Summary
在这里，我们报告荧光活体显微镜可视化激活的内皮细胞在活体小鼠的血管炎症和血栓形成的异型血小板中性粒细胞相互作用的实验技术。显微技术将是很有价值的研究血管疾病的分子机制和病理生理条件下测试药物制剂。
Abstract
相互作用的活化的血小板和白细胞（主要是嗜中性粒细胞），活化的内皮细胞介导的血栓形成和血管炎症。1,2期间在现场小动脉损伤的血栓形成，血小板附着的激活的内皮细胞和内皮下基质蛋白支持中性粒细胞的轧制和粘附性。3相反，小静脉的炎症条件下，嗜中性粒细胞激活的内皮细胞的粘附，可以支持循环血小板的附着和蓄积。异型血小板中性粒细胞聚集需要由特定的受体计数器受体细胞之间的相互作用的顺序过程4，它是已知的，活化的内皮细胞释放粘附分子如von Willebrand因子，由此开始在高剪切条件下，血小板的附着和蓄积。5另外，支持中性粒细胞激活内皮细胞表达选择素的滚动和粘附ð细胞间粘附分子-1（ICAM-1），分别在低剪切条件下，4血小板P-选择交互与嗜中性粒细胞通过P-选择素糖蛋白配体-1（PSGL-1），从而诱导活化的嗜中性粒细胞β2整合和坚定两种类型的细胞之间的粘附。尽管在体外实验中，全血或分离的细胞，6,7异型血小板，中性粒细胞的相互作用确定的进步，这些研究不能操纵在血管疾病的氧化应激条件。在这份报告中，用鼠标血小板和中性粒细胞的标记荧光标记的特异性抗体，我们描述了一个详细的活体显微协议来监控异型相互作用的血小板和中性粒细胞活化的内皮细胞在TNF-α诱导的炎症或激光诱导提睾肌活体小鼠微血管的损伤。
Protocol
1。活体显微镜（图1A）的制备
- 准备灌流缓冲液（125 mM氯化钠，4.5 mM KCl中，2.5mM的CaCl 2的 ，1毫摩尔的MgCl 2，和17毫摩尔的NaHCO 3，pH为7.4）。
- 打开上的循环水浴中，在37℃的缓冲液，以保持温度和热控制毯用氮气曝气缓冲液（5％CO 2的平衡用氮气）。
- 打开显微镜系统（萨特LAMBDA DG-4高速波长变换器，BX61W工作站计算机上，奥林巴斯显微镜，MPC-200多机械手，净资产收益率200台控制器，高速相机，并增强）。
- 对于血管炎症模型，使用100％的分色镜。若要通过激光损伤诱导血栓形成，代替100％的50/50％的反射镜的反射镜，并打开一个微点激光消融系统。
2。准备提睾肌活体显微镜（图1B）
- 麻醉一腹腔注射氯胺酮（125毫克/千克体重（BW））和甲苯噻嗪（12.5 mg / kg体重）的雄性小鼠（6〜8周龄C57BL / 6）。大学伊利诺伊实验动物护理和使用委员会批准所有的动物保健和实验程序。对于一个血管炎症模型中，注入鼠TNF-α（0.5微克在250μl生理盐水）intrascrotally成鼠标3小时之前成像（2-2.5小时，在手术前）。
- 鼠标放置在37℃下的热控制的毛毯上的活体显微镜托盘。
- 拉了皮肤表面上的脖子上使用产钳，切割水平中线的颈部皮肤1厘米的剪刀。
- 轻轻地打开颈部肌肉，用钝头剪刀，取出气管周围的肌肉。
- 一个PE90管插入气管插管，以消除呼吸困难。
- 轻轻地取出颈肌的左侧，并从周围组织中分离出颈静脉。
- Ç每年迟到PE10管插入左颈静脉输液的抗体和额外麻醉药。
- 轻轻拉出，水平切开阴囊皮肤。整个实验过程中为了维持组织完整性，预热的缓冲液灌流超过手术字段。
- 按于下腹部有一个镊子，并与其他镊子，小心地拉出一个睾丸。
- 删除周围的睾丸周围的结缔组织。
- 垂直切开提睾肌和扁平的肌肉，通过固定的外围活体显微镜盘的一个盖玻片上。
- 允许的肌肉，以稳定数据采集前的10〜20分钟。我们的研究中被选择用于提睾肌动脉（血栓形成）和静脉（血管炎）的直径为30-45微米。
- 为了维持麻醉的条件下，注入相同的麻醉剂，大约每30分钟通过颈静脉cannulus 30-50毫升。
- 安置后的活体显微镜，打开SlideBook 5.0软件的鼠标，点击菜单栏上的“焦点访谈”窗口中设置相应的光学和目标（60X）。
- 输注Dylight 488-共轭的大鼠抗小鼠CD42c（0.1微克/克体重在100μl生理盐水）和Alexa Fluor 647 - 共轭的大鼠抗小鼠的Gr-1抗体（0.05微克/克体重在100μl生理盐水）通过颈cannulus中。
- 进入菜单栏，点击在工具栏上的“图像捕捉”。
- 会弹出一个新的菜单，在“图像”，选择“斌因子”的景点，并选择“640”宽度“460”的高度。
- 在“过滤设置”，选中复选框的渠道，你想揭露和设置曝光时间为每个。例如，打开通道：FITC通道10毫秒，50毫秒，和Cy5通道：50毫秒。
- 选择“时间推移捕捉”调整的时间点和时间间隔的数量。佛山r的炎症模型，200毫秒的时间间隔（经历的总时间：5分钟）的时间点的数目被设置为1,000-1,500。
- 点击“Test”在指定的曝光时间，该频道看到一个单一的平面图像。调整曝光时间和/或显微镜的光，直到直方图显示了足够的强度分布（对于多通道采集，重复此过程每个通道）。
- 一旦所有的参数设置（通道，曝光时间，等等）中的“图像捕捉”，选择“开始”开始捕捉。
- 监控发炎提睾小静脉的血管炎症模型的上半部分中的5分钟的轧制和粘附的血小板和嗜中性粒细胞。八至十个不同的静脉都记录在一个鼠标。
- 画像被使用的总放大倍数为60X（1.0 NA水浸物镜）给窗口大小为157微米×118微米。
- 实验完成后，将小鼠安乐死经由宫颈癌dislocatioN。
4。小静脉炎症模型的数据分析
- 打开SlideBook 5.0软件，点击菜单栏上的“文件夹”，打开一个文件。
- 点击下拉通道菜单，并选择“打开”，FITC，Cy5的，等等。“
- 点击“归一化（红色和绿色的条）”，并选择通道。拖动的左侧或右侧的红色和绿色的酒吧大致优化的荧光信号。
- 单击“应用”和“确定”以更新的形象。
- 单击“缩略图”按钮，选择当前显示为默认值。
- 播放拍摄的间隔拍摄的图像，滚动和粘附的中性粒细胞计数在5分钟内。
- 分析血小板血栓形成 ，到“面具”，然后选择“创建”。
- 命名口罩，并注明“在目前的图像”。
- 按“大”，“选框工具”在主视图中的铅笔图标。
- 颜色区域外的船只在主视图中设置背景遮罩。
- 转到吨“O”面具“下，单击”复制这架飞机“，单击”复制面具在目前的时间点“，并选择”所有时间点“，然后单击”OK“。
- 要计算背景信号中 ，“统计”，单击“”面膜统计“。
- 单击“目前的2D时间的推移或四维图像（S）”，在图像范围，然后选择“整个面具”戴面具的范围。在功能方面，选择“运行时间（HH：MM：毫秒）”根据拍摄日期，选择“根据形态测量的面积（像素）”，选择“最大强度”下的强度，并单击“导出”（此统计方法，使我们能够计算自体荧光强度（背景信号））。
- 在MS Office Excel中打开文本文件和记录期间的背景信号计算出的平均值。在这样的背景荧光强度。
- 要确定血栓的强度 ，点击“大铅笔图标”再次在“选框工具”在主视图中。
- 在主视图中设置血小板信号的容器内的颜色。
- “面具”，单击“复制这架飞机”，单击“复制面具在目前的时间点”，选择“所有时间点”，并单击“确定”。
- “统计”，单击“”面膜统计“。
- 单击“目前的2D时间的推移或四维图像（S）”，在图像范围，然后选择“整个面具”戴面具的范围。在功能方面，选择“运行时间（HH：MM：毫秒）”根据拍摄日期，选择“面积（像素）”根据形态测量学中，选择“求和强度”下的强度，并单击“导出”（此统计方法使我们能够计算在所述容器内的荧光强度）。
- 打开MS Office Excel中的文本文件中。的总和在容器内部的强度减去背景强度x面积（像素）的平均值，计算出荧光信号的血小板。这是血小板血栓的荧光强度。
- 重复此步骤3-5个不同的小鼠在30个不同的静脉。然后，计算出的荧光强度中位值的血小板。
- 对分析，滚滚涌入的中性粒细胞，中性粒细胞的滚动和粘附确定超过5分钟，在每个小静脉，表现为细胞数量每分钟。数固定为30秒，慢慢地爬（<10微米超过30秒），但没有翻身的粘附中性粒细胞的数量，表现为细胞数量每5分钟。
