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Silenciando a longo prazo de Intersectin-1s nos pulmões do rato por entrega repetida de um siRNA específico via lipossomos catiônicos. Avaliação dos efeitos Knockdown por microscopia eletrônica

Published: June 21, 2013 doi: 10.3791/50316
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,2
1Department of Pharmacology, Rush University, 2Pulmonary and Critical Care Department, Rush University
* These authors contributed equally

Summary

Repetidas injeções de retro-orbital dos complexos liposomes/siRNA/ITSN-1s catiônicos em camundongos, a cada 72 horas por 24 dias, entregar eficientemente o duplex siRNA para a microcirculação do pulmão do rato reduzindo mRNA ITSN-1s e expressão da proteína em 75%. Esta técnica é altamente reprodutível num modelo animal, não tem efeitos adversos e evita mortes.

Abstract

Estudos anteriores mostraram que o knockdown de ITSN-1s (KD ITSN), uma proteína envolvida na regulação de endocitose permeabilidade vascular pulmonar e células endoteliais (ECs) a sobrevivência, a morte celular induzida por apoptose, um obstáculo importante no desenvolvimento de um sistema de cultura celular, com períodos prolongados ITSN-1s inibição 1. Usando lipossomas catiônicos como carreadores, exploramos o silenciamento do gene ITSN-1s nos pulmões do rato pela administração sistêmica de siRNA visando ITSN-1 gene (ITSN siRNA). Lipossomas catiônicos oferecem várias vantagens para entrega siRNA: cofre com doses repetidas, não imunogénico, não tóxico, e fácil de produzir 2. Lipossomas desempenho e actividade biológica depende do seu tamanho, carga, a composição lipídica, a estabilidade, a dose e via de administração de 3 Aqui, eficiente e ITSN KD específica em pulmões do rato foi obtida utilizando uma combinação de colesterol dioctadecil brometo de amónio e dimetil. Entrega intravenosade ITSN siRNA / complexos de lipossomas catiônicos transitoriamente derrubado proteína ITSN-1s e mRNA em pulmões de ratos no dia 3, que se recuperou depois de mais 3 dias. Aproveitando os lipossomas catiónicos como um transportador segura repetível, o estudo alargado para 24 dias. Assim, o tratamento retro-orbital com complexos recém-gerados foi administrado a cada 3 dias, induzindo ITSN KD sustentado ao longo do estudo 4. Tecidos de camundongos coletadas em vários pontos tempo ITSN pós-siRNA foram submetidos a análises de microscopia eletrônica (ME) para avaliar os efeitos da crônica KD ITSN, no endotélio pulmonar. High-resolution EM imagens nos permitiu avaliar as alterações morfológicas causadas por KDITSN no leito vascular pulmonar (ou seja, o rompimento da barreira endotelial, diminuição do número de caveolae e regulação positiva de vias de transporte alternativos), características não-detectável por microscopia de luz. Em geral estes resultados estabeleceu um importantetante papel de ITSN-1s na função de ECs e homeostase do pulmão, enquanto que ilustra a eficácia da prestação de siRNA lipossomas in vivo.

Introduction

SiRNA Nu não pode penetrar na membrana da célula, a ser carregada negativamente, e que é facilmente degradado por enzimas no sangue, tecidos e células. Até recentemente, com modificações estruturais para melhorar a estabilidade, a acumulação de siRNA no local alvo depois da administração é extremamente baixo e requer um veículo intracelular eficiente 5. Lipossomas catiónicos emergiu como seguros transportadoras ácidos nucleicos com o potencial de transferência de grandes pedaços de DNA / RNA em células, encapsulando e protegendo os ácidos nucleicos a partir da degradação enzimática 6. Além disso, lipossomas catiónicos interagem espontaneamente com o ADN / ARN, promovendo assim a transferência de genes para as células 2. Mais recentemente, os lipossomas têm sido aplicadas para proporcionar vacinas e os medicamentos de baixo peso molecular 7. Entrega lipossomal de microRNA-7-expressando plasmídeo supera receptor do factor de crescimento epidérmico tirosina-quinase inibidor de resistência em células de cancro do pulmão 8. Quando visando oendotélio vascular, a administração intravenosa é essencial porque os complexos que não são susceptíveis de atravessar a barreira endotelial e extravasamento para o interstício 9. Em comparação com outros órgãos, ECs da microvasculatura do pulmão têm a maior absorção e avidamente internalizar lipossoma catiónico e complexos de ADN / ARN, seguido dos gânglios linfáticos e placas de Peyer 9. Entrega intravenosa em modelos de roedores de siRNA através de injecções veia retro-orbital ou cauda foi provado inofensivos mesmo em concentrações elevadas, tais como 50 mg / kg 10. Na literatura publicada a composição de lipossomas catiónicos é diferente, com base na formulação de lípidos e a sua razão molar 11, 12. Existe uma grande variedade de aplicações potenciais utilizando lipossomas catiónicos para a distribuição de genes in vivo, quer visando down-regulation/over-expression das proteínas, a entrega de vacinas ou de terapias anti-tumorais 13-15. Importante lembraré que a eficiência da interacção de membrana de DNA / RNA celular é regulada pela forma de acoplamento entre os complexos gerados e lípidos de membrana. Isto sugere que a adaptação da composição para os perfis de lípidos da membrana celular alvo pode ser benéfico e resultam em elevadas taxas de transfecção num determinado tipo de célula 6.

