Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Долгосрочные молчание интерсектин-1 в легких мышей по повторной сдачи Конкретные миРНК через катионные липосомы. Оценка нокдаун эффекты электронной микроскопией

Published: June 21, 2013 doi: 10.3791/50316
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,2
1Department of Pharmacology, Rush University, 2Pulmonary and Critical Care Department, Rush University
* These authors contributed equally

Summary

Повторные ретро-орбитальной инъекции катионные комплексы liposomes/siRNA/ITSN-1s у мышей, каждые 72 часа в течение 24 дней, эффективной доставки миРНК дуплекс с микрососудов легких у мышей снижение ITSN-1 мРНК и экспрессию белка на 75%. Этот метод хорошо воспроизводимый в животной модели, не имеет побочных эффектов и позволяет избежать летальных исходов.

Abstract

Предыдущие исследования показали, что нокдаун ITSN-1S (KD ITSN), эндоцитотический белок, участвующий в регуляции проницаемости сосудов легких и эндотелиальные клетки (ECS) выживание, индуцированного апоптоза, основным препятствием в развитии системы клеточных культур с длительным ITSN-1S торможения 1. Использование катионных липосом в качестве носителей, мы исследовали молчание ITSN-1 гена в легких мышей при системном введении миРНК ориентации ITSN-1 ген (миРНК ITSN). Катионные липосомы обладают рядом преимуществ для доставки миРНК: Допускаются повторные дозировки, неиммуногенные, нетоксичны и легко производить 2. Липосомы производительности и биологической активности зависит от их размера, заряда, липидный состав, стабильность, доза и способ введения 3 Здесь, эффективный и специфический KD ITSN в легких мышей были получены с использованием холестерина и диметил диоктадецил сочетание бромид аммония. Внутривенного введениямиРНК ITSN / катионной липосомы комплексы временно сбил ITSN-1 белка и мРНК в легких мышей на 3 день, который восстановился после еще ​​3 дня. Воспользовавшись тем, что катионные липосомы как безопасного перевозчика, повторяемые, исследование продлен на 24 дней. Таким образом, ретроорбитальной лечения с только что созданной комплексы вводили каждые 3 дня, вызывая устойчивый KD ITSN на протяжении всего исследования 4. Мышь ткани, собранные в нескольких временных точках после миРНК ITSN подвергали электронной микроскопии (ЭМ) анализы, чтобы оценить эффекты хронического KD ITSN, в легких эндотелия. Высокое разрешение изображения EM позволило нам оценить морфологические изменения, вызванные KDITSN в постели легких сосудистого (т.е. разрушение эндотелиального барьера, снижение количества кавеолы ​​и активацию альтернативные пути транспортировки), характеристики необнаруженными с помощью световой микроскопии. Общая этих выводов установленным важноеважную роль ITSN-1 в функции ЭКС и легких гомеостаза, а иллюстрирующие эффективность миРНК-липосомы доставки в естественных условиях.

Introduction

Голые миРНК не может проникать через клеточную мембрану электрический заряд, и она легко разрушается ферментами в крови, тканей и клеток. Даже недавно структурных модификаций для улучшения стабильности, миРНК накопление в сайте-мишени после введения чрезвычайно низка и требует эффективного внутриклеточных транспортных средств 5. Катионные липосомы стала безопасной нуклеиновых кислот носителей с потенциалом для передачи больших фрагментов ДНК / РНК в клетки путем инкапсуляции и защиты нуклеиновых кислот из ферментативного расщепления 6. Кроме того, катионные липосомы спонтанно взаимодействуют с ДНК / РНК, тем самым способствуя переноса генов в клетки 2. Совсем недавно липосомы были применены для доставки вакцин и низким молекулярным весом препаратов 7. Липосомальной доставки микроРНК-7, экспрессирующих плазмид преодолевает рецептора эпидермального фактора роста ингибитор тирозинкиназы сопротивление в клетках рака легких 8. При ориентациисосудистого эндотелия, внутривенного введения важно, потому что комплексы вряд ли пересечь барьер эндотелиальных и вытекать из сосудов в ткань и интерстиций 9. По сравнению с другими органами, КЕ из микрососудов легких имеют наибольшее поглощение и жадно интернализации катионной липосомы и ДНК / РНК комплексов, а затем в лимфатических узлах и пейеровых бляшек 9. Внутривенное доставки на моделях грызунов миРНК через ретро-орбитальной или хвостовой вены инъекций было доказано безвредны даже в высоких концентрациях, например, 50 мг / кг 10. В опубликованной литературе состав катионные липосомы отличается на основе липидов разработки и их эквимол рном соотношении 11, 12. Существует широкий спектр потенциальных приложений с использованием катионных липосом для доставки генов в естественных условиях, будь таргетинга down-regulation/over-expression белков, поставка вакцин или противоопухолевой терапии 13-15. Важно помнить,является то, что эффективность ДНК / РНК-клеточное взаимодействие мембраны регулируется форма связи между генерируется комплексов и мембранных липидов. Это предполагает, что пошива липиды состав к целевой сотовой профилей мембрана может быть полезно и в результате высокий уровень трансфекции в конкретном типе клеток 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Катионные липосомы подготовка

