytose. Vi la merke til membran ringer (figur 2a og 2A1), pleomorphic tubuli (figur 2B), og forstørrede endosomes smeltet sammen med typiske caveolae (figur 2C) aktivt involvert i opptak og transport gull-albumin. En betydelig funn er nedgangen i caveolae nummer i ITSN-1s mangelfull mus lunge endotel ved henvisning til kontroller, Tabell 1. Langvarig ITSN-1s hemming for 24 dager ved gjentatt levering av kationiske liposomer / siRNA ITSN redusert lungeødem hos mus ved delvis å gjenopprette den inter-endotelial barriere integritet. EM morfologiske studier viste at 8Nm gull-albumin tracer ikke kunne trenge gjennom inter-endotelceller veikryss, på dette tidspunktet. I stedet, dannet de filtrerende rester i luminal Introitus av krysset (figur 3). Imidlertid viste de perivaskulære mellomrom noen dilatasjon og mildødem, noe som tyder på at knutepunktene er ugjennomtrengelig for denne størrelsen av partiklene, men likevel utett. Også de morfologiske mellomprodukter av alternative endocytiske trasé er aktive og til stede i høyere tall. Merkbart, indikerte morfometriske analyser at antall membranøs ring / tubuli merket med gull-albuminpartikler økt med 14 ganger i ITSN-1s kronisk mangelfull mus lunge endotelet i forhold til kontroller, Tabell 1. Caveolae nummeret er delvis restaurert, bare 17,8% nedgang, med henvisning til kontrollene. Dermed våre resultater viser at gjentatt levering av kationiske liposomer / siRNA ITSN komplekser er en egnet metode for å studere effekter av langvarig protein knockdown in vivo.

Figur 1
Figur 1. Representative elektron mikrografer viser åpne interendothelial veikryss (IEJs) merket throughout sin lengde av 8 nm gull-albuminpartikler. Arrowhead i A og forstørret a1, peker på tre, fire gull-albuminpartikler som ligger nær hverandre i samme plan, noe som indikerer det brede åpning av IEJ. Gold partikler er også forbundet med abluminal avkjørselen IEJs (A, B - piler). Legg også merke til det begrensede antall caveolae og utvidelse av pericapillary plass stk; skjult). Barer: 200 nm (A), 100 nm (B, a1).

Figur 2
Figur 2. Akutt forstyrrelse av ITSN-1s uttrykk induserer pleomorphic endocytiske / transcytotic mellomprodukter. Representant EM bilder av membran ringer (A, A1), rørformede elementer (B, piler) og forstørret endosomes (C, pilspisser), lastet med 8 nm gull-albumin og assosiert med caveolae-lignendemorfologi. Legg også merke til den alvorlige utvidelse av perivaskulær mellomrommet (PVS), og det proteinholdige ødem (A). Barer: 250 nm (A), 200 nm (B) 100 nm (a1, C).

Figur 3
Figur 3. Kronisk hemming av ITSN-1s uttrykk gjenoppretter delvis IEJ integritet. Filtrering rester i luminal Introitus av en IEJ (pilspiss). Mild dilatasjon (*) av PVS antyder leakiness av IEJs. Multivesikulære organer (MVB), i umiddelbar nærhet av plasma membran har noen av sine interne små blærer, merket med 8 nm gull albuminpartikler. Bar: 100 nm.

Tabell 1. Kronisk hemming av ITSN-1s uttrykk fører til aktivering av alternative endocytiske / transcytotic trasé og delvis gjenoppretter caveolae nummer. * Resultatene er normalisert per 100 mikrometer EC lengde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Basert på tidligere studier publisert av andre ni og en oss, 18 vi utviklet denne metoden for langsiktig slå ned av ITSN-1s in vivo ved gjentatt intravenøs administrasjon (hver 72 timer, i 24 sammenhengende dager) av spesifikke siRNA / liposomoppløsninger komplekser. Dette eksperimentelle tilnærmingen er effektiv, kan brukes trygt og gjentatte ganger, og det kan enkelt utvides til å studere involvering av et gen som koder for et protein av interesse i lunge endotelet og pulmonal homeostase. Under de eksperimentelle betingelsene satt opp av oss for gjentatt siRNA / liposomer levering, dukket mus normal uten tegn til toksisitet eller immunreaksjoner. Systemisk administrasjon av siRNA ITSN / liposomet komplekser er den mest klinisk relevant rute for indikasjoner som kreft og andre metabolske sykdommer. Lungene er den første kapillær seng støtt av siRNA / liposomen komplekser injisert intravenøst ​​og dette kan forklare effektiv KD ITSNi lungen.