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Protocol

1. Os lipossomas catiônicos Preparação

  1. Autoclave um balão de fundo redondo limpo para ser usado para a preparação lipososmes.
  2. Preparar soluções estoque:
    1. - Dissolve-se 200 mg de dimetil dioctadecil brometo de amónio (Doab) em 10 ml de clorofórmio, usando um pequeno frasco de vidro.
    2. - Dissolve-se 200 mg de colesterol em 10 ml de clorofórmio através de um pequeno frasco de vidro.
    3. - Preparar e autoclave para esterilizar a 5% de glucose em 100 ml de DNA / RNA-ase livre de água destilada.
  3. Lavar o balão de fundo redondo com clorofórmio. Adicionar 5-10 ml para o frasco, redemoinho, e deixe descansar por alguns minutos. Manter o frasco coberto com folha de alumínio em todas as vezes. Esvaziar o clorofórmio, a partir do balão.
  4. Preparação de lipossomas:
    1. - Adicionar 315 ml de solução estoque Doab ao balão de fundo redondo.
    2. - Adicionar 200 ul de solução de estoque de colesterol para o balão.
    3. - Adicionar 9,5 ml de clorofórmio a um frascoª misture redemoinho.
  5. Definir o evaporador rotativo a 37 ° C, 100 rotações por minuto (rpm) ou superior (100-120 rpm). O evaporador rotativo deve estar conectado a um controlo no vácuo da bomba de água com um tubo de sucção conectado correctamente.
  6. Conecte o tanque de gás argônio e do evaporador rotativo.
  7. Fixe o balão ao evaporador rotativo e ajustar as configurações ideais antes de baixá-lo em banho-maria. Abra a primeira válvula para o argônio completamente, transformando-horário. Sempre abrir e fechar esta válvula em primeiro lugar. A segunda válvula controla a pressão de árgon de sopro para o balão. A pressão deve ser sempre suave.
  8. Baixar o rotavapor em banho de água, suficiente para que o balão ao tocar na água sem ser completamente submerso e girar sobre a velocidade.
  9. Espere até que todos os clorofórmio evapora, cerca de 10 min. Em seguida, parar a máquina.
  10. Desligue a velocidade rotavapor e as válvulas do tanque de argônio. Agora, o frasco deve ser removido.
  11. Adicionar 2 ml de glicose a 5% para pofrasco e para dissolver os lípidos.
  12. Raspe o fundo do balão, cuidadosamente, com ponta de pipeta de 1 ml para dissolver todos os lípidos. Depois de riscar, remover qualquer lípido remanescente a partir de 1 ml de ponta para o balão, se necessário, com uma segunda ponta.
  13. Incubar a solução obtida em banho-maria a 42 ° C enquanto lentamente vórtice (15 rpm) ao balão.
  14. Encha a cuba de ultra-sons com água fria. Sonicate a solução para pelo menos 20-30 min com o frasco levantou e inferior apenas mal contato com a água.
  15. Aquecer o balão num banho de água do evaporador rotativo durante 20 minutos a 42 ° C, à velocidade zero, com o fundo redondo, imersa em água, este tempo.
  16. Filtrar os lipossomas através de uma 0,47 micron e, subsequentemente, filtros de seringa de 0,22 micron.
  17. Usando um pequeno extrusor, filtrar os lipossomas através de uma membrana de 50 nm para gerar uma população homogénea de vesículas lipossómicas unilamelares.
  18. Transfira os lipossomas para um tubo Eppendorf e colocá-lo em gelo.