5。激光诱导小动脉血栓形成的活体显微镜
5-1消融激光校准
- 将镜像幻灯片在显微镜阶段，应用到幻灯片顶部的一小滴蒸馏水，调整的力度和重点使用的目镜。
- 打开“焦点访谈”窗口“，然后选择”选项卡中SlideBook 5.0软件的“FRAP”的。
- 设置激光功率在40-50，设定两个“双击重复”和“双击大小”8。标记的“指南”框中，带来了一组十字线。
- 选择“箭头”图标从任务栏Øn的屏幕顶部。
- 在“FRAP对齐”选项卡中，单击“下火”。应该出现在显示器左下角的一个小点。一旦在现场出现，双击它的中心。按下按钮后，另一点应出现上述第一点的权利，双击它。重复此为16点（16 个点会出现在右下角。），点击“保存”完成后，更新校准参数。
- 要测试的校准的精度，单击“上的”中心“按钮的小光点应出现在屏幕的中心。如果没有，请重新校准，直到达到所需的精度。
5-2激光诱导小动脉血栓形成
- 在显微镜下阶段将麻醉小鼠（2-2至2-12的程序）。
- 在“捕获”窗口中，选择一个协议或创建一个新的。设置如下：CY5（70毫秒暴露），公开组（10 MSEC曝光）和FITC（50毫秒暴露）。图像被捕获超过20分钟（约2,400时间点的间隔时间为500毫秒）。
- 输注Dylight 488共轭抗小鼠CD42c和Alexa Fluor 647-共轭抗小鼠的Gr-1抗体如上所述。
- 优化显微镜参数包括荧光强度和亮场图像所描述的3-3到3-7。
- 点击“测试”按钮，以确保适当的明场或抗体信号强度，小动脉的位置和重点。
- 单击“开始”，启动图像采集过程中。
- 消融激光发射前，请务必将鼠标指针图标已被选中，血管壁明确的重点。
- 要发射的激光，双击一个点2-3微米的血管壁内部。小动脉内皮细胞的损伤会导致视觉形状的变化，应该是明显的亮场图像，其次是血小板聚集。监视器血栓5分钟后，激光损伤的形成。
- 五分钟后，激光损伤（现在应该是稳定的血栓的大小）暂停和取消捕获。接着，启动捕获与2400的时间点，与一个500毫秒的时间间隔为20分钟记录粘附的血小板和滚动/粘附中性粒细胞。三至五年的动脉被记录在一个鼠标。
- 实验完成后，通过颈椎脱臼处死小鼠。
6。小动脉血栓形成模型的数据分析。
- 以上步骤4.1至4.5。
- 为了获得背景荧光强度血小板血栓的形成过程中 ，以上步骤4.7到4.14。
- “面具”，单击“分类”，选择FITC通道中，并插入背景信号的平均值低。点击“Apply”和“OK”。
- 为了分析血小板血栓的荧光强度（Dylight 488-共轭的抗CD42c抗体），
- 为了量化滚动和粘附中性粒细胞的 ，玩时光倒流，清晰可见，滚动超过20分钟的血小板血栓的细胞数一数。轧制相互作用定义为嗜中性粒细胞的速度减少，而与至少2秒的血小板血栓。遗民中性粒细胞被定义为任何仍然附着的血小板血栓的嗜中性粒细胞，至少2分钟。表现为细胞数量每20分钟滚动和粘附中性粒细胞的数量。轧制速度计算利用粒子跟踪系统。
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Representative Results
使用详细的活体显微镜分析，异型血小板中性粒细胞上的激活的内皮细胞的相互作用是可视化的荧光标记的血小板（CD42c）或嗜中性粒细胞的标记（的Gr-1）到活体小鼠抗输注。
在一个模型中的TNF-α诱导的小静脉的炎症，最轧制的中性粒细胞稳定地粘附到内皮细胞想必与ICAM-1的相互作用激活β2整合在记录期间（3-4.5小时后注射的TNF-α， 图2A 8滚动轴承和粘附中性粒细胞）。已经存在的视频捕捉之前开始由于TNF-α诱导的内皮细胞的活化。发炎的内皮细胞上的滚动和粘附的中性粒细胞的数目为0.25±0.05个细胞每分钟和18.5±0.7细胞，每5分钟，分别为（ 图2B和2C）。大部分的嗜中性粒细胞粘附到T他激活的内皮细胞的持续时间的视频捕获（1-1.5小时），和只有一个最小的贴壁细胞，一起在滚动细胞（数据未示出）中的最小增加减少。我们发现，大多数血小板粘附贴壁爬行的中性粒细胞，而不是发炎的血管壁（ 图2A，视频1）。血小板血栓积累和重复的持续时间的视频捕获栓塞。 如图2D中所示的集成的荧光信号与血小板粘附。
利用激光诱导小动脉血栓形成模型，我们能够观察和描述血小板和中性粒细胞在动脉壁损伤部位的的异型互动的。在此模型中，100秒左右达到顶峰血栓大小激光损伤后，随后的下一个2-3分钟（数据未示出）通过一系列的快速小栓塞。9,10激光损伤，五分钟后血小板吨的大小hrombus保持相对恒定的，在成像过程中（5-25分钟后，激光损伤， 图3A-3C）和嗜中性粒细胞上滚动和粘附的血小板血栓形成（ 图3A-3B，视频2）。从循环的血小板的荧光信号是微不足道的比较，与从血小板血栓。滚动和粘附的中性粒细胞的数量为21.5±3.0和1.6±0.4细胞在20分钟内，分别为（ 图3D-3E）。最初快速轧发生的嗜中性粒细胞上的血管内皮细胞。一旦中性粒细胞接触的血小板血栓，嗜中性粒细胞上的血小板血栓的轧制速度是每秒8.2±1.1微米（ 图3F），这是由P-selectin和PSGL-1的相互作用介导的的范围内改变11
图1。活体显微镜系统，提睾肌微血管（B）（A）和准备的示意图。
图2。异型的血小板和嗜中性粒细胞在活体小鼠的TNF-α诱导的小静脉炎症期间的相互作用。Dylight 488-偶联的抗小鼠CD42c和Alexa Fluor 647-偶联的抗小鼠的Gr-1抗体的检测血小板和嗜中性粒细胞，分别（ A）代表二值化的图像的外观与嗜中性粒细胞（红色）和血小板（绿色），超过180秒的荧光信号。箭头示出血液流动的方向。酒吧= 10微米（BC）的数目的滚动（细胞/分钟），并示出在发炎的内皮细胞上的粘附的中性粒细胞（细胞/ 5分钟）。数据代表平均值±SEM 30二4野生型小鼠。fferent静脉中（D）的中位数血小板（F血小板）的是，集成的荧光信号，作为时间的函数作图。 Dylight 488共轭控制大鼠IgG（数据未示出）没有检测到信号。
图3。在现场的激光诱导小动脉损伤的活体小鼠的中性粒细胞与血小板血栓，血小板和中性粒细胞的异型互动进行检测， 如图2所示。（A）A，中性粒细胞（红色，黄色箭头）滑过的血小板血栓（绿），而第二个中性粒细胞（红色，白色箭头）迅速地滑过小动脉内皮细胞，在5秒内显示。（B）A中性粒细胞（红色）滚来滚 去，并坚持在15秒内血小板血栓（绿色） 。箭头显示滚动和粘附NEutrophils。酒吧= 10微米。厚厚的灰色箭头所示方向的血流量。 （C）的中位数荧光信号综合的血小板（F血小板）被绘制为时间的函数的（DE）的数字示出的滚动和粘附的嗜中性粒细胞上的血小板血栓（cells/20分钟）（F）的轧制速度中性粒细胞在血小板血栓。数据代表平均值±SEM 14 5野生型小鼠中的血栓。
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Discussion
在这里，我们描述了一个详细的协议，实时荧光活体显微镜可视化激活的内皮细胞在血管炎症和血栓形成的异型血小板中性粒细胞的相互作用。在此之前，类似的荧光显微镜方法研究血栓形成和血管炎症的分子机制。8,12由于异型细胞与细胞间的相互作用可能是重要的，在损伤部位的血管闭塞，这种技术将是一个有价值的工具血管疾病的细胞和分子机制的研究。实时成像技术的优点是监测血管内细胞上的激活/损坏的内皮细胞在炎症和血栓形成的条件下立即和后继的相互作用。此外，我们的系统可以利用微观研究异型循环肿瘤细胞和内皮细胞或血液细胞之间的相互作用，使用荧光显微镜rescently-标记的肿瘤细胞或肿瘤细胞的标记物，如人上皮细胞粘附分子（EpCAM的）抗13,14相反，使用荧光标记的抗体，这也可以进行与在特定的细胞类型中表达荧光蛋白的转基因小鼠如CD41-EYFP +巨核细胞。
使用荧光标记的抗体的强度，我们能够确定血小板血栓形成和分子于活性炭上的血管内的血管损伤后的细胞中的表达的动力学。然而，大多数用于此目的的抗体抑制抗原的功能，这可能会导致意外的结果。因此，应进行实验与特别照顾到优化的抗体的浓度，在该浓度给出了足够的不影响抗原功能的情况下通过其结合到抗原的荧光信号。此外，该抗体的特异性是另一个国际空间站UE。它是已知的，树突状细胞和单核细胞的亚群中的Gr-1表达水平低。16
然而，我们发现，只有3-5％的轧制白细胞，单核细胞在急性炎症和血栓形成的过程中，所确定的表达在单核细胞和树突状细胞（数据未示出）中的荧光标记的抗体对小鼠F4/80。因此，大多数滚动和粘附在TNF-α诱导的小静脉的炎症和激光诱导的小动脉血栓白细胞将嗜中性粒细胞。
在这份报告中，我们用了两个血管疾病的小鼠模型。虽然我们明白，没有动物模型可以概括人类疾病的条件下，进行的工作微血管的活体小鼠，采用这种技术的一个直接相关的人类疾病和血栓炎症性疾病的更好的治疗，将很容易翻译。
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Disclosures
作者宣称没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
这项工作是支持的，部分由美国国立卫生研究院（：P30 HL101302和RO1 HL109439 JC）和美国心脏协会（SDG 5270005 JC）的补助金。答：Barazia是支持的，由一个T32HL007829美国国立卫生研究院培训补助金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| MgCl2 6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | 144-55-8 | |
| 0.9% NaCl Saline | Hospira | 0409-4888-10 | |
| Ketamine | Hospira | 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Lloyd | ||
| Intramedic Tubing (PE 90) | BD Diagnostics | 427421 | |
| Intramedic Tubing (PE 10) | BD Diagnostics | 427401 | |
| Murine TNF-α | R&D Systems | 410-MT | |
| Dylight 488- labeled rat anti-mouse CD42b antibody | Emfret Analytics | X488 | |
| Alexa Fluor 647-conjugated anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) Antibody | BioLegend | 108418 | |
| NESLAB EX water bath/circulator | Thermo-Scientific | ||
| Olympus BX61W microscope | Olympus | ||
| TH4-100 Power | Olympus | ||
| Lambda DG-4 | Sutter | ||
| MPC-200 multi-manipulator | Sutter | ||
| R–-200 stage controller | Sutter | ||
| C9300 high-speed camera | Hamamatsu | ||
| Intensifier | Video Scope International | ||
| Ablation Laser | Photonic Instruments, Inc. | ||
| SlideBook 5.0 | Intelligent Imaging Innovations |
References
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