En begrensning i studien er tidsavhengig kontinuerlig aggregering av kationiske liposomer to. For å overvinne det, ble siRNA / liposomen komplekser levert innen kort tid (mindre enn 2 timer) etter generasjon og bevart på is til alle tider før bruk. Konvensjonelle kationiske liposomer, for eksempel de som brukes i vår studie er foreslått å bli ryddet av retikuloendoteliale system. Frekvensen av opp-ta av fagocytter kan de redusert med liposomal pegylering. Sterisk stabilisering med polyetylenglykol (PEG) belegget forlenger liposomer 'sirkulasjonstid og samtidig ha en jevnere fordeling tissular. Disse faktorene blir svært viktige egenskaper i anti-kreft terapier hvor langvarig sirkulasjon av kjemoterapeutika er ønskelig 12.

Med hensyn til den EM-prosedyre, bør de små mengder av vev undersøkt oppveies ved systematisk og omfattende morfologiske og morphometric analyse samt ved undersøkelse av seriesnitt, når det er nødvendig.

Mens vår metodikk optimaliserer dosering tidsplan for vedvarende levering og siRNA effekten, er videre studier trengs for å fokusere på høy effektivitet identifisering av de riktige målene og om vurdering av risiko / fordeler parametere involvert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Health Grants R01HL089462 til SP.

Materials

Endocytiske / transcytotic strukturer Kontrollere ITSN-1s siRNA, 72 timer ITSN-1s siRNA, 24 d
Caveolae åpne til lumen * 106.6 ± 9.5 50.46 ± 4.8 87.15 ± 5.9
Caveolae tilsynelatende fritt i cytosol 173,5 ± 12,0 77,41 ± 6.3 143.0 ± 9.5
Totalt caveolae (luminal og gratis i cytosol) 280,1 ± 21,5 127,86 ± 11,1 230,14 ± 15,4
Unormale endocytiske strukturer (forstørret endosomes) 2,65 ± 0,34 11.29 ± 2.7 14.93 ± 3.8
Caveolae klynger 3,95 ± 0,4 5.64 ± 1.6 11,3 ± 2,5
Membran ringer 1,33 ± 0,04 9.47 ± 2.4 12,8 ± 2,8
Tubuli 0,88 ± 0,05 4.0 ± 1.3 18.84 ± 3.4
Name Company Catalog Number Comments
Dimethyl Dioctadecyl Ammonium Bromide (DOAB) Sigma-Aldrich D2779
LiposoFast stabilizer (mini-extruder) Avestin Inc. LF-STB
Polycarbonate membrane, 19 mm diameter, 50 nm pore Avestin Inc. LFM-50
Cholesterol Sigma-Aldrich C-8667
Chloroform Mallinckrodt Chemicals 4432-04
Hank's balanced salts Sigma-Aldrich H1387
Round-bottom flask Fisher Scientific FHB-275-030X
Mouse siRNAITSN - on target Dharmacon/ThermoScientific J-046912-11
Peristaltic pump Ismatec REGLO-CDF digital with RHOO pump head
Ventilator Hugo Sachs Electronik NA
Barbital Sigma-Aldrich B-0500
Uranyl acetate EM Sciences 22400
Epon812 EM Sciences Discontinued by the manufacturer
Propylene oxide EM Sciences 20400
Embedding molds EM Sciences 69923-05
Tannic acid EM Sciences 21710
8 nm gold-albumin tracer Prepared in the laboratory as in16
Comments
Equipped with 2 Avestin 1 ml gas-tight syringes (cat. # LF-1)
Pyrex, 100 ml
Modified siRNA, in vivo
Part of IDEX corp.
D-79232 March, Germany
Replaced with Embed812, cat. # 14120

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Predescu, S. A., Predescu, D. N., Knezevic, I., Klein, I. K., Malik, A. B. Intersectin-1s regulates the mitochondrial apoptotic pathway in endothelial cells. J. Biol. Chem. 282 (282), 17166-17178 (2007).
  2. Uddin, S. Cationic lipids used in non-viral gene delivery systems. Biotechnology and Molecular Biology Review. 2 (2), 58-67 (2007).
  3. Barenholz, Y., et al. Influence of lipid composition on the thermotropic behavior and size distribution of mixed cationic liposomes. J. Colloid Interface Sci. (356), 46-53 (2011).
  4. Predescu, D. N., Neamu, R., Bardita, C., Wang, M., Predescu, S. A. Impaired caveolae function and upregulation of alternative endocytic pathways induced by experimental modulation of intersectin-1s expression in mouse lung endothelium. Biochem. Res. Int.. (2012), 672705 (2012).
  5. Higuchi, Y., Kawakami, S., Hashida, M. Strategies for in vivo delivery of siRNAs: recent progress. BioDrugs. 24 (24), 195-205 (2010).
  6. Caracciolo, G., Amenitsch, H. Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes. Eur. Biophys. J. , (2012).
  7. Barnier Quer, C., Elsharkawy, A., Romeijn, S., Kros, A., Jiskoot, W. Cationic liposomes as adjuvants for influenza hemagglutinin: more than charge alone. Eur. J. Pharm. Biopharm. 81 (81), 294-302 (2012).
  8. Rai, K., et al. Liposomal delivery of MicroRNA-7-expressing plasmid overcomes epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor-resistance in lung cancer cells. Mol. Cancer Ther. (10), 1720-1727 (2011).
  9. McLean, J. W., et al. Organ-specific endothelial cell uptake of cationic liposome-DNA complexes in mice. Am. J. Physiol. (273), H387-H404 (1997).
  10. Soutschek, J., et al. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. (432), 173-178 (2004).
  11. Barenholz, Y. Liposomes enhance bioremediation of oil-contaminated soil. J. Liposome Res. (13), 1-8 (2003).
  12. Zamboni, W. C. Liposomal, nanoparticle, and conjugated formulations of anticancer agents. Clin. Cancer Res. (11), 8230-8234 (2005).
  13. Newman, M. S., Colbern, G. T., Working, P. K., Engbers, C., Amantea, M. A. Comparative pharmacokinetics, tissue distribution, and therapeutic effectiveness of cisplatin encapsulated in long-circulating, pegylated liposomes (SPI-077) in tumor-bearing mice. Cancer Chemother Pharmacol. (43), 1-7 (1999).
  14. Martino, S., et al. Efficient siRNA delivery by the cationic liposome DOTAP in human hematopoietic stem cells differentiating into dendritic cells. J. Biomed. Biotechnol. (2009), 410260 (2009).
  15. Zhang, G., et al. A delivery system targeting bone formation surfaces to facilitate RNAi-based anabolic therapy. Nat. Med. 18 (18), 307-314 (2012).
  16. Predescu, D., Palade, G. E. Plasmalemmal vesicles represent the large pore system of continuous microvascular endothelium. Am. J. Physiol. (265), H725-H733 (1993).
  17. Koh, T. W., Verstreken, P., Bellen, H. J. Dap160/intersectin acts as a stabilizing scaffold required for synaptic development and vesicle endocytosis. Neuron. (43), 193-205 (2004).
  18. Miyawaki-Shimizu, K., et al. Lung Cell Mol. Physiol. (290), L405-L413 (2006).

Tags

Bioteknologi Biomedical Engineering biokjemi genetikk molekylærbiologi cellebiologi anatomi fysiologi medisin immunologi farmakologi dyremodeller hjerte-og karsykdommer intersectin-1s siRNA liposomer retro-orbital injeksjon akutt og kronisk ITSN-1s knockdown transgene mus liposomoppløsninger endotelceller vev lunge perfusjon elektronmikroskopi dyremodell
Langsiktig stanse av Intersectin-1s i muselunger etter Gjentatt Levering av en spesifikk siRNA via Kationiske Liposomes. Evaluering av Knockdown Effekter av elektronmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bardita, C., Predescu, D., Predescu, … More

Bardita, C., Predescu, D., Predescu, S. Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (76), e50316, doi:10.3791/50316 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter