Summary
نحن هنا نورد التجريبي لتقنية المجهر مضان intravital لتصور غيروي الصفائح الدموية العدلات التفاعلات على البطانة الوعائية التهاب تنشيط خلال تشكيل خثرة في والفئران حية. وهذه التكنولوجيا المجهرية تكون ذات قيمة لدراسة الآلية الجزيئية لأمراض الأوعية الدموية وكلاء الدوائية لاختبار في ظل ظروف المرضية في جسم المريض.
Abstract
تفاعل الصفائح الدموية المنشط والكريات البيضاء (العدلات في المقام الأول) على تخثر البطانة يتوسط المنشط والتهاب الأوعية الدموية. 1،2 خلال تشكيل خثرة في موقع الإصابة شريني، الصفائح الدموية تمسكا البطانة تنشيط والبروتينات المصفوفة تحت البطانة دعم المتداول العدلة والتصاق .. 3 وعلى العكس، في ظل ظروف التهابات venular، يمكن العدلات تمسكا البطانة تنشيط دعم التصاق وتراكم الصفائح الدموية في الدورة الدموية. غيروي الصفيحات التجميع العدلات، يتطلب عمليات متسلسلة من التفاعلات المحددة مستقبلات مستقبلات المضادة بين الخلايا .. 4 ومن المعروف أن الخلايا البطانية المنشط الإفراج جزيئات الالتصاق مثل عامل فون ويلبراند، وبالتالي الشروع التصاق الصفائح الدموية وتراكمها في ظل ظروف ارتفاع القص .. 5 أيضا، تنشيط الخلايا البطانية دعم المتداول العدلة والتصاق من إبداء selectinsد جزيء التصاق بين الخلايا-1 (ICAM-1)، على التوالي، في ظل ظروف القص منخفضة .. 4 صفائح الدم P-selectin يتفاعل مع العدلات من خلال P-selectin سكري يجند-1 (PSGL-1)، الأمر الذي أدى بالتالي تفعيل العدلات من integrins β2 وشركة التصاق بين أنواع الخلايا اثنين. على الرغم من التقدم في المختبر في التجارب التي يتم فيها تحديد غيروي الصفائح الدموية في الدم التفاعلات العدلات كليا أو الخلايا المعزولة، 6،7 يمكن التلاعب تلك الدراسات لم ظروف الإجهاد الناتج عن الأكسدة أثناء أمراض الأوعية الدموية. في هذا التقرير، وذلك باستخدام fluorescently التي تحمل علامات، والأجسام المضادة محددة ضد ماوس الصفائح الدموية وعلامة العدلات، ونحن تصف بروتوكول مفصلة لمراقبة مجهرية intravital التفاعلات غيروي من الصفائح الدموية والعدلات على البطانة تنشيط TNF-α خلال الناجم عن التهاب أو بعد الليزر التي يسببها إصابة في العضلة المشمرة microvessels من الفئران الحية.
Protocol
1. إعداد مجهر Intravital (الشكل 1A)
- إعداد العازلة superfusion (125 ملي كلوريد الصوديوم، 4.5 ملي بوكل، 2.5 ملي CaCl 2، 1 ملم MgCl 2، و 17 مم 3 NaHCO، ودرجة الحموضة 7.4).
- بدوره على الدورة الدموية حمام الماء للحفاظ على درجة حرارة المخزن المؤقت وبطانية الحرارية التي تسيطر عليها في 37 ° C. تهوية العازلة مع غاز النيتروجين (5٪ CO 2 متوازنة مع النيتروجين).
- تشغيل النظام المجهر (سوتر لامدا DG-4 عالي السرعة الطول الموجي المغير، محطة عمل الكمبيوتر، أوليمبوس BX61W المجهر، MPC-200 متعددة مناور، ROE-200 تحكم المرحلة، كاميرا عالية السرعة، وتكثيف).
- لنموذج التهاب الأوعية الدموية، واستخدام مرآة 100٪ مزدوج اللون. للحث على تشكيل خثرة بسبب الاصابة ليزر، استبدال مرآة 100٪ مع مرآة 50/50٪ وبدوره على نظام ليزر الاجتثاث micropoint.
2. إعداد العضلات المشمرة للفحص المجهري Intravital (1B الشكل)
- تخدير لذكر الماوس (6-8 أسابيع من العمر، C57BL / 6) عن طريق الحقن IP من الكيتامين (125 وزن الجسم ملغم / كغم (BW)) وزيلازين (12.5 ملغ / كغ). وافقت جامعة إلينوي رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام جميع الإجراءات ورعاية الحيوانات التجريبية. لنموذج التهاب الأوعية الدموية، وضخ TNF-α الفئران (0.5 ميكروغرام في 250 ميكرولتر المالحة) intrascrotally إلى 3 ساعة الماوس قبل التصوير (2-2.5 ساعة قبل الجراحة).
- ضع الماوس على بطانية الحرارية التي تسيطر عليها في C ° 37 على علبة المجهر intravital.
- سحب ما يصل الجلد على سطح الرقبة باستخدام ملقط وأفقيا شق خط الوسط من جلد الرقبة يصل إلى 1 سم مع المقص.
- فتح عنق الرحم العضلات برفق باستخدام مقص حادة وإزالة العضلات المحيطة القصبة الهوائية.
- يقني؛ يدخل القنية أنبوب القصبة الهوائية في PE90 للقضاء على صعوبة التنفس.
- إزالة بلطف الجانب الأيسر من عضلة عنق الرحم وعزل حبل الوريد من الأنسجة المحيطة بها.
- C أنوأواخر أنبوب PE10 في الوريد الوداجي الأيسر للتسريب من الأجسام المضادة والتخدير إضافية.
- سحب بلطف من شق الجلد وكيس الصفن أفقيا. للحفاظ على سلامة الأنسجة في كافة مراحل التجربة، وsuperfused العازلة prewarmed على الحقل الجراحية.
- اضغط على أسفل البطن مع واحد forcep وسحب بعناية على الخصية مع forcep أخرى.
- إزالة الأنسجة الضامة المحيطة حول الخصية.
- شق العضلة المشمرة عموديا وتتسطح في العضلات خلال ساترة الزجاج على علبة المجهر intravital من تعلق الهامش.
- السماح 10-20 دقيقة للعضلات لتحقيق الاستقرار قبل جمع البيانات. وقد تم اختيار الشرايين العضلات المشمرة (لتشكيل خثرة) والأوردة (لالتهاب الأوعية الدموية) التي يبلغ قطرها بين 30-45 ميكرومتر لدراستنا.
- للحفاظ على ظروف مخدر، لبث 30-50 مل من مخدر نفس تقريبا كل 30 دقيقة خلال cannulus الوداجي.
- بعد وضع الماوس على intravital المجهر، البرمجيات مفتوحة 5،0 SlideBook وانقر على "نافذة التركيز" على شريط القوائم لضبط البصريات المناسبة والهدف (60X).
- ضخ 488 Dylight، مترافق المضادة للالفئران الفأر CD42c (0.1 ميكروغرام / غرام في 100 BW المالحة ميكرولتر) واليكسا فلور 647، مترافق المضادة للالفئران الفأر-1 غرام الأجسام المضادة (0.05 ميكروغرام / غرام في 100 BW المالحة ميكرولتر) من خلال cannulus الوداجي .
- انتقل إلى شريط القوائم، ثم انقر على "التقاط الصور" في شريط الأدوات.
- وهناك قائمة جديدة يطفو على السطح، وفي "صورة"، حدد "عامل بن" كما 1X1 وحدد "640" على العرض و"460" على ارتفاع.
- في "تعيين تصفية"، علامة على مربع الاختيار للقنوات التي ترغب في فضح وضبط الوقت التعرض لكل منها. على سبيل المثال، قناة مفتوحة: 10 ميللي ثانية، FITC قناة: 50 ميللي ثانية، وقناة Cy5: 50 ميللي ثانية.
- حدد "الوقت الفاصل بين لقطة" لضبط عدد من النقاط الوقت والفاصل الزمني. FOR نموذج التهاب، يتم تعيين عدد من النقاط الزمنية ل1،000-1،500 مع فاصل من 200 ميللي ثانية (الوقت المنقضي إجمالي: 5 دقائق).
- انقر فوق "اختبار" لرؤية صورة واحدة الطائرة في الوقت المحدد التعرض لهذه القناة. ضبط زمن التعرض و / أو ضوء المجهر حتى يظهر الرسم البياني توزيع كثافة كافية (لالتقاط متعدد القنوات، كرر هذه العملية لكل قناة).
- مرة واحدة يتم تعيين كافة المعلمات (قنوات، أوقات التعرض، وهلم جرا) في "التقاط الصور"، حدد "ابدأ" لبدء الالتقاط.
- رصد الصفائح الدموية المتداول وتمسكا والعدلات لمدة 5 دقائق في النصف العلوي من الوريد المشمرة ملتهبة في النموذج التهاب الأوعية الدموية. يتم تسجيل ثمانية إلى عشرة الأوردة مختلفة في واحدة الماوس.
- تم التقاط صور باستخدام التكبير 60X مجموعه (1.0 الغمر بالماء NA الهدف) إعطاء حجم الإطار من 157 ميكرون × 118 ميكرون.
- وعند الانتهاء من التجربة، والموت الرحيم للفئران عن طريق خلع عنق الرحمن.
4. تحليل البيانات لنموذج التهاب Venular
- فتح SlideBook 5،0 البرمجيات وانقر فوق "مجلد" على شريط القوائم لفتح ملف.
- انقر على قائمة منسدلة قناة وحدد "فتح، FITC، Cy5، وما إلى ذلك"
- انقر على زر "Renormalize (الحانات الحمراء والخضراء)" وحدد القناة. اسحب أشرطة حمراء وخضراء إلى اليمين أو اليسار لتحسين تقريبا إشارة مضان.
- انقر على "تطبيق" و "موافق" لتحديث الصورة.
- انقر فوق "زر تصغير" لاختيار العرض الحالي كافتراضي.
- تلعب الصورة الملتقطة timelapse، والاعتماد العدلات المتداول وتمسكا خلال الفترة 5 دقائق.
- تشكيل خثرة لتحليل الصفائح الدموية، انتقل إلى "قناع" وحدد "إنشاء".
- اسم قناع وعلامة "في الصورة الحالية".
- انقر على زر "رمز كبير قلم رصاص" في "أداة سرادق" في شاشة العرض الرئيسية.
- تلوين منطقة خارج السفينة في شاشة العرض الرئيسية لوضع قناع الخلفية.
- يذهب رس "قناع"، انقر فوق "نسخ هذه الطائرة"، انقر فوق "نسخ قناع في timepoint الحالي" وحدد "كل timepoints"، وانقر على زر "OK".
- لحساب إشارة الخلفية، انتقل إلى "الإحصاء" وانقر على "الاحصائيات قناع".
- انقر على زر "2D الفاصل الزمني الحالي أو صورة 4D (ق)" في نطاق الصورة، وحدد "قناع كامل" في نطاق قناع. في السمات، حدد "الوقت المنقضي (HH: MM: MS)" تاريخ التقاط تحت، حدد "المنطقة (بكسل)" تحت الشكلي، حدد "الكثافة القصوى" تحت شدة، وانقر فوق "تصدير" (هذا الأسلوب يتيح لنا إحصائية لصناعة السيارات في مضان حساب كثافة (إشارة الخلفية)).
- فتح ملف نصي في مكتب MS Excel و حساب متوسط قيمة إشارة الخلفية طوال فترة التسجيل. هذا هو كثافة مضان الخلفية.
- لتحديد كثافة خثرة، انقر فوق "رمز كبير قلم رصاص" مرة أخرى في "أداة سرادق" في شاشة العرض الرئيسية.
- اللون داخل السفينة في شاشة العرض الرئيسية لضبط إشارة الصفائح الدموية.
- انتقل إلى "قناع"، انقر فوق "نسخ هذه الطائرة"، انقر فوق "نسخ قناع في timepoint الحالي"، حدد "كل timepoints"، وانقر على زر "OK".
- انتقل إلى "الإحصاء" وانقر على "الاحصائيات قناع".
- انقر على زر "2D الفاصل الزمني الحالي أو صورة 4D (ق)" في نطاق الصورة، وحدد "قناع كامل" في نطاق قناع. في السمات، حدد "الوقت المنقضي (HH: MM: MS)" تاريخ التقاط تحت، حدد "المنطقة (بكسل)" تحت الشكلي، حدد "كثافة مجموع" تحت شدة، وانقر فوق "تصدير" (وهذه الطريقة تسمح لنا إحصائية حساب كثافة مضان داخل السفينة).
