Summary
Qui riportiamo una tecnica sperimentale di fluorescenza microscopia intravitale di visualizzare eterotipiche piastrine-neutrofili interazioni sul endotelio attivato durante l'infiammazione vascolare e la formazione di trombi nei topi vivi. Questa tecnologia microscopica sarà prezioso per studiare il meccanismo molecolare della malattia vascolare e per testare agenti farmacologici in condizioni fisiopatologiche.
Abstract
Interazione delle piastrine attivate e leucociti neutrofili (principalmente) sulla trombosi attivato media endotelio e infiammazione vascolare. 1,2 Durante la formazione del trombo nel sito di lesione arteriolare, piastrine aderenti all'endotelio attivato e proteine della matrice subendoteliali supportare rotolamento dei neutrofili e adesione. 3 Viceversa, in venulare condizioni infiammatorie, aderenti neutrofili all'endotelio attivato può sostenere l'adesione e l'accumulo di piastrine circolanti. Eterotipica piastrine-neutrofili aggregazione richiede processi sequenziali dagli specifici recettori-counter interazioni tra cellule recettore. 4 È noto che cellule endoteliali attivate rilasciare molecole di adesione come fattore di von Willebrand, avviando adesione piastrinica e accumulo condizioni di alto shear. 5 Inoltre, cellule endoteliali attivate supportare rotolamento dei neutrofili e adesione da selectine esprimono unmolecola-1 di adesione intercellulare d (ICAM-1), rispettivamente, in condizioni di basso attrito. 4 piastrine P-selectina interagisce con neutrofili attraverso P-selectina glicoproteina ligando-1 (PSGL-1), inducendo così l'attivazione dei neutrofili β2 integrine e azienda adesione tra due tipi di cellule. Nonostante i progressi in esperimenti in vitro in cui sono determinati eterotipiche piastrine-neutrofili interazioni in sangue intero o cellule isolate, 6,7 quegli studi non può manipolare durante condizioni di stress ossidativo malattia vascolare. In questo rapporto, con marcati in fluorescenza, anticorpi specifici contro un mouse piastrinica e dei neutrofili marcatore, si descrive un dettagliato protocollo intravitale microscopica per monitorare le interazioni eterotipiche di piastrine e dei neutrofili sul endotelio attivato durante il TNF-α indotta da infiammazione o dopo laser-indotta lesioni in Cremaster microvasi muscolari di topi vivi.
Protocol
1. Preparazione di Microscopio intravitale (Figura 1A)
- Preparare tampone superfusione (125 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, e 17 mM NaHCO 3, pH 7,4).
- Attivare un bagnomaria circolatorio per mantenere la temperatura del tampone e termo-controllata coperta a 37 ° C. Aerare tampone con gas di azoto (5% di CO2 equilibrato con azoto).
- Accendere il sistema di microscopio (Sutter Lambda DG-4 ad alta velocità di lunghezza d'onda cambia, postazione computer, microscopio Olympus BX61W, MPC-200 multi-manipolatore, ROE-200 fase, macchina fotografica ad alta velocità, e intensificatore).
- Per il modello di infiammazione vascolare, usare uno specchio dicroico 100%. Di indurre la formazione di trombi da lesioni laser, sostituire uno specchio 100% con uno specchio 50/50% ed attivare un sistema di ablazione laser Micropoint.
2. Preparazione di Muscle Cremaster per microscopia intravitale (Figura 1B)
- Anestetizzare untopo maschio (6-8 settimane di vita, C57BL / 6) mediante iniezione ip di ketamina (125 mg / kg di peso corporeo (BW)) e xilazina (12,5 mg / kg di peso corporeo). L'Università di cura degli animali e del Comitato Istituzionale Illinois Usa ha approvato tutte le cure degli animali e procedure sperimentali. Per un modello di infiammazione vascolare, iniettare murino TNF-α (0,5 mg in 250 microlitri salina) intrascrotally in un mouse 3 ore prima di imaging (2-2,5 ore prima dell'intervento).
- Posizionare il mouse su una coperta termoregolata a 37 ° C su un vassoio intravitale microscopio.
- Tirare verso l'alto la pelle sulla superficie del collo con pinze e incidere in senso orizzontale la linea mediana della pelle del collo fino a 1 cm con le forbici.
- Aprire delicatamente il muscolo cervicale con le forbici smussate e rimuovere il muscolo che circonda la trachea.
- Incannulare una PE90 tubo nella trachea per eliminare difficoltà di respirazione.