  1. Автоклав чистую круглодонную колбу, которые будут использоваться для подготовки lipososmes.
  2. Подготовка исходных растворов:
    1. - Растворить 200 мг диметил диоктадецил бромид (Doab) в 10 мл хлороформа с помощью небольшой стеклянной бутылки.
    2. - Растворить 200 мг холестерина в 10 мл хлороформа с помощью небольшой стеклянной бутылки.
    3. - Подготовка и автоклав для стерилизации 5% глюкозы в 100 мл РНК / ДНК-азы бесплатно дистиллированной воды.
  3. Промойте круглодонную колбу хлороформом. Добавить 5-10 мл в колбу, вихря, и оставьте на несколько минут. Держите колбу, покрытую алюминиевой фольгой во все времена. Слейте хлороформа из колбы.
  4. Получения липосом:
    1. - Добавить 315 мкл исходного раствора Doab в круглодонную колбу.
    2. - Добавить 200 мкл раствора холестерина в колбу.
    3. - Добавить 9.5 мл хлороформа в колбуй смешать вихрем.
  5. Установка роторном испарителе при 37 ° С, 100 оборотов в минуту (RPM) или более (100-120 оборотов в минуту). Роторном испарителе должен быть подключен к воде вакуумный насос управления с всасывающей трубкой правильно установлены.
  6. Подключите бак аргоном и роторного испарителя.
  7. Прикрепить колбу роторного испарителя и корректировать оптимальные настройки перед опусканием его в водяной бане. Откройте первый клапан для аргона полностью, повернув его против часовой стрелки. Всегда открывать и закрывать этот клапан в первую очередь. Второй клапан регулирует давление аргона дует в колбу. Давление должно быть всегда нежным.
  8. Опустите роторный испаритель в ванну с водой, достаточно для колбы прикоснуться к воде, не будучи полностью погружен и включите скорость.
  9. Подождите, пока все испаряется хлороформ, около 10 мин. Тогда остановите машину.
  10. Выключите скорость роторного испарителя и клапаны аргона бака. Теперь колбы должны быть удалены.
  11. Добавить 2 мл 5%-й глюкозыэлектронной колбу, чтобы растворить липиды.
  12. Царапины дне колбы тщательно с использованием 1 мл пипетки, чтобы растворить все липиды. После расчесывания, удалите оставшиеся жир с 1 мл наконечник в колбе, при необходимости, со второй чаевые.
  13. Инкубируют полученного раствора в 42 ° С на водяной бане, медленно вортексе (15 оборотов в минуту) в колбе.
  14. Заполните ультразвуковой ванне с холодной водой. Разрушать ультразвуком решение, по крайней мере 20-30 минут в колбе, поднял и нижний едва касаясь воды.
  15. Нагревают колбу на водяной бане в роторном испарителе в течение 20 мин при 42 ° С, при нулевой скорости, с круглым дном, погруженных в воду, на этот раз.
  16. Фильтр липосом через 0,47 мкм, а затем 0,22 микронные фильтры шприца.
  17. С помощью небольшой экструдер, фильтр липосом через 50 нм мембраны для создания гомогенной популяции однослойных липосомных везикул.
  18. Передача липосом в пробирку Эппендорф и поместить его на льду.

2. Подготовьте липосомы: миРНК ITSN-1 Комплексы

  1. Ресуспендируют на цели мышь миРНК ITSN миРНК в буфере, содержащем 20 мМ HEPES и 150 мМ хлорида натрия, рН 7,4, до конечной концентрации 2 мкг / мкл. Держите его на льду перед смешиванием.
  2. Подготовьте липосомы: комплексы миРНК ITSN в соотношении 8 нмоль липосомы: 2 мкг РНК (или 400 нмоль липосомы: 100 мкг миРНК ITSN). В настоящем исследовании мы добавили 50 мкл миРНК ITSN от маточного раствора (50 мкм) до 100 мкл свежеприготовленного липосомы использованием РНК / ДНК-азы бесплатно Эппендорф трубки. Следует отметить, что концентрация миРНК ITSN очень важно, поскольку максимум 150 мкл смеси может быть двусторонней и ретро-орбитальной впрыском в мыши в одно время.
  3. Смесь необходимо хранить на льду в ожидании вводят мышам.

3. Мышь ретроорбитальной вену (внутреннего угла глазницы)

jove_content "> Все мыши Эксперименты были одобрены и осуществлялась в соответствии с руководящими принципами Rush University Институциональные уходу и использованию животных комитета.

  1. Обезболить мыши с помощью интраперитонеальной инъекции 50 мг / кг веса тела кетамина и 5 мг / кг массы тела ксилазина (коммерчески доступные смеси). В зависимости от веса и возраста животного, регулировать анестетики объем и концентрации. Мыши, используемые в исследовании мышей CD1 мышей-самцов, в возрасте 6-8 недель и весом около 25 граммов. Шприцы туберкулин 1 мл типа с иглой.
  2. Удерживайте мышь уши одной рукой и переверните мышь вниз на сторону, чтобы выставить внутреннего угла глаза. Цель медиальнее складка semilunaris; не прикасайтесь к глазному яблоку.
  3. Подход слезный гребень из глаза проведение шприц, содержащий смесь при углом 45 градусов по всем трем осям.
  4. Медленно введите смеси и пусть мышь, чтобы восстановить с вводят стороной вверх. Если большое жидкостькапли форм на месте вставки иглы, втянуть иглу, всасывание обратно капли в шприц и повторите попытку. Повторные инъекции лучше всего делать путем чередования глаз, чтобы идеально восстановления. Если не уверены, эта методика может быть проверена путем инъекции синего красителя (50 мкл, 0,5% кристаллическим фиолетовым в метаноле) и подвергая легких мышей наблюдать синий сосудистой сети.
  5. Мышей в этом исследовании вводили каждый 3-й день в течение 3 недель без смертельных исходов или побочных эффектов.

4. Мышь перфузии легкого и сбора ткани для биохимических исследований

  1. Установите перистальтический насос работать на 1,5 мл / мин.
  2. Подготовьте установка: вентилятор, операционный стол, инструменты, стерильные ватные тампоны, ватные палочки, струны, мензурки, дистиллированная вода, сбалансированный солевой Хэнка, Tracer.
  3. Обезболить мыши путем внутрибрюшинной инъекции анестезирующего смесь (100 мг / кг веса тела кетамина и 10 мг / кг массы тела ксилазин). На уровне шеи, удалите слюнных желез и подвергать трахеи.
  4. Начните с лапаротомии, акциз диафрагмы, и следовать с торакотомии, обнажая легких и сердца.
  5. Удалить тимуса.
  6. С помощью световой микроскопии для большей точности, катетеризации легочной артерии.
  7. У трахеостомии и интубации мыши с помощью трахеостомы. Установить вентилятор для со скоростью 150 ударов / мин и рабочим объемом 150 мкл.
  8. Как выход, откройте левое предсердие.
  9. Заливать сосудистой легких у мышей свободный крови в течение 5 мин с использованием перистальтического насоса и раствор Хэнка нагревают при 37 ° С.
  10. Заливать изотопу (8 нм золотых альбумин 16) еще в течение 10 мин при той же скорости потока.
  11. Промойте несвязанных Tracer на 5 мин перфузии легкого раствор Хэнка.
  12. Последующие с на месте фиксации легких на 10 мин перфузии 4% (вес / объем) формальдегида, 2,5% глутарового альдегида и 1% дубильной кислоты в 0,1 ТРУБЫбуфером, рН 7,2.
  13. Соберите легких, удалите чрезмерное ткани, нарезать небольшими блоками (3/3 мм), и поместить их в с меченым сцинтилляционный флакон с 2 мл смеси фиксатором.

Мыши истекает полностью под наркозом во время процедуры.

5. Мышь легких обработки ткани для ЭМ

  1. Подготовка исходных растворов: 1% Palade OsO 4, ацетат веронала и Келленбергером буфера.
    1. - 1%-Палада OsO 4 буфер содержит 1 мл уксусной кислоты веронала акции, 1,25 мл 4% OsO 4, 1 мл 0,1 N соляной кислотой и дистиллированной водой до 5 мл конечного объема.
    2. - Ацетат веронала маточный раствор получают растворением 1,15 г ацетата натрия andydrous и 2,94 г барбитал в 100 мл дистиллированной воды.
    3. -Келленбергер раствор содержит 2 мл ацетатного веронала акции, 2,8 мл 0,1 N соляной кислоты, 0,05 г ацетата уранила и 5,1 млдистиллированной воды, рН 6.
  2. Промыть легких блоков в 0,1 М натрий-какодилатном буфере, рН 7,4, кратко 3 раза.
  3. Закрепить образцов в 4% (вес / объем) формальдегида, 2,5% глутарового альдегида в 0,1 ТРУБЫ буфера, рН 7,2, в течение 1 ч при комнатной температуре.
  4. Постфиксных с 1%-Palade осмия в течение 1 часа в капюшоне, на льду, в темноте.
  5. Полоскание один раз буфером Келленбергер.
  6. Образцы инкубируют в Келленбергер буфера в течение 2 ч в течение ночи при комнатной температуре.
  7. Полоскание один раз в 50%-ном этаноле.
  8. Высушить с серии градуированных этанола, 5 мин / каждая: 70%, 95%, затем 2 х 15 мин 100% этанола.
  9. Переключить на 100% оксида пропилена, 2 х 15 мин.
  10. Удалить пропиленоксида и добавляют смесь 50% пропиленоксида и 50% Epon 812, инкубировать в течение ночи, вращение на колесе, при комнатной температуре.
  11. На следующее утро, удалить смесью и добавить свежие Epon 812, по крайней мере в течение 4-5 часов на колесе.
  12. Использование удвоилось конические формы, наполненныеполовину пути со свежими 100% Epon 812, добавьте выбранные образцы и поместите их к краям.
  13. Перемещение формы для инкубатор при 60 ° C, и пусть они вылечить в течение 48-72 часов.
  14. После полимеризации отправить блоков быть тонким (60-70 нм) секционного.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ITSN-1 белка и мРНК наблюдали в нескольких временных точках после доставки миРНК ITSN методом вестерн-блоттинга и обычных и количественной ПЦР, как в 4. ITSN-1 белка и мРНК в миРНК ITSN обработанных легких мышей были приблизительно на 75% ниже со ссылкой на управление во время непрерывной нокдаун ITSN-1 в течение 21 дней. Без ITSN-1S, Динамин-2, основным взаимодействующим партнером ITSN-1 и главных действующих лиц в отряде кавеол из мембраны плазма не эффективно на работу в эндоцитотический сайта и, таким образом, кавеолы ​​отряд из мембраны плазмы и образованию свободных везикулярного носителей нарушается 1, 17. Таким образом, неэффективные деления мембраны и нарушением образования свободных носителей везикулярного вызвано недостаточным эндоцитоза и трансэндотелиальная транспорта, нарушению эндотелиальной между барьером и отек легких (рис. 1). Кроме того, понижающая регуляция ITSN-1S до регулируется альтернативных TRПодготовка к ansport компенсировать недостаточный эндоцитоза. Мы заметили, мембранные кольца (рис. 2А и 2A1), плеоморфные канальцев (рис. 2В), и увеличенные эндосомам сливается с типичными кавеолы ​​(рис. 2С) активно участвует в поглощении и транспортировке золота альбумина. Важным результатом исследования является снижение числа кавеолы ​​в ITSN-1S дефицитный эндотелия легких мыши со ссылкой на управление, Таблица 1. Длительное ITSN-1S торможения в течение 24 дней по повторной сдачи катионные липосомы / миРНК ITSN сократили отека легких у мышей путем частичного восстановления между эндотелиальной целостности барьера. EM морфологические исследования показали, что 8nm золото-альбумин индикатора не может проникнуть между эндотелиальными узлов, в этот момент времени. Вместо этого, они сформировали фильтрации остатков в просвете Introit из перехода (рис. 3). Тем не менее, периваскулярные пространства показал некоторое расширение и мягкийотек, предполагая, что соединения непроницаемы для этого размера частиц, но все же вытекающей. Кроме того, промежуточные морфологические альтернативных путей эндоцитотический активны и присутствует в более высоких цифр. Заметно, морфометрических анализ показал, что количество мембранных кольцо / канальцев помечена золотым частиц альбумина увеличилась на 14 раз в ITSN-1S хронической недостаточной эндотелия легких мышей по сравнению с контролем, в таблице 1. Кавеолы ​​число частично восстановлено, только 17,8% меньше, со ссылкой на управление. Таким образом, наши результаты показывают, что повторная доставка катионных липосом / комплексы миРНК ITSN является подходящей методологии для изучения последствий долгосрочного нокдаун белка в естественных условиях.

Рисунок 1
Рисунок 1. Представитель электронного микроскопа показывает открытые межэндотелиальных контактах (IEJs), меченого йroughout их длину на 8 нм золотых частиц альбумина. Arrowhead в увеличенном и a1, указывает на три-четыре золотых частиц альбумина расположены близко друг к другу в том же плане, что указывает на широкое открытие IEJ. Частицы золота, также связаны с abluminal выход IEJs (A, B - стрелки). Отметим также ограниченное число кавеолы ​​и расширение перикапиллярных шт пространства; звездочками). Бары: 200 нм (A), 100 нм (В, а1).

Рисунок 2
Рисунок 2. Острая возмущение ITSN-1S выражение вызывает плеоморфные эндоцитотический / трансклеточных промежуточных продуктов. Представитель EM изображения мембранных кольца (А, А1), трубчатых элементов (B, стрелки) и увеличенные эндосомам (C, наконечники стрел), загружается с 8 нм золотых альбумина и связанные с кавеолы, какморфологии. Отметим также, тяжелой дилатации периваскулярный пространство (ранее), а также белковые отек (A). Бары: 250 нм (A), 200 нм (B), 100 нм (a1, C).

Рисунок 3
Рисунок 3. Хроническое ингибирование ITSN-1S выражения IEJ частично восстанавливает целостность. Фильтрации остатков в просвете Introit из IEJ (стрелка). Мягкий расширение (*), ПВС предлагает неплотности из IEJs. Мультивезикулярные органов (MVB), в непосредственной близости от мембраны плазмы некоторые из их внутренних мелких пузырьков, помечены 8 нм золотых частиц альбумина. Бар: 100 нм.

Таблице 1. Хроническое ингибирование ITSN-1 выражение вызывает активацию альтернативных эндоцитические / трансклеточных путей и частично восстанавливает кавеолы ​​число. * Результаты нормированы на 100 мкм длины EC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Основываясь на предыдущих исследованиях, опубликованных другими 9 и 1, нам, 18 мы разработали эту методику для долгосрочного сбить из ITSN-1S в естественных условиях повторных внутривенного введения (каждые 72 ч, в течение 24 дней подряд) специфических миРНК / липосомы комплексов. Этот экспериментальный подход является эффективной, можно безопасно использовать и несколько раз, и она может быть легко расширена для изучения участия ген, кодирующий любой интерес белка в эндотелии легких и легочный гомеостаза. В условиях эксперимента созданы нами для повторного миРНК / липосомы доставки, мыши появились нормальные без признаков токсичности или иммунных реакций. Системное введение миРНК ITSN / липосомы комплексов является наиболее клинически значимых маршрутов для указания как рак и другие болезни обмена веществ. Легких является первым капиллярного русла, с которыми сталкиваются миРНК / липосомы комплексы вводят внутривенно и этим можно объяснить эффективным KD ITSNв легких.

Одним из ограничений исследования является зависящим от времени непрерывной агрегации катионные липосомы 2. Чтобы преодолеть его, Серна / липосомы комплексы были доставлены вскоре (менее 2 ч) в поколение и сохранились на льду во все времена перед использованием. Обычные катионных липосом, таких, как те, которые используются в нашем исследовании предлагается быть очищен ретикуло-эндотелиальной системы. Скоростью до-принять фагоцитов может де снизилась на липосомальными пегилирование. Пространственной стабилизации с полиэтиленгликолем (ПЭГ) покрытие продлевает время циркуляции липосом ', имея более равномерное распределение тканевой. Эти факторы стали очень важными характеристиками в противораковой терапии, где длительное циркуляции химиотерапевтических агентов желательно 12.

В отношении процедуры Е.М., незначительное количество обследованных ткани должна быть компенсирована за счет систематического и обширные морфологические и Моrphometric анализа, а также путем проверки серийных срезов, когда это необходимо.

В то время как наша методика оптимизирует схемы применения для длительной доставки миРНК и эффективности, необходимы дальнейшие исследования, чтобы сосредоточиться на высокую эффективность идентификации правильных целей и по оценке риска / выгоды параметры участие.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Работа выполнена при поддержке Национального института здравоохранения R01HL089462 Гранты для SP.

Materials

Эндоцитотический / трансклеточных структур Управление ITSN-1S миРНК, 72 часа ITSN-1S миРНК, 24 д
Кавеолы ​​открыты для просвета * 106,6 ± 9,5 50,46 ± 4,8 87,15 ± 5,9
Кавеолы ​​видимому бесплатно в цитозоле 173,5 ± 12,0 77,41 ± 6,3 143,0 ± 9,5
Всего кавеолы ​​(просвета и бесплатно в цитозоле) 280,1 ± 21,5 127,86 ± 11,1 230,14 ± 15,4
Аномальные эндоцитотический структуры (увеличение эндосомам) 2,65 ± 0,34 11,29 ± 2,7 14,93 ± 3,8
Кавеолы ​​кластеров 3,95 ± 0,4 5,64 ± 1,6 11,3 ± 2,5
Мембранные кольца 1,33 ± 0,04 9,47 ± 2,4 12,8 ± 2,8
Трубочки 0,88 ± 0,05 4,0 ± 1,3 18,84 ± 3,4
Name Company Catalog Number Comments
Dimethyl Dioctadecyl Ammonium Bromide (DOAB) Sigma-Aldrich D2779
LiposoFast stabilizer (mini-extruder) Avestin Inc. LF-STB
Polycarbonate membrane, 19 mm diameter, 50 nm pore Avestin Inc. LFM-50
Cholesterol Sigma-Aldrich C-8667
Chloroform Mallinckrodt Chemicals 4432-04
Hank's balanced salts Sigma-Aldrich H1387
Round-bottom flask Fisher Scientific FHB-275-030X
Mouse siRNAITSN - on target Dharmacon/ThermoScientific J-046912-11
Peristaltic pump Ismatec REGLO-CDF digital with RHOO pump head
Ventilator Hugo Sachs Electronik NA
Barbital Sigma-Aldrich B-0500
Uranyl acetate EM Sciences 22400
Epon812 EM Sciences Discontinued by the manufacturer
Propylene oxide EM Sciences 20400
Embedding molds EM Sciences 69923-05
Tannic acid EM Sciences 21710
8 nm gold-albumin tracer Prepared in the laboratory as in16
Comments
Equipped with 2 Avestin 1 ml gas-tight syringes (cat. # LF-1)
Pyrex, 100 ml
Modified siRNA, in vivo
Part of IDEX corp.
D-79232 March, Germany
Replaced with Embed812, cat. # 14120