- فتح ملف نصي في MS مكتب إكسل. يتم احتساب إشارة مضان من الصفائح الدموية عن طريق طرح متوسط قيمة كثافة الخلفية X منطقة (بكسل) من شدة المبلغ من داخل السفينة. هذا هو كثافة مضان من خثرة الصفيحات.
- كرر هذه الأوردة في 30 مختلفة في 3-5 الفئران مختلفة. ثم، وحساب قيمة متوسط كثافة مضان من الصفائح الدموية.
- إلىتم تحليل المتداول العدلة والالتصاق، تحديد تدفق العدلات أكثر من المتداول 5 دقائق في كل الوريد وقدم كأرقام خلية في الدقيقة الواحدة. احصي عدد العدلات التي كانت ملتصقة ثابتة لثانية 30> وزحف ببطء (<10 ميكرومتر أكثر من 30 ثانية) ولكن لم يتدحرج، وكما وردت في أعداد الخلايا 5 دقائق.
5. Intravital المجهر ليزر الناجم عن الجلطة شريني
5-1 معايرة الليزر التذرية
- ضع شريحة معكوسة على خشبة المسرح المجهر، وتطبيق قطرة صغيرة من الماء المقطر إلى أعلى الشريحة، وضبط كثافة وتركيز باستخدام العدسة.
- فتح "نافذة التركيز" وحدد "FRAP" التبويب في البرنامج 5،0 SlideBook.
- تعيين قوة الليزر في 40-50، وتعيين كل من "التكرار انقر مرتين" و "حجم انقر مرتين" إلى 8. علامة على مربع "دليل" لإحضار مجموعة من مرمى.
- حدد "السهم" الرمز من شريط المهام يان الجزء العلوي من الشاشة.
- ضمن علامة التبويب "محاذاة FRAP"، انقر فوق "النار القادمة". وينبغي أن يكون بقعة صغيرة تظهر بالقرب من الزاوية اليسرى السفلى على الشاشة. مرة واحدة في بقعة يظهر، انقر مرتين على المركز منه. النقر مرة واحدة، وينبغي أن تظهر آخر نقطة أعلاه، وإلى يمين المكان الأول؛ انقر مرتين على ذلك. كرر هذا لمدة 16 نقطة (الفور ال 16 سوف تظهر في الزاوية اليمنى السفلى.) انقر فوق "حفظ" عند اكتماله لتحديث معايير والمعايرة.
- لاختبار دقة معايرة، انقر على "مركز" الزر A-بقعة صغيرة يجب أن تظهر في وسط الشاشة. إن لم يكن، كرر المعايرة حتى يتم تحقيق دقة المطلوبة.
الليزر التي يسببها تصلب 5-2 تشكيل خثرة
- تضع الماوس تخدير (راجع الإجراء بالتعادل 2-2 لمن 2-12) على المسرح المجهر.
- تحت نافذة "لقطة"، حدد بروتوكول أو إنشاء واحدة جديدة. الإعدادات هي على النحو التالي: CY5 (70 ميللي ثانية التعرض)، فتح (10 MSEج التعرض)، وFITC (50 ميللي ثانية التعرض). يتم التقاط أكثر من 20 صورة دقيقة (حوالي الساعة 2400 نقطة مع الوقت الفاصل من 500 ميللي ثانية).
- ضخ 488 Dylight، مترافق المضادة للماوس CD42c وفلور اليكسا 647، مترافق المضادة للماوس-1 غرام الأجسام المضادة كما هو موضح أعلاه.
- تحسين المعلمات بما في ذلك كثافة مضان المجهر مشرق وصورة كما هو موضح في الميدان ل3-3 3-7.
- انقر فوق "اختبار" زر لضمان حسن كثافة brightfield أو إشارة الأجسام المضادة، والتنسيب شرين والتركيز.
- انقر على زر "ابدأ" لبدء عملية التقاط الصور.
- قبل اطلاق الليزر التذرية، تأكد من أنه تم اختيار رمز مؤشر الماوس وأن جدار الوعاء الدموي في تركيز واضح.
- لاطلاق النار ليزر، انقر مرتين على بقعة 2-3 ميكرون داخليا من جدار الوعاء الدموي. يتبع إصابة الخلايا البطانية في شريني يؤدي إلى تغيير شكل البصرية التي يجب أن تكون واضحة في الصورة brightfield، من خلال تراكم الصفائح الدموية. رصد خثرةتشكيل لمدة 5 دقائق بعد إصابة الليزر.
- خمس دقائق بعد إصابة الليزر (حجم خثرة يجب أن تكون مستقرة الآن) وقفة وإلغاء القبض عليه. في وقت لاحق، مع بدء التقاط النقاط الزمنية 2400 مع فاصل زمني ميللي ثانية 500 إلى تسجيل الصفائح الدموية وتمسكا العدلات المتداول / تمسكا لمدة 20 دقيقة. وتسجل ثلاثة إلى خمسة في واحد الشرايين الماوس.
- وعند الانتهاء من التجربة، والموت الرحيم للفئران عن طريق خلع عنق الرحم.
6. تحليل البيانات لنموذج التخثر شريني
- يذهب أكثر من 4،1 الخطوات من خلال 4.5.
- للحصول على كثافة مضان الخلفية أثناء تشكيل خثرة الصفيحات، يذهب أكثر من 4،7 الخطوات من خلال 4،14.
- انتقل إلى "قناع"، انقر فوق "الجزء"، حدد FITC في القناة، وإدراج متوسط قيمة إشارة الخلفية على الأقل. انقر على "تطبيق" و "موافق".
- لتحليل كثافة مضان من الصفائح الدموية خثرة (488 Dylight، مترافق المضادة للCD42c الضد)،
- لتحديد العدلات المتداول وتمسكا، ولعب timelapse حساب عدد الخلايا التي لفة واضح على مدى أكثر من 20 خثرة الصفيحات دقيقة. كما يتم تعريف المتداول انخفاض في سرعة العدلات أثناء التفاعل مع خثرة الصفيحات مدة لا تقل عن 2 ثانية. وتعرف بأنها أي العدلات تمسكا العدلات التي لا تزال تعلق على الصفائح الدموية خثرة ما لا يقل عن 2 دقيقة. وقدم عدد من العدلات المتداول وتمسكا كأرقام الخلية في 20 دقيقة. تم حساب سرعة المتداول باستخدام نظام تتبع الجسيمات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام تحليل مفصل المجهر intravital، كانت الصفائح الدموية غيروي-العدلات التفاعلات على البطانة تصور المنشط عن طريق التسريب من الأجسام المضادة التي تحمل علامات fluorescently ضد الصفائح الدموية (CD42c) أو علامة العدلات (GR-1) في الفئران الحية.
في نموذج TNF-α من التي يسببها التهاب venular، تم الالتزام ثابت العدلات معظم المتداول إلى البطانة من المفترض التفاعل من integrins β2 المنشط مع ICAM-1 خلال الفترة تسجيل (3-4،5 ساعة بعد الحقن TNF-α من، الشكل 2A ). كانت 8 المتداول والعدلات ملتصقة موجودة بالفعل قبل التقاط الفيديو بدأت بسبب تفعيل TNF-α الناجم عن الخلايا البطانية. كان عدد العدلات المتداول وتمسكا على الخلايا البطانية للالتهاب الخلايا 0،25 ± 0.05 و 18.5 في الدقيقة ± 0.7 في الخلايا 5 دقائق، على التوالي (أرقام 2B 2C و). وانضمت معظم العدلات إلى رانه تنشيط البطانة لمدة تسجيل الفيديو (1-1.5 ساعة)، وكان هناك انخفاض الحد الأدنى فقط في الخلايا الملتصقة مع زيادة الحد الأدنى المتداول في الخلايا (المعطيات غير معروضة). وجدنا أن معظم الصفائح الدموية التمسك تمسكا العدلات والزحف بدلا من جدار الوعاء الدموي ملتهبة (الشكل 2A، فيديو 1). خثرات الصفائح الدموية المتراكمة وembolized مرارا وتكرارا لمدة التقاط الفيديو. وقد تبين إشارة مضان المتكاملة المرتبطة الصفائح الدموية الملتصقة في الشكل 2D.
استخدام الليزر التي يسببها تصلب نموذج تخثر، تمكنا من دراسة وتوصيف التفاعل غيروي من الصفائح الدموية والعدلات في موقع الإصابة الجدار شريني. في هذا النموذج، وحجم خثرة بلغت ذروتها حوالي 100 ثوان بعد الجراحة بالليزر، تليها سلسلة من الانصمام صغيرة السريع لدقيقة 2-3 القادمة (المعطيات غير معروضة). 9،10 خمس دقائق بعد إصابة ليزر، وحجم الصفائح الدموية رظلت ثابتة نسبيا خلال hrombus التصوير (5-25 دقيقة بعد الإصابة الليزر، أرقام 3A-3C) والعدلات وتوالت على انضمت إلى خثرة الصفيحات (أرقام 3A-3B، فيديو 2). كان إشارة مضان من الصفائح الدموية المنتشرة ضئيلة بالمقارنة مع خثرة من الصفيحات. كان عدد العدلات وتمسكا المتداول 21،5 ± 3.0 و 1.6 ± 0.4 الخلايا أكثر من 20 دقيقة، على التوالي (أرقام 3D-3E). حدث المتداول السريع الأولي من العدلات على الخلايا البطانية. مرة واحدة العدلات اتصلت خثرة الصفيحات، تم تغيير السرعة المتداول من العدلات على خثرة الصفيحات مع مجموعة قدره 8.2 ± 1.1 ميكرومتر في الثانية (الشكل 3F)، والذي بوساطة تفاعل 1-P-PSGL selectin و 11
الشكل 1.التخطيطي للنظام intravital المجهر (A) وإعداد العضلات المشمرة microvessel (B).
الشكل 2. تم الكشف عن التفاعلات غيروي من الصفائح الدموية والتهاب العدلات خلال TNF-α الناجم عن venular في الفئران الحية. الصفائح الدموية والعدلات من Dylight 488، مترافق المضادة للماوس وCD42c اليكسا فلور 647، مترافق المضادة للماوس-1 غرام الأجسام المضادة، على التوالي. ( binarized A الممثل) صور ظهور إشارات مضان المرتبطة العدلات (أحمر) والصفائح الدموية (الأخضر) أكثر من 180 ثانية. يظهر سهم اتجاه تدفق الدم. ويظهر شريط = 10 ميكرومتر. (BC) عدد المتداول (خلية / دقيقة) والعدلات ملتصقة (خلية / دقيقة 5) على الخلايا البطانية الملتهبة. البيانات تمثل يعني ± SEM من دي 30الأوردة fferent في الفئران البرية من نوع 4. يتم رسم (D) متوسط إشارة مضان متكاملة من الصفائح الدموية (الصفيحات F) بوصفها وظيفة من الزمن. تم الكشف عن عدم وجود إشارة مترافق مع 488-Dylight تحكم مفتش الفئران (المعطيات غير معروضة).
الشكل 3. تم الكشف عن التفاعل غيروي من العدلات مع خثرة الصفيحات في موقع الإصابة التي يسببها الليزر تصلب في الفئران الحية. الصفائح الدموية والعدلات كما هو موضح في الشكل 2. (A) A العدلة واحد (الأحمر والأصفر على شكل سهم) لفات على خثرة الصفيحات (الأخضر) في حين أن العدلة الثانية (الحمراء، البيضاء سهم) لفات بسرعة خلال الخلايا البطانية شريني، أظهرت أكثر من 5 ثوانى. (B) A العدلة واحد (أحمر) التدحرج والتمسك خثرة الصفيحات (الأخضر) يظهر أكثر من 15 ثانية . رأس السهم المتداول ويبين شمال شرق تمسكاutrophils. شريط = 10 ميكرومتر. سميكة، رمادي سهم يبين اتجاه تدفق الدم. (C) يتم رسم إشارة مضان متوسط متكاملة من الصفائح الدموية (الصفيحات F) بوصفها وظيفة من الزمن. (DE) ويرد عدد من العدلات المتداول وتمسكا على الصفائح الدموية خثرة (cells/20 دقيقة). (F) وسرعة المتداول من العدلات على خثرة الصفيحات. البيانات تمثل يعني ± SEM من الجلطات 14 في الفئران البرية من نوع 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن هنا وصف بروتوكول مفصلة للفحص المجهري في الوقت الحقيقي intravital مضان لتصور غيروي الصفائح الدموية العدلات التفاعلات على البطانة الوعائية التهاب تنشيط أثناء وتجلط الدم. سابقا، تم الإبلاغ عن نهج مماثلة المجهرية مضان لدراسة الآلية الجزيئية لتشكيل خثرة والتهاب الأوعية الدموية. 8،12 منذ غيروي خلية خلية التفاعل قد يكون مهما لايتي-انسداد في موقع الإصابة، وسوف تكون هذه التقنية أداة قيمة لل دراسة آليات الخلوية والجزيئية لأمراض الأوعية الدموية. ميزة تكنولوجيا التصوير في الوقت الحقيقي لمراقبة التفاعلات غير المباشرة واللاحقة من الخلايا داخل الأوعية على تنشيط البطانة / التالفة في ظل ظروف التهابات والجلطات. مزيد، يمكن أن تستخدم نظامنا المجهرية في دراسة التفاعلات بين الخلايا السرطانية غيروي تعميم والبطانية أو خلايا الدم باستخدام فلووrescently التي تحمل علامات الخلايا السرطانية أو أجسام مضادة ضد الخلايا السرطانية علامات مثل الإنسان الظهارية جزيء التصاق الخلية (EpCAM). 13،14 بدلا من استخدام الأجسام المضادة التي تحمل علامات fluorescently، يمكن أيضا أن يتم تنفيذ هذا المجهر مع الفئران المعدلة وراثيا معربا عن البروتينات الفلورية في نوع خلية معينة مثل CD41-EYFP + الخلايا السوية العرطلة 15
باستخدام كثافة الأجسام المضادة التي تحمل علامات fluorescently، يمكننا تحديد حركية الصفائح الدموية خثرة تشكيل والتعبير على الخلايا الجزيئية داخل الأوعية المنشط بعد اصابة السفينة. ومع ذلك، فإن معظم الأجسام المضادة المستخدمة في هذا الغرض وتمنع وظيفة المستضد مما قد يؤدي إلى نتائج غير متوقعة. ولذلك، ينبغي أن يتم في التجربة مع عناية خاصة لتحسين تركيز الأجسام المضادة التي في يعطي إشارة كافية مضان من قبل الملزم للمستضد دون التأثير على وظيفة مستضد. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الأجسام المضادة النوعية هو آخر محطة الفضاء الدوليةUE. من المعروف أن مجموعات سكانية فرعية من الخلايا الجذعية وحيدات التعبير عن مستويات منخفضة من غرام-1 16
ومع ذلك، وجدنا أن حيدات ليست سوى 3-5٪ من الكريات البيض المتداول خلال الالتهاب الحاد والجلطة تشكيل، كما هو محدد من قبل الأجسام المضادة ضد fluorescently التي تحمل علامات الماوس F4/80 التي يعبر حصرا في حيدات الخلايا الجذعية و(المعطيات غير معروضة). وبالتالي الكريات البيض، ومعظم المتداول وتمسكا TNF-α خلال الناجم عن التهاب venular والليزر التي يسببها تجلط الدم شريني تكون العدلات.
في هذا التقرير، استخدمنا نماذج الماوس اثنين من أمراض الأوعية الدموية. يجرى العمل على الرغم من أننا لا نفهم أن نموذج حيواني يمكن تلخيص ظروف الأمراض التي تصيب البشر، في microvessels من الفئران الحية باستخدام هذه التكنولوجيا سيكون لها صلة مباشرة الأمراض التي تصيب البشر، وستكون أفضل للترجمة بسهولة لعلاج التهابات خثرات الأمراض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أي اهتمام المتنافسة المالية.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (P30 HL101302 وRO1 HL109439 لJC) وجمعية القلب الأمريكية (SDG 5270005 لJC). وأيد A. Barazia من منحة المعاهد الوطنية للصحة T32HL007829 التدريب.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| MgCl2 6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | 144-55-8 | |
| 0.9% NaCl Saline | Hospira | 0409-4888-10 | |
| Ketamine | Hospira | 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Lloyd | ||
| Intramedic Tubing (PE 90) | BD Diagnostics | 427421 | |
| Intramedic Tubing (PE 10) | BD Diagnostics | 427401 | |
| Murine TNF-α | R&D Systems | 410-MT | |
| Dylight 488- labeled rat anti-mouse CD42b antibody | Emfret Analytics | X488 | |
| Alexa Fluor 647-conjugated anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) Antibody | BioLegend | 108418 | |
| NESLAB EX water bath/circulator | Thermo-Scientific | ||
| Olympus BX61W microscope | Olympus | ||
| TH4-100 Power | Olympus | ||
| Lambda DG-4 | Sutter | ||
| MPC-200 multi-manipulator | Sutter | ||
| R–-200 stage controller | Sutter | ||
| C9300 high-speed camera | Hamamatsu | ||
| Intensifier | Video Scope International | ||
| Ablation Laser | Photonic Instruments, Inc. | ||
| SlideBook 5.0 | Intelligent Imaging Innovations |
References
- Wagner, D. D., Frenette, P. S. The vessel wall and its interactions. Blood. 111, 5271-5281 (2008).
- Nieswandt, B., Kleinschnitz, C., Stoll, G. Ischaemic stroke: a thrombo-inflammatory disease. J. Physiol. 589, 4115-4123 (2011).
- Yang, J., Furie, B. C., Furie, B. The biology of P-selectin glycoprotein ligand-1: its role as a selectin counterreceptor in leukocyte-endothelial and leukocyte-platelet interaction. Thromb. Haemost. 81, 1-7 (1999).
- Zarbock, A., Polanowska-Grabowska, R. K., Ley, K. Platelet-neutrophil-interactions: linking hemostasis and inflammation. Blood Rev. 21, 99-111 (2007).
- Chen, J., Lopez, J. A. Interactions of platelets with subendothelium and endothelium. Microcirculation. 12, 235-246 (2005).
- Konstantopoulos, K., et al. Venous levels of shear support neutrophil-platelet adhesion and neutrophil aggregation in blood via P-selectin and beta2-integrin. Circulation. 98, 873-882 (1998).
- Maugeri, N., de Gaetano, G., Barbanti, M., Donati, M. B., Cerletti, C. Prevention of platelet-polymorphonuclear leukocyte interactions: new clues to the antithrombotic properties of parnaparin, a low molecular weight heparin. Haematologica. 90, 833-839 (2005).
- Hidalgo, A., et al. Heterotypic interactions enabled by polarized neutrophil microdomains mediate thromboinflammatory injury. Nat. Med. 15, 384-391 (2009).
- Cho, J., Furie, B. C., Coughlin, S. R., Furie, B. A critical role for extracellular protein disulfide isomerase during thrombus formation in mice. J. Clin. Invest. 118, 1123-1131 (2008).
- Cho, J., et al. Protein disulfide isomerase capture during thrombus formation in vivo depends on the presence of beta3 integrins. Blood. 120, 647-655 (2012).
- Gross, P. L., Furie, B. C., Merrill-Skoloff, G., Chou, J., Furie, B. Leukocyte-versus microparticle-mediated tissue factor transfer during arteriolar thrombus development. Journal of Leukocyte Biology. 78, 1318-1326 (2005).
- Falati, S., Gross, P., Merrill-Skoloff, G., Furie, B. C., Furie, B. Real-time in vivo imaging of platelets, tissue factor and fibrin during arterial thrombus formation in the mouse. Nat. Med. 8, 1175-1181 (2002).
- Barthel, S. R., et al. Alpha 1,3 fucosyltransferases are master regulators of prostate cancer cell trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19491-19496 (2009).
- Trzpis, M., McLaughlin, P. M., de Leij, L. M., Harmsen, M. C. Epithelial cell adhesion molecule: more than a carcinoma marker and adhesion molecule. The American Journal of Pathology. 171, 386-395 (2007).
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317, 1767-1770 (2007).
- Egan, C. E., Sukhumavasi, W., Bierly, A. L., Denkers, E. Y. Understanding the multiple functions of Gr-1(+) cell subpopulations during microbial infection. Immunologic Research. 40, 35-48 (2008).