- Rimuovere delicatamente il lato sinistro del muscolo cervicale e isolare la vena giugulare dai tessuti circostanti.
- C annutardi un tubo PE10 nella vena giugulare sinistra per l'infusione di anticorpi e anestetici aggiuntivi.
- Estrarre delicatamente e incidere la pelle dello scroto in senso orizzontale. Per mantenere l'integrità del tessuto durante l'esperimento, tampone preriscaldato stato superfuse sul campo chirurgico.
- Premere sul basso addome con una pinza ed estrarre delicatamente un testicolo con l'altra pinza.
- Rimuovere i tessuti circostanti connettivo di tutto il testicolo.
- Incidere il muscolo cremastere verticale e appiattire il muscolo su un vetrino di vetro su un vassoio microscopio intravitale da appuntare la periferia.
- Lasciare 10-20 minuti per il muscolo si stabilizzi prima della raccolta dei dati. Arteriole muscolari Cremaster (per la formazione del trombo) e venule (per infiammazione vascolare) con un diametro di 30-45 micron sono stati scelti per il nostro studio.
- Per mantenere condizioni anestetiche, infondere 30-50 ml dello stesso anestetico circa ogni 30 min attraverso il cannulus giugulare.
- Dopo il posizionamento del mouse sul microscopio intravitale, aperto SlideBook software 5.0 e fare clic su "Finestra di messa a fuoco" nella barra dei menu per impostare l'ottica adeguati e oggettivi (60X).
- Infondere Dylight 488-coniugato anti-topo ratto CD42c (0,1 mcg / g BW in 100 microlitri soluzione salina) e Alexa Fluor 647-coniugati ratto anti-topo Gr-1 anticorpi (0,05 mg / g BW in 100 microlitri soluzione salina) attraverso un cannulus giugulare .
- Vai alla barra dei menu, e fare clic su "Cattura immagine" nella barra degli strumenti.
- Un nuovo menu pop-up; In "Image", selezionare "Bin Factor" come 1x1 e selezionare "640" sulla larghezza e "460" in altezza.
- In "Imposta Filtro", contrassegnare la casella di controllo per i canali che si desidera esporre e impostare il tempo di esposizione per ogni. Ad esempio, canale aperto: 10 msec, FITC canale: 50 msec, e Cy5 canale: 50 msec.
- Selezionare "Time-Lapse Capture" per regolare il numero di punti di tempo e l'intervallo. For il modello di infiammazione, il numero di punti temporali è impostata 1000-1500 con un intervallo di 200 msec (Tempo totale: 5 min).
- Fare clic su "Test" per vedere un singolo piano dell'immagine al tempo di esposizione specificato per quel canale. Regolare il tempo di esposizione e / o la luce del microscopio fino a quando l'istogramma mostra una distribuzione adeguata intensità (per multi-canale di acquisizione, ripetere questo processo per ogni canale).
- Una volta che tutti i parametri sono impostati (canali, tempi di esposizione, e così via) in "Cattura immagine", selezionare "Start" per avviare l'acquisizione.
- Monitorare piastrine di laminazione e aderente e neutrofili per 5 minuti nella metà superiore di un venule cremastere infiammata nel modello di infiammazione vascolare. Da otto a dieci venule sono registrati in un topo.
- Le immagini sono state scattate con un ingrandimento totale di 60X (1,0 obiettivo NA acqua ad immersione), dando una dimensione della finestra di 157 micron x 118 micron.
- Al termine dell'esperimento, i topi sono stati sacrificati tramite cervicale dislocation.
4. Analisi dei dati per il modello Infiammazione venulare
- Aprire SlideBook software 5.0 e fare clic su "Cartella" nella barra dei menu per aprire un file.
- Fare clic sul menu a discesa e selezionate "Apri, FITC, Cy5, ecc"
- Fare clic su "Renormalize (barre rosse e verdi)" e selezionare il canale. Trascinare le barre rosse e verdi a sinistra oa destra per ottimizzare o meno il segnale di fluorescenza.
- Fare clic su "Applica" e "OK" per aggiornare l'immagine.
- Fare clic su "Pulsante Miniatura" per selezionare la visualizzazione corrente come predefinito.
- Gioca immagine Timelapse catturata, e contare neutrofili laminazione e aderente durante il periodo di 5 minuti.
- Per analizzare piastrine formazione di trombi, andare a "Mask" e selezionare "Crea".
- Il nome di una maschera e marchio "Nell'immagine corrente".
- Fare clic su "icona grande matita" in "Tool Marquee" nella vista principale.
- Il colore di una regione al di fuori della nave nella vista principale per impostare una maschera di sfondo.
- Vai to "Maschera", fare clic su "Copia This Plane", fare clic su "Copia in maschera timepoint corrente" e selezionare "Tutti i riferimenti temporali", e fare clic su "OK".
- Per calcolare segnale di fondo, andare su "Statistiche" e fare clic su "Statistiche Mask".
- Fare clic su "Current Time lapse 2D o 4D Image (s)" in Scope, e selezionare "intera maschera" in ambito Mask. In Funzioni, selezionare "Tempo trascorso (hh: mm: ms)" sotto data di cattura, selezionare "Area (pixel)" sotto morfometria, selezionare "Potenza massima" sotto intensità, e fare clic su "Esporta" (Questo metodo ci permette di statistica calcolo automatico intensità di fluorescenza (segnale di fondo)).
- Aprire il file di testo in MS Office Excel e calcolare il valore medio del segnale di fondo per tutto il periodo di registrazione. Questo è l'intensità di fluorescenza di sfondo.
- Per determinare l'intensità del trombo, fare clic su "icona grande matita" di nuovo in "strumento Marquee" nella vista principale.
- Colore all'interno della nave nella vista principale per impostare il segnale delle piastrine.
- Vai su "Mask", fare clic su "Copia This Plane", fare clic su "Copia in maschera timepoint corrente", selezionare "tutte le visite", e fare clic su "OK".
- Vai su "Statistiche" e fare clic su "Statistiche Mask".
- Fare clic su "Current Time lapse 2D o 4D Image (s)" in Scope, e selezionare "intera maschera" in ambito Mask. In Funzioni, selezionare "Tempo trascorso (hh: mm: ms)" sotto data di cattura, selezionare "Area (pixel)" sotto morfometria, selezionare "Potenza Sum" sotto intensità, e fare clic su "Esporta" (Questo metodo ci permette di statistica calcolare l'intensità di fluorescenza all'interno del recipiente).
- Aprire il file di testo in Microsoft Office Excel. Segnale di fluorescenza di piastrine viene calcolato sottraendo il valore medio di intensità Area sfondo x (pixel) dalla somma di intensità della parte interna del vaso. Questo è l'intensità di fluorescenza del trombo di piastrine.
- Ripetere questo in 30 diversi venule in 3-5 diversi tipi di mouse. Quindi, calcola il valore medio della intensità di fluorescenza delle piastrine.
- Aanalizzare il rotolamento dei neutrofili e l'adesione, l'afflusso di rotolamento dei neutrofili è stata determinata oltre 5 min in ciascuna venule e presentati come numero di cellule al minuto. Il numero di neutrofili aderenti che sono stati fermi per> 30 sec e lentamente strisciando (<10 micron più di 30 secondi), ma non rotolare, sono stati contati e presentati come numero di cellule per 5 min.
5. Microscopia intravitale per Laser-indotta trombosi arteriolare
5-1 Calibrazione di ablazione laser
- Inserire una diapositiva a specchio sul palco microscopio, applicare una piccola goccia di acqua distillata fino alla parte superiore della diapositiva, e regolare l'intensità e mettere a fuoco con l'oculare.
- Aprire "Finestra di messa a fuoco" e selezionare la scheda "FRAP" nel software SlideBook 5.0.
- Impostare la potenza del laser a 40-50, e impostare entrambe le "ripetizioni Fare doppio clic su" e "dimensione Doppio click" a 8. Segnare la casella "Guida" per far apparire una serie di mirini.
- Selezionare l'icona "Freccia" dalla barra delle applicazioni on parte superiore dello schermo.
- Nella sezione "Allineamento FRAP" scheda, fare clic su "Fuoco prossimo". Un piccolo punto dovrebbe apparire vicino all'angolo in basso a sinistra sul monitor. Una volta che il punto viene visualizzata, fare doppio clic sul centro di esso. Una volta cliccato, un altro punto dovrebbe apparire in alto a destra del primo spot, fare doppio clic su di esso. Ripetere questa operazione per 16 punti (16 ° posto apparirà nell'angolo in basso a destra.) Fare clic su "Salva" quando completo per aggiornare i parametri di calibrazione.
- Per verificare la precisione della calibrazione, fare clic sul pulsante, un "Centro" piccolo punto dovrebbe apparire al centro dello schermo. In caso contrario, ripetere la calibrazione fino a quando la precisione desiderata.
5-2 laser-indotta la formazione di trombi arteriolare
- Inserire un mouse anestetizzato (vedere la procedura di 2-2 a 2-12) sul palco microscopio.
- Sotto la finestra "Capture", selezionare un protocollo o di crearne uno nuovo. Le impostazioni sono le seguenti: CY5 (70 esposizione msec), Open (10 mseesposizione c), e FITC (50 esposizione msec). L'immagine è catturata più di 20 minuti (circa 2.400 punti di tempo con un intervallo di tempo di 500 msec).
- Infondere Dylight 488-coniugato anti-topo CD42c e Alexa Fluor 647-coniugato anti-topo Gr-1 anticorpi come descritto sopra.
- Ottimizzare i parametri microscopio tra intensità di fluorescenza e di immagine in campo chiaro come descritto in 3-3 per 3-7.
- Fare clic sul pulsante "Test" per garantire la giusta intensità campo chiaro o segnale anticorpo, arteriola posizionamento e messa a fuoco.
- Fare clic su "Start" per avviare il processo di cattura dell'immagine.
- Prima di sparare il laser ablazione, accertarsi che l'icona del puntatore del mouse è stato selezionato e che la parete del vaso è a fuoco chiaro.
- Per sparare il laser, fare doppio clic su un punto 2-3 micron internamente dalla parete del serbatoio. Lesioni delle cellule endoteliali arteriolare provoca un cambiamento visivo forma che dovrebbe essere evidente nell'immagine chiaro, seguito da accumulo piastrinica. Monitor tromboformazione per 5 min dopo la lesione laser.
- Cinque minuti dopo la lesione laser (la dimensione del trombo dovrebbe essere stabile) mettere in pausa e annullare la cattura. Successivamente, avviare una cattura con 2400 punti di tempo con un intervallo di 500 msec per registrare piastrine aderenti e neutrofili laminazione / aderente per 20 min. Da tre a cinque arteriole sono registrati in un mouse.
- Al termine dell'esperimento, i topi sono stati sacrificati mediante dislocazione cervicale.
6. Analisi dei dati per il modello Trombosi arteriolare
- Andare oltre 4,1 passi attraverso 4.5.
- Per ottenere l'intensità di fluorescenza di fondo durante le piastrine formazione di trombi, andare oltre i passaggi attraverso 4,7 4.14.
- Vai su "Mask", fare clic su "Segmento", selezionare FITC nel canale, e inserire il valore medio del segnale di fondo su Low. Fare clic su "Applica" e "OK".
- Per analizzare l'intensità di fluorescenza del trombo di piastrine (Dylight 488-coniugato anticorpo anti-CD42c),
- Per quantificare i neutrofili di laminazione e aderente, giocare il timelapse e contare il numero di celle che visibilmente rotolano nei trombi piastrinici oltre 20 min. Rotolamento è definita come una diminuzione della velocità neutrofili mentre interagisce con il trombo di piastrine per almeno 2 sec. Neutrofili aderenti si intende qualsiasi neutrofili che rimangono attaccati ai trombi piastrinici per almeno 2 min. Il numero di neutrofili laminazione e aderente è stato presentato come il numero di cellule per 20 min. Velocità di laminazione è stata calcolata usando un sistema di tracciamento di particelle.
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Representative Results
Con un'analisi dettagliata microscopia intravitale, eterotipiche piastrine-neutrofili interazioni sul endotelio attivato sono state visualizzate mediante infusione di anticorpi marcati con fluorescenza contro una piastrina (CD42c) o neutrofili marcatore (Gr-1) in topi vivi.
In un modello di TNF-α indotta infiammazione venulare, neutrofili più laminazione sono stabilmente aderito all'endotelio presumibilmente dall'interazione attivati β2 integrine con ICAM-1 durante il periodo di registrazione (3-4,5 ore dopo l'iniezione di TNF-α, Figura 2A ). 8 rotolamento e neutrofili aderenti erano già presenti prima della cattura video ha cominciato a causa del TNF-α indotta da attivazione delle cellule endoteliali. Il numero di neutrofili laminazione e aderente alle cellule endoteliali infiammate era 0,25 ± 0,05 cellule al minuto e 18,5 ± 0,7 cellule per 5 min, rispettivamente (Figure 2B e 2C). La maggior parte dei neutrofili sono state rispettate tegli endotelio attivato per la durata di cattura video (1-1,5 ore), e c'era solo una diminuzione minima in cellule aderenti con un minimo aumento cellule rotolamento (dati non mostrati). Abbiamo trovato che la maggior parte delle piastrine aderire neutrofili aderenti e strisciare, piuttosto che la parete del serbatoio infiammato (Figura 2A, Video 1). Piastrinica trombi accumulati e embolizzato ripetutamente per tutta la durata della cattura video. Il segnale di fluorescenza integrato associato piastrine aderenti è stato mostrato nella Figura 2D.
Utilizzando il laser indotta modello arteriolare trombosi, siamo stati in grado di esaminare e caratterizzare l'interazione heterotypic delle piastrine e dei neutrofili nel sito di lesione parete arteriolare. In questo modello, la dimensione del trombo ha raggiunto circa 100 secondi dopo la lesione laser, seguito da una serie di rapida embolizzazione piccolo per il successivo 2-3 min (dati non riportati). 9,10 Cinque minuti dopo la lesione laser, la dimensione t piastrinehrombus rimasta relativamente costante durante l'esposizione (5-25 minuti dopo l'infortunio laser, figure 3A-3C) e neutrofili rotolato su e aderito ai trombi piastrinici (figure 3A-3B, Video 2). Il segnale di fluorescenza delle piastrine circolanti era trascurabile in confronto con quelli dei trombo di piastrine. Il numero di neutrofili laminazione e aderente era 21,5 ± 3,0 e 1,6 ± 0,4 cellule più di 20 min, rispettivamente (Figure 3D-3E). Iniziale rotolamento rapida neutrofili verificato sulle cellule endoteliali. Una volta neutrofili contattato il trombo di piastrine, la velocità di rotolamento dei neutrofili su un trombo di piastrine è stato cambiato con un intervallo di 8,2 ± 1,1 micron al secondo (Figura 3F), che è mediata dalla interazione di P-selectina e PSGL-1. 11
Figura 1.Schema del sistema microscopio intravitale (A) e preparazione del muscolo cremastere microvasale (B).
Figura 2. Interazioni eterotipica di piastrine e dei neutrofili durante il TNF-α indotta infiammazione venulare in topi vivi. Piastrine e neutrofili sono stati rilevati da Dylight 488-coniugato anti-topo CD42c e Alexa Fluor 647-coniugato anti-topo Gr-1 anticorpi, rispettivamente. ( A) Rappresentante binarizzata immagini della comparsa di segnali di fluorescenza associati neutrofili (rosso) e delle piastrine (verde) per 180 sec. Freccia indica la direzione del flusso sanguigno. Bar = 10 micron. (BC) Il numero di rotolamento (cellule / minuto) e neutrofili (cellule aderenti / 5 min) su infiammate cellule endoteliali è mostrato. I dati rappresentano la media ± SEM di 30 divenule fferent in 4 topi selvatici. (D) Mediana segnale di fluorescenza integrato di piastrine (piastrine F) è un grafico in funzione del tempo. Nessun segnale è stato rilevato con Dylight 488-topo coniugato IgG di controllo (dati non mostrati).
Figura 3. Eterotipica interazione dei neutrofili con un trombo di piastrine al sito della lesione indotta da laser arteriolare in topi vivi. Piastrine e neutrofili sono stati rilevati come descritto nella Figura 2. (A) Un singolo neutrofili (rosso, una freccia gialla) passa sopra il trombo di piastrine (verde), mentre una seconda neutrofili (rosso, una freccia bianca) rotola rapidamente nel arteriolari cellule endoteliali, visualizzati più di 5 secondi. (B) Un singolo dei neutrofili (rosso) ribaltamento e di aderire ad un trombo piastrinici (verde) visualizzati per 15 sec . La freccia mostra al rotolamento e aderente neutrophils. Bar = 10 micron. La spessa, grigio freccia indica la direzione del flusso sanguigno. (C) Mediana segnale di fluorescenza integrato di piastrine (piastrine F) è un grafico in funzione del tempo. (DE) Il numero di neutrofili laminazione e aderente sul trombo piastrinico viene mostrato (cells/20 min). (F) La velocità di laminazione dei neutrofili sulle trombo di piastrine. I dati rappresentano la media ± SEM dei trombi 14 in 5 topi wild-type.
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Discussion
Qui si descrive un protocollo dettagliato per tempo reale microscopia a fluorescenza intravitale di visualizzare eterotipiche piastrine-neutrofili interazioni sull'endotelio vascolare attivato durante l'infiammazione e trombosi. In precedenza, simili approcci fluorescenza microscopiche sono stati segnalati per studiare il meccanismo molecolare della formazione di trombi e infiammazione vascolare. 8,12 Poiché il heterotypic interazione cellula-cellula potrebbe essere importante per vaso-occlusione al luogo di ferita, questa tecnologia sarà un valido strumento per studiare i meccanismi cellulari e molecolari della malattia vascolare. Il vantaggio della tecnologia in tempo reale di immagini è quello di monitorare le interazioni immediate e successive di cellule intravascolari sull'endotelio attivata / danneggiati in condizioni infiammatorie e trombotiche. Inoltre, il nostro sistema microscopico potrebbero essere utilizzati per studiare le interazioni tra eterotipiche cellule tumorali circolanti e endoteliali o globuli utilizzando fluorescently-marcato cellule tumorali o anticorpi contro marcatori cellulari tumorali umane come molecola di adesione delle cellule epiteliali (EpCAM). 13,14 Invece di utilizzare anticorpi marcati in fluorescenza, microscopia questa potrebbe anche essere eseguita con topi transgenici che esprimono proteine fluorescenti in un tipo cellulare specifico come CD41-EYFP + 15 megacariociti.
Con l'intensità di anticorpi marcati con fluorescenza, potremmo determinare la cinetica di formazione di trombi piastrinici e di espressione molecolare su cellule attivate intravascolari dopo danno vascolare. Tuttavia, la maggior parte degli anticorpi utilizzati in questo scopo inibire la funzione antigene che può provocare risultati inattesi. Pertanto, l'esperimento deve essere effettuata con particolare cura per ottimizzare la concentrazione alla quale l'anticorpo dà il segnale di fluorescenza sufficiente dal suo legame all'antigene senza influenzare la funzione antigene. Inoltre, la specificità dell'anticorpo è un'altra issue. E 'noto che le sottopopolazioni di cellule dendritiche e monociti esprimono bassi livelli di Gr-1 16.
Tuttavia, abbiamo trovato che i monociti sono solo 3-5% dei leucociti rotolamento durante l'infiammazione acuta e formazione di trombi, come determinato da un anticorpo marcato in fluorescenza contro topo F4/80 che è espresso esclusivamente in monociti e cellule dendritiche (dati non mostrati). Leucociti Pertanto, laminazione e più aderente durante TNF-α indotta infiammazione venulare e indotta da laser trombosi arteriolare sarebbe neutrofili.
In questo rapporto, abbiamo usato due modelli murini di malattie vascolari. Anche se ci rendiamo conto che nessun modello animale può ricapitolare condizioni di malattia umana, il lavoro svolto a livello dei microvasi di topi vivi che utilizzano questa tecnologia avrà una pertinenza diretta alle malattie umane e sarà facilmente traducibile per un migliore trattamento del trombo-malattie infiammatorie.
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Disclosures
Gli autori dichiarano alcun interesse finanziario concorrente.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni dal National Institutes of Health (P30 HL101302 e RO1 HL109439 a JC) e dell'American Heart Association (SDG 5.270.005 a JC). A. Barazia è stato sostenuto da una borsa di formazione T32HL007829 NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| MgCl2 6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | 144-55-8 | |
| 0.9% NaCl Saline | Hospira | 0409-4888-10 | |
| Ketamine | Hospira | 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Lloyd | ||
| Intramedic Tubing (PE 90) | BD Diagnostics | 427421 | |
| Intramedic Tubing (PE 10) | BD Diagnostics | 427401 | |
| Murine TNF-α | R&D Systems | 410-MT | |
| Dylight 488- labeled rat anti-mouse CD42b antibody | Emfret Analytics | X488 | |
| Alexa Fluor 647-conjugated anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) Antibody | BioLegend | 108418 | |
| NESLAB EX water bath/circulator | Thermo-Scientific | ||
| Olympus BX61W microscope | Olympus | ||
| TH4-100 Power | Olympus | ||
| Lambda DG-4 | Sutter | ||
| MPC-200 multi-manipulator | Sutter | ||
| R–-200 stage controller | Sutter | ||
| C9300 high-speed camera | Hamamatsu | ||
| Intensifier | Video Scope International | ||
| Ablation Laser | Photonic Instruments, Inc. | ||
| SlideBook 5.0 | Intelligent Imaging Innovations |
References
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