2. Preparar os lipossomas: siRNA ITSN-1 Complexos

  1. Ressuspender o rato no alvo ITSN siRNA siRNA em tampão contendo HEPES 20 mM e cloreto de sódio 150 mM, pH 7,4, para uma concentração final de 2 mg / mL. Mantê-lo no gelo antes de misturar.
  2. Preparar os complexos de lipossomas: ITSN siRNA na proporção de 8 nmol de lipossomas: 2 ug de RNA (ou 400 nmol de lipossomas: 100 ug ITSN siRNA). No presente estudo, foram adicionados 50 ul de ITSN siRNA a partir da solução de estoque (50 mM) a 100 ul de lipossomas preparados de fresco utilizando um DNA / RNA-ase livre do tubo de Eppendorf. Note-se que a concentração de ITSN siRNA é muito importante, porque um máximo de 150 ul de mistura pode ser bilateralmente e retro-orbital injectado no rato de uma só vez.
  3. Manter a mistura em gelo, enquanto espera para injectar os ratinhos.

3. Rato retro-orbital Injection Veia (ângulo interno do soquete do olho)

jove_content "> foram aprovados e realizados todos os experimentos com camundongos, de acordo com as diretrizes da Rush University Animal Care Institucional e Comitê de uso.

  1. Anestesiar o rato através de injecção intra-peritoneal de um mg / kg de peso 50 corporal de cetamina e 5 mg / kg de peso corporal de xilazina (mistura comercialmente disponível). Dependendo da idade e do peso do animal, ajustar o volume e concentração de anestésicos. Os ratinhos utilizados no estudo os ratinhos são ratinhos CD1 machos, de 6-8 semanas de idade e pesam cerca de 25 gramas. As seringas são um tipo tuberculina ml com agulha acoplada.
  2. Segurar orelhas de rato com uma mão e transformar o mouse de um lado para expor o ângulo interno do olho. Aponte medial à prega semilunar, evite tocar no globo ocular.
  3. Approach as caruncle lacrimal do olho, segurando a seringa contendo a mistura em um ângulo de 45 graus em todos os três eixos.
  4. Injecte lentamente a mistura e deixe o mouse para se recuperar com o lado injetado up. Se um grande líquidaformas de gotas no local de inserção da agulha, retirar a agulha de sucção, de volta a gota dentro da seringa e tente novamente. Injeções repetidas são o melhor feito pela alternância dos olhos, para permitir a recuperação perfeita. Em caso de dúvida, esta técnica pode ser verificada por injecção de tinta azul (50 ul, 0,5% de violeta de cristal em metanol) e expondo os pulmões do rato para observar a vasculatura azul.
  5. Os ratos no estudo foram injetados cada 3 º dia por 3 semanas sem mortes ou efeitos adversos.

4. Rato de perfusão pulmonar e coleta de tecido para estudos bioquímicos

  1. Conjunto de bomba peristáltica para executar a 1,5 ml / min.
  2. Prepare o ambiente: ventilador, mesa de operações, instrumentos, cotonetes estéreis, Q-dicas, cordas, copos, água destilada salina balanceada de Hank, tracer.
  3. Anestesiar o rato através de injecção intraperitoneal do anestésico mistura (100 mg / kg de peso corporal de cetamina e 10 mg / kg de peso corporal de xilazina). Ao nível do pescoço, remova as glândulas salivares e expor a traquéia.
  4. Comece com laparotomia, consumo do diafragma, e seguir com a toracotomia, expondo os pulmões eo coração.
  5. Remover o timo.
  6. Usando a microscopia de luz para uma melhor precisão, cateterização da artéria pulmonar.
  7. Fazer traqueostomia e entubar o mouse usando o traqueostoma. Defina o ventilador a uma taxa de 150 golpes / min e volume de golpe de 150 mL.
  8. Como saída, abra o átrio esquerdo.
  9. Perfundir vasculatura do pulmão do rato livre de sangue durante 5 minutos, utilizando a bomba peristáltica e solução de Hank aquecida a 37 ° C.
  10. Perfundir traçador (8 nm de ouro albumina-16) para 10 min adicionais à mesma taxa de fluxo.
  11. Lave o traçador não ligado por 5 min de perfusão pulmonar com solução de Hank.
  12. Siga com a fixação in situ dos pulmões por 10 min de perfusão de 4% (peso / vol) de formaldeído, glutaraldeído a 2,5%, e 1% de ácido tânico 0,1 TUBOStampão a pH 7,2.
  13. Recolher os pulmões, remover o excesso de tecido, cortar blocos pequenos (3/3 mm), e colocá-los num frasco de cintilação contendo 2 ml rotulados de mistura fixador.

Os ratos expirará totalmente anestesiado durante o procedimento.

5. Rato Lung processamento de tecidos para a EM

  1. Preparar soluções stock: 1% Palade OsO4, acetato de veronal, e tampão Kellenberger.
    1. - De 1% de OsO-Palade tampão 4 contém: 1 ml de caldo de veronal de etilo, 1,25 ml de 4% de OsO 4, 1 ml de ácido clorídrico 0,1 N, e água destilada até 5 ml de volume final.
    2. - Solução de acetato de veronal é obtido por dissolução de 1,15 g andydrous acetato de sódio e 2,94 g de derivado do ácido barbitúrico em 100 ml de água destilada.
    3. Solução-Kellenberger contém 2 ml de acetato de estoque Veronal, 2,8 ml de 0,1 N de ácido clorídrico, 0,05 g de acetato de uranilo, e 5,1 mlde água destilada, pH = 6.
  2. Lave os blocos de pulmão em 0,1 M de cacodilato de sódio, pH = 7,4, resumidamente três vezes.
  3. Fixar as amostras em 4% (p / v) de formaldeído, 2,5% de glutaraldeído em tampão de 0,1 PIPES, pH 7,2, durante 1 hora, à temperatura ambiente.
  4. Pós-fix com 1% Palade-ósmio para 1 hora no capô, no gelo, no escuro.
  5. Lavar uma vez com tampão Kellenberger.
  6. Incubar as amostras em tampão de Kellenberger durante 2 horas durante a noite, à temperatura ambiente.
  7. Lavar uma vez em etanol a 50%.
  8. Desidratam com série gradual de etanol, 5 min / cada um: 70%, 95%, depois 2 x 15 min 100% de etanol.
  9. Alternar a 100% de óxido de propileno, 2 x 15 min.
  10. Remover o óxido de propileno e adicionar uma mistura de 50% de óxido de propileno e 50% de Epon 812, incubar durante a noite, em uma roda rotativa, à temperatura ambiente.
  11. Na manhã seguinte, retire a mistura e adicione Epon fresco 812, pelo menos por 4-5 horas no volante.
  12. Usando moldes cônicos dobrou, cheiasno meio do caminho com frescos 100% Epon 812, adicionar espécimes selecionados e colocá-los para as bordas.
  13. Mover os moldes para a incubadora a 60 ° C e deixá-los curar durante 48-72 hr.
  14. Quando polimerizado, enviar os blocos para ser magra (60-70 nm de espessura) seccionado.

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Representative Results

Os níveis de proteína ITSN-1s e ARNm foram monitorizadas a vários pontos de tempo após a entrega siRNA ITSN por Western blot e por PCR convencional e quantitativas como no 4. Os níveis de proteína ITSN-1s e ARNm em siRNA ITSN pulmões de ratinho foram tratadas com cerca de 75% menor, por referência aos controlos durante o knockdown contínua de ITSN-1s durante 21 dias. Sem ITSN-1s, dinamina-2, um parceiro importante interagindo de jogador ITSN-1s e essencial no descolamento da caveolae a partir da membrana de plasma não é eficazmente recrutadas para o local de endocitose e, assim, descolamento caveolae a partir da membrana plasmática e formação de vesicular livre transportadoras é interrompido 1, 17. Assim, a cisão membrana ineficaz e deficiente formação de transportadores vesiculares livres causada endocitose e transporte deficiente transendotelial, a interrupção da barreira inter-endotelial e edema pulmonar (Figura 1). Além disso, estabelece-regulação da ITSN-1s-se regulado alternativa transport caminhos para compensar endocitose deficiente. Percebemos anéis membranosas (Figuras 2A e 2a1), túbulos pleomórficos (Figura 2B), e ampliado endosomes fundidos com caveolae típico (Figura 2C) ativamente envolvidos na absorção e transporte de ouro albumina. Uma descoberta importante é a diminuição do número de ITSN caveolae-1s deficiente endotélio do pulmão do rato por referência aos controlos, a Tabela 1. Inibição ITSN-1s prolongado para 24 dias por distribuição repetida de lipossomas catiónicos / ITSN siRNA reduziu o edema pulmonar em ratinhos por restaurar parcialmente a integridade da barreira inter-endotelial. EM estudos morfológicos revelaram que a 8nm traçador ouro albumina não podia penetrar nas junções entre endoteliais, neste ponto de tempo. Em vez disso, eles formaram resíduos de filtração do intróito luminal da junção (Figura 3). No entanto, os espaços perivasculares e mostrou alguma dilatação ligeiraedema, sugerindo que as junções são impermeáveis ​​a este tamanho das partículas, mas ainda permeável. Além disso, os intermediários morfológicos de caminhos alternativos são endocíticas ativa e presente em maior número. Notavelmente, as análises morfométricas indicou que o número de anel membranoso / túbulos rotulado por partículas de ouro albumina aumentou 14 vezes na ITSN-1s deficiente endotélio pulmonar crónica do rato quando comparado com os controlos, a Tabela 1. Número Caveolae é parcialmente restaurada, apenas 17,8% de redução, por referência aos controlos. Assim, os nossos resultados demonstram que a administração repetida de lipossomas catiónicos / complexos ITSN siRNA é uma metodologia adequada para estudar os efeitos da proteína knockdown a longo prazo in vivo.

Figura 1
Figura 1. Representante de microscopia eletrônica mostrando cruzamentos interendoteliais abertos (IEJs) marcado ªroughout seu comprimento por 8 nm de partículas de ouro-albumina. ponta de seta A e ampliada a1, aponta para três a quatro partículas de ouro albumina localizados perto um do outro no mesmo plano, indicativas da grande abertura da IEJ. As partículas de ouro, também estão associados com a saída de abluminal IEJs (a, b - setas). Note-se também o número limitado de caveolae e dilatação das peças espaço pericapilar; asteriscos). Bares: 200 nm (A), 100 nm (B, a1).

Figura 2
Figura 2. Perturbação aguda de expressão ITSN-1s induz pleomórficos endocíticas / transcytotic intermediários. Representante EM imagens de anéis membranosas (A, a1), elementos tubulares (B, setas) e alargada endosomes (C, pontas de seta), carregado com 8 nm de ouro-albumina e associado com caveolae-likemorfologia. Note-se também que a dilatação severa do espaço perivascular (PVS), e o edema proteico (A). Bares: 250 nm (A), 200 nm (B) 100 nm (A1, C).

Figura 3
Figura 3. Inibição crônica da expressão ITSN-1s restaura parcialmente integridade IEJ. Resíduos de filtração no introit luminal de um IEJ (seta). Dilatação leve (*) dos pvs sugere leakiness dos IEJs. Corpos multivesiculares (MVB), nas proximidades da membrana plasmática tem algumas de suas pequenas vesículas internas, marcados por 8 nm de ouro partículas de albumina. Bar: 100 nm.

Tabela 1. Inibição crônica da expressão ITSN-1s provoca a ativação de vias de endocitose / transcytotic alternativas e restaura parcialmente número caveolae. * Os resultados são normalizados por 100 mM comprimento CE.

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Discussion

Com base em estudos anteriores publicadas por outros 9 e nos 1, 18 que desenvolvemos esta metodologia para o longo prazo derrubar de ITSN-1s in vivo pela administração intravenosa repetida (cada 72 horas, durante 24 dias consecutivos) de siRNA específico / complexos de lipossomas. Esta abordagem experimental é eficiente, pode ser utilizado de forma segura e repetida e pode ser facilmente estendido para estudar o envolvimento de um gene que codifica toda a proteína de interesse no endotélio pulmonar e homeostase pulmonar. Sob as condições experimentais criadas por nós para siRNA repetida / entrega de lipossomas, os camundongos pareciam normais, sem sinais de toxicidade ou respostas imunes. A administração sistêmica de siRNA ITSN / lipossomas complexos é a rota mais clinicamente relevantes para as indicações como câncer e outras doenças metabólicas. O pulmão é o primeiro leito capilar encontrado pelos complexos siRNA / lipossomas por via intravenosa e isso pode explicar a eficiência KD ITSNno pulmão.

Uma limitação do estudo é o tempo de agregação contínuo dependente de lipossomas catiónicos 2. Para superar isto, os complexos de siRNA / lipossoma foram entregues pouco (menos de 2 horas), após geração e conservados em gelo em todos os momentos antes da utilização. Lipossomas catiônicos convencionais, como os usados ​​em nosso estudo são propostas para ser eliminado pelo sistema retículo-endotelial. A taxa de up-take pelos fagócitos pode de diminuiu pegilação lipossomal. Estabilização estérica com revestimento de polietileno glicol (PEG), prolonga o tempo de circulação "lipossomas, tendo uma distribuição mais uniforme tecidual. Estes factores tornam-se características muito importantes em terapias anti-cancro em que a circulação prolongada dos agentes quimioterapêuticos é desejado 12.

No que diz respeito ao procedimento de EM, as quantidades diminutas de examinaram o tecido deve ser compensada por sistemática e extensa morfológica e moanálise rphometric, bem como por exame de cortes seriados, quando necessário.

Enquanto a nossa metodologia otimiza a posologia para entrega sustentada e eficácia siRNA, mais estudos são necessários para se concentrar na identificação de alta eficiência dos alvos certos e na avaliação de risco / benefício parâmetros envolvidos.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Bolsas de Saúde R01HL089462 para SP.

Materials

Estruturas endocíticas / transcytotic Controle SiRNA ITSN-1s, 72 hr SiRNA ITSN-1s, 24 d
Caveolae abrir para a luz * 106,6 ± 9,5 50,46 ± 4,8 87,15 ± 5,9
Caveolae aparentemente livre no citosol 173,5 ± 12,0 77,41 ± 6,3 143,0 ± 9,5
Total de caveolae (luminal e livre no citoplasma) 280,1 ± 21,5 127,86 ± 11,1 230,14 ± 15,4
Endocíticas estruturas anormais (ampliado endosomes) 2,65 ± 0,34 11,29 ± 2,7 14,93 ± 3,8
Cachos caveolae 3,95 ± 0,4 5,64 ± 1,6 11,3 ± 2,5
Anéis membranosas 1,33 ± 0,04 9,47 ± 2,4 12,8 ± 2,8
Túbulos 0,88 ± 0,05 4,0 ± 1,3 18,84 ± 3,4
Name Company Catalog Number Comments
Dimethyl Dioctadecyl Ammonium Bromide (DOAB) Sigma-Aldrich D2779
LiposoFast stabilizer (mini-extruder) Avestin Inc. LF-STB
Polycarbonate membrane, 19 mm diameter, 50 nm pore Avestin Inc. LFM-50
Cholesterol Sigma-Aldrich C-8667
Chloroform Mallinckrodt Chemicals 4432-04
Hank's balanced salts Sigma-Aldrich H1387
Round-bottom flask Fisher Scientific FHB-275-030X
Mouse siRNAITSN - on target Dharmacon/ThermoScientific J-046912-11
Peristaltic pump Ismatec REGLO-CDF digital with RHOO pump head
Ventilator Hugo Sachs Electronik NA
Barbital Sigma-Aldrich B-0500
Uranyl acetate EM Sciences 22400
Epon812 EM Sciences Discontinued by the manufacturer
Propylene oxide EM Sciences 20400
Embedding molds EM Sciences 69923-05
Tannic acid EM Sciences 21710
8 nm gold-albumin tracer Prepared in the laboratory as in16
Comments
Equipped with 2 Avestin 1 ml gas-tight syringes (cat. # LF-1)
Pyrex, 100 ml
Modified siRNA, in vivo
Part of IDEX corp.
D-79232 March, Germany
Replaced with Embed812, cat. # 14120

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References

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Bardita, C., Predescu, D., Predescu, … More

Bardita, C., Predescu, D., Predescu, S. Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (76), e50316, doi:10.3791/50316 (2013).

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