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Predescu, S. A., Predescu, D. N., Knezevic, I., Klein, I. K., Malik, A. B. Intersectin-1s regulates the mitochondrial apoptotic pathway in endothelial cells. J. Biol. Chem. 282 (282), 17166-17178 (2007).
  2. Uddin, S. Cationic lipids used in non-viral gene delivery systems. Biotechnology and Molecular Biology Review. 2 (2), 58-67 (2007).
  3. Barenholz, Y., et al. Influence of lipid composition on the thermotropic behavior and size distribution of mixed cationic liposomes. J. Colloid Interface Sci. (356), 46-53 (2011).
  4. Predescu, D. N., Neamu, R., Bardita, C., Wang, M., Predescu, S. A. Impaired caveolae function and upregulation of alternative endocytic pathways induced by experimental modulation of intersectin-1s expression in mouse lung endothelium. Biochem. Res. Int.. (2012), 672705 (2012).
  5. Higuchi, Y., Kawakami, S., Hashida, M. Strategies for in vivo delivery of siRNAs: recent progress. BioDrugs. 24 (24), 195-205 (2010).
  6. Caracciolo, G., Amenitsch, H. Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes. Eur. Biophys. J. , (2012).
  7. Barnier Quer, C., Elsharkawy, A., Romeijn, S., Kros, A., Jiskoot, W. Cationic liposomes as adjuvants for influenza hemagglutinin: more than charge alone. Eur. J. Pharm. Biopharm. 81 (81), 294-302 (2012).
  8. Rai, K., et al. Liposomal delivery of MicroRNA-7-expressing plasmid overcomes epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor-resistance in lung cancer cells. Mol. Cancer Ther. (10), 1720-1727 (2011).
  9. McLean, J. W., et al. Organ-specific endothelial cell uptake of cationic liposome-DNA complexes in mice. Am. J. Physiol. (273), H387-H404 (1997).
  10. Soutschek, J., et al. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. (432), 173-178 (2004).
  11. Barenholz, Y. Liposomes enhance bioremediation of oil-contaminated soil. J. Liposome Res. (13), 1-8 (2003).
  12. Zamboni, W. C. Liposomal, nanoparticle, and conjugated formulations of anticancer agents. Clin. Cancer Res. (11), 8230-8234 (2005).
  13. Newman, M. S., Colbern, G. T., Working, P. K., Engbers, C., Amantea, M. A. Comparative pharmacokinetics, tissue distribution, and therapeutic effectiveness of cisplatin encapsulated in long-circulating, pegylated liposomes (SPI-077) in tumor-bearing mice. Cancer Chemother Pharmacol. (43), 1-7 (1999).
  14. Martino, S., et al. Efficient siRNA delivery by the cationic liposome DOTAP in human hematopoietic stem cells differentiating into dendritic cells. J. Biomed. Biotechnol. (2009), 410260 (2009).
  15. Zhang, G., et al. A delivery system targeting bone formation surfaces to facilitate RNAi-based anabolic therapy. Nat. Med. 18 (18), 307-314 (2012).
  16. Predescu, D., Palade, G. E. Plasmalemmal vesicles represent the large pore system of continuous microvascular endothelium. Am. J. Physiol. (265), H725-H733 (1993).
  17. Koh, T. W., Verstreken, P., Bellen, H. J. Dap160/intersectin acts as a stabilizing scaffold required for synaptic development and vesicle endocytosis. Neuron. (43), 193-205 (2004).
  18. Miyawaki-Shimizu, K., et al. Lung Cell Mol. Physiol. (290), L405-L413 (2006).

Tags

Биоинженерия выпуск 76 биомедицинской инженерии биохимии генетики молекулярной биологии клеточной биологии анатомии физиологии медицины иммунологии фармакологии животных моделях сердечно-сосудистых заболеваний интерсектин-1S миРНК липосомы ретроорбитальной инъекции острый и хронический ITSN-1 нокдаун трансгенные мыши липосомами эндотелиальные клетки ткани легких перфузии электронной микроскопии животной модели
Долгосрочные молчание интерсектин-1 в легких мышей по повторной сдачи Конкретные миРНК через катионные липосомы. Оценка нокдаун эффекты электронной микроскопией
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bardita, C., Predescu, D., Predescu, … More

Bardita, C., Predescu, D., Predescu, S. Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (76), e50316, doi:10.3791/50316 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter