Summary
ここでは、血管の炎症や生きたマウスにおける血栓形成の間に活性化内皮上の異血小板、好中球の相互作用を可視化する蛍光生体顕微鏡の実験手法を報告する。この顕微鏡技術は、血管疾患の分子メカニズムを研究することが、病態生理学的な条件下での薬理学的薬剤をテストするためにも役立ちます。
Abstract
活性化された内皮細胞を媒介血栓症および血管炎症で活性化された血小板と白血球の相互作用（主に好中球）。1,2動脈損傷部位に血栓形成の間、活性化内皮に付着した血小板と内皮下マトリックスタンパク質は、好中球のローリングや接着をサポートしています3逆に、細静脈の炎症性条件の下で、活性化された内皮細胞に付着して好中球が循環する血小板の付着·蓄積をサポートすることができます。異血小板好中球凝集は細胞間の特異的受容体-カウンター受容体の相互作用によってシーケンシャルプロセスを必要とします。4それが活性化された内皮細胞は、それによって高剪断条件下で血小板の接着および蓄積を開始する、そのようなvon Willebrand因子として接着分子を放出することが知られている。5はまた、活性化された内皮細胞は、セレクチン発現させることにより、好中球のローリングとの接着性をサポートD細胞間接着分子-1（ICAM-1）は、それぞれ、低剪断条件下で4血小板P-セレクチンは通って好中球と相互作用するP-セレクチン糖タンパク質リガンド-1（PSGL-1）することにより、好中球β2インテグリンと企業の活性化を誘導する2種類の細胞間の接着。異型の血小板、好中球の相互作用は、全血または単離された細胞、6,7で決定されたin vitroの実験での進歩にもかかわらず、それらの研究では、血管疾患の間に酸化ストレス状態を操作することはできません。本報告では、蛍光標識を使用して、マウス血小板および好中球のマーカーに対する特異的抗体は、我々はTNF-α誘導炎症時に活性化された内皮細胞に血小板や好中球の異型相互作用をモニターするための詳細な生体顕微鏡プロトコルを記述したり、レーザー誘起に続く生きたマウスの精巣挙筋の微小血管の損傷。
Protocol
1。生体内顕微鏡の調製（図1A）
- 灌流バッファー（125 mMのNaCl、4.5 mMのKClを、2.5 mMのCaCl 2、1mMのMgCl 2、17 mMの飽和NaHCO 3、pH7.4）を準備します。
- 37℃バッファおよび熱制御毛布の温度を維持するために、循環水浴℃にオンにします窒素ガス（5％CO 2が窒素とのバランス）でバッファを通気する。
- 顕微鏡システム（サッターラムダDG-4高速波長チェンジャー、ワークステーションコンピュータ、オリンパスBX61W顕微鏡は、MPC-200マルチマニピュレータ、ROE-200ステージコントローラ、高速カメラ、インテンシファイア）をオンにします。
- 血管炎症モデルでは、100パーセントダイクロイックミラーを使用しています。レーザー損傷による血栓形成を誘導するために、50/50％のミラーと100％のミラーを交換し、micropointレーザーアブレーションシステムの電源をオンにします。
2。生体顕微鏡用の精巣挙筋の調製（図1B）
- 麻酔をかけるケタミン（125 mg / kg体重（BW））およびキシラジン（12.5 mg / kg体重）の腹腔内注射により雄マウス（6-8週齢のC57BL / 6）。イリノイ州インスティテュー動物実験委員会の大学はすべての動物のケアと実験手順を承認した。血管炎症モデルでは、（手術前に2から2.5時間）前の画像へintrascrotallyマウス3時間にマウスTNF-α（250μlの生理食塩水で0.5μg）を注入します。
- 生体顕微鏡トレイに37℃の熱制御の毛布の上にマウスを置きます。
- 鉗子を使用して首の表面に皮を上に引いて、ハサミで1cmに水平に首の皮膚の正中線を切開。
- 優しく鈍はさみを使用して子宮頸部の筋肉を開き、気管を取り巻く筋肉を削除します。
- 呼吸困難を排除するための気管内チューブPE90カニューレを挿入。
- 優しく頸部筋肉の左側を削除し、周囲の組織から頚静脈を隔離する。
- Cアンヌ抗体および追加の麻酔薬の注入のための左頸静脈に遅くPE10チューブ。
- 優しく引き出し、水平に陰嚢の皮膚を切開する。実験を通して組織の完全性を維持するためには、あらかじめ温めておいたバッファは手術野の上に灌流した。
- 1鉗子と下腹部を押して、慎重に他の鉗子と睾丸を引き出します。
- 精巣の周りに周囲の結合組織を削除します。
- 垂直精巣挙筋を切開し、周囲を固定することによって、生体内顕微鏡トレイ上のカバーガラスの上に筋肉を平らにする。
- 筋肉のために10〜20分は、データ収集の前に安定させることができます。 30から45μmの直径を有する精巣挙筋細動脈（血栓形成）と細静脈は（血管の炎症のために）我々の研究のために選択された。
- 麻酔状態を維持するために、頸静cannulusを通して約30分毎に同じ麻酔薬の30-50 mlを吹き込む。
- 生体顕微鏡、オープンSlideBook 5.0ソフトウェア上でマウスを配置した後にして、適切な光学系と対物レンズ（60X）を設定するには、メニューバー上の "フォーカス·ウィンドウ"をクリックしてください。
- Dylightを吹き込む488結合ラット抗マウスCD42c（100μlの生理食塩水で0.1μg/ gでBW）とAlexa Fluor 647-結合ラット抗マウスGR-1抗体（100μlの生理食塩水に0.05μg/ gでBW）の頸静脈を介しcannulus 。
- メニューバーに移動し、ツールバーの "イメージキャプチャ"をクリックしてください。
- "イメージ"は、1x1のように "ビン·ファクター"を選択し、高さの幅と "460"の "640"を選択し、新しいメニューがポップアップ表示されます。
- "フィルタ設定"で、それぞれの露光時間を公開して、設定したいチャンネルのチェックボックスをマークします。たとえば、オープンチャネル：10ミリ、FITCチャンネル：50ミリ秒、およびCy5チャンネル：50ミリ。
- 時点と間隔の数を調整する "タイムラプス撮影"を選択します。フォーR炎症モデル、時間ポイントの数は、200ミリ秒（5分合計経過時間）の間隔で1,000〜1,500に設定されています。
- そのチャネルに指定された露光時間でシングルプレーンのイメージを表示するには "Test"をクリックします。ヒストグラムが適切な強度分布を（マルチチャンネル·キャプチャでは、各チャンネルごとに、このプロセスを繰り返します）が表示されるまでの露光時間および/または顕微鏡光を調整します。
- 一度すべてのパラメータは、 "イメージキャプチャ"で（チャンネル、露光時間など）が設定されて、キャプチャを開始するには "スタート"を選択します。
- 血管炎症モデルにおける炎症精巣挙小静脈の上半分に5分間圧延および付着血小板や好中球を監視します。八から十異なる細静脈は、1つのマウスに記録されます。
- 画像は157×118μmのμmのウィンドウサイズを与える60Xの総合倍率（1.0 NAの水浸対物レンズ）を使用して撮影した。
- 実験終了時には、マウスを頸椎dislocatio経由で安楽死させたnである。
4。細静脈の炎症モデルのためのデータ解析
- SlideBook 5.0ソフトウェアを開き、ファイルを開くには、メニューバーの "フォルダ"をクリックしてください。
- ドロップダウンチャンネルメニューをクリックし、 "オープン、FITC、Cy5で、等"を選択してください
- "（赤と緑のバー）再正規化"をクリックしてチャンネルを選択します。大体蛍光シグナルを最適化するために、左または右に赤と緑のバーをドラッグします。
- "適用"と "OK"画像を更新します。
- デフォルトとして、現在の表示を選択する "サムネイルボタン"をクリックします。
- キャプチャされたタイムラプス画像を再生し、5分間の間圧延および接着性好中球を数える。
- 血小板血栓形成を分析するには 、 "マスク"に行って、 "作成"を選択します。
- "現在のイメージでは"マスクとマークを付けます。
- メインビューで "矩形選択ツール"の "大規模な鉛筆アイコン"をクリックしてください。
- 背景マスクを設定するには、メインビューに容器の外側の領域に色をつける。
- tを行く○ "マスク"、 "この飛行機をコピー"をクリックし、 "現在の時点でコピーマスク"をクリックし、 "すべての時点"を選択し、 "OK"をクリックします。
- 背景信号を計算するには 、 "統計"に移動し、 "マスクの統計"をクリックします。
- イメージスコープで "現在の2D時間の経過または4D画像（s）"をクリックして、マスクの範囲内の "マスク全体"を選択します。特集では、 "経過時間（HH：MM：ミリ秒）"を選択してキャプチャの日付の下に、選択した "エリア（ピクセル）"形態計測で、強度の下で "最大輝度"を選択し、 "エクスポート"をクリック（この統計方法は、私たちにでき自家蛍光強度（バックグラウンド信号））を計算します。
- MS OfficeのExcelでテキストファイルを開き、記録期間を通じてバックグラウンド信号の平均値を計算します。これは、バックグラウンド蛍光強度である。
- 血栓強度を決定するには 、メインビューで"矩形選択ツール"で再び"大鉛筆アイコン"をクリックしてください。
- 血小板信号を設定するためのメインビューで、容器内の色。
- "マスク"に進み、 "この飛行機をコピー"をクリックし、 "現在の時点でのコピーマスク"をクリックし、 "すべての時点"を選択し、 "OK"をクリックします。
- "統計"に移動し、 "マスクの統計"をクリックします。
- イメージスコープで "現在の2D時間の経過または4D画像（s）"をクリックして、マスクの範囲内の "マスク全体"を選択します。機能では、選択して "経過時間（HH：MM：MS）の"キャプチャーの日付の下に、私たちにできるという "面積（画素）"形態計測で、強度の下で "合計強度"を選択し、 "エクスポート"（この統計方法をクリックし選択）容器内の蛍光強度を計算します。
- MS OfficeのExcelでテキストファイルを開きます。血小板の蛍光シグナルは、血管の内側の和の強度からバックグラウンド強度×面積（画素）の平均値を減算することによって計算されます。これは血小板血栓の蛍光強度である。
- 3〜5つの異なったマウスでは30種類の細静脈でこれを繰り返します。その後、血小板の蛍光強度の中央値を計算する。
- へ好中球のローリングとの接着性を分析し、好中球の転がり流入は各小静脈で5分間にわたって決定し、毎分の細胞数として発表された。 > 30秒間静止していたゆっくりとクロール（<10μmの30秒以上）がロールオーバーされませんでした付着性好中球数は、5分ごとの細胞数としてカウントされ、発表されました。
5。レーザー誘起動脈血栓症に対する生体顕微鏡
アブレーションレーザー5-1キャリブレーション
- 顕微鏡ステージ上でミラーリングされたスライドを入れ、スライドの上部に蒸留水の小滴を適用し、強度を調整して、接眼レンズを使用して焦点を当てています。
- "フォーカスウィンドウ"を開き、SlideBook 5.0ソフトウェアでは "FRAP"タブを選択します。
- 40から50にレーザパワーを設定し、両方の "ダブルクリックの繰り返し"と "ダブルクリックサイズ" 8に設定します。クロスヘアのセットを起動するには、 "ガイド"ボックスをマークします。
- タスクバーoから "矢印"アイコンを選択nは画面の上部に。
- "FRAPアライメント"タブで、 "次の火"をクリックしてください。小さなスポットは、モニターの左下隅の近くに表示されるはずです。スポットが表示されたら、それの中心をダブルクリックします。一度クリックすると、別の場所は、上記に表示され、最初のスポットの右側にする必要があり、それをダブルクリックします。キャリブレーションパラメータを更新するために完了したら、 "Save"をクリックします（16 番目のスポットは、右下隅に表示されます。）16点に対してこの手順を繰り返します。
- キャリブレーションの精度をテストするには、画面の中央に表示されるはずです "センター"ボタン小さなスポットをクリックしてください。されていない場合は、所望の精度が達成されるまで、校正を繰り返す。
5月2日レーザー誘起細動脈の血栓形成
- 顕微鏡ステージ上でマウスを麻酔し（2-2〜2-12の手順を参照してください）を配置します。
- "キャプチャ"ウィンドウの下のプロトコルを選択するか、または新しいものを作成します。設定は次のとおりです。CY5（70ミリ秒露光）、オープン（10 MSEC露出）、およびFITC（50ミリ秒露光）。画像は20分（500ミリ秒のインターバル時間が約2400時間点）上に捕捉される。
- Dylight前述のように488結合抗マウスCD42cおよびAlexa Fluor 647標識抗マウスGR-1抗体を吹き込む。
- 3-7を3-3で説明されているように、蛍光強度と、明視野顕微鏡像を含むパラメータを最適化します。
- 適切な明視野強度や抗体シグナル、動脈配置し、フォーカスを確保するための "テスト"ボタンをクリックします。
- イメージキャプチャプロセスを開始するために "Start"をクリックしてください。
- アブレーションレーザーを発射する前に、マウスポインターのアイコンが選択され、血管壁に明確な焦点になっていることをされていることを確認してください。
- レーザーを発射するには、二重容器壁2から3μmの内部でスポットをクリックしてください。細動脈内皮細胞の傷害が明視野像では明らかなはずである視覚的形状の変更が生じますが、血小板の蓄積が続く。モニター血栓レーザー損傷後の5分間形成。
- レーザー損傷5分後に一時停止（血栓サイズは、現在安定していなければならない）とキャプチャをキャンセルします。その後、20分間付着血小板やローリング/付着した好中球を記録するために500ミリ秒間隔で2400年時点でキャプチャを開始。 3〜5個の動脈は、1つのマウスに記録されます。
- 実験終了時には、マウスを頸椎脱臼を経由して安楽死させた。
6。動脈血栓モデルのためのデータ解析
- 4.5〜ステップ4.1を越える。
- 血小板血栓形成中にバックグラウンド蛍光強度を得るためには 、4.14〜ステップ4.7を越える。
- "マスク"に進み、 "セグメント"をクリックして、チャネル内のFITCを選択して、ローに背景信号の平均値を挿入します。 "適用"をクリックし、 "OK"をクリックします。
- 血小板血栓の蛍光強度（Dylight 488結合抗CD42c抗体）を分析するために、
- 圧延および好中球の接着を定量化するために 、微速度撮影を再生し、目に見えて20分かけて血小板血栓をロールオーバーしたセルの数をカウントします。少なくとも2秒間血小板血栓と対話しながらのローリングは、好中球の速度の低下として定義されています。付着した好中球は、少なくとも2分間血小板血栓に接続されたまま、任意の好中球のように定義されます。ローリングと接着好中球数は、20分あたりの細胞数として発表された。ローリング速度は、粒子追跡システムを用いて算出した。
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Representative Results
詳細な生体顕微鏡分析を用いて、活性化された内皮細胞上の異型の血小板、好中球の相互作用は、生きたマウスへ血小板（CD42c）または好中球マーカー（GR-1）に対する蛍光標識抗体の注入による可視化した。
TNF-α誘導細静脈の炎症のモデルでは、最も転がり好中球は安定記録期間（TNF-αの注射後3から4.5時間、 図2Aの間に、ICAM-1の活性化β2インテグリンとの相互作用によっておそらくは内皮に付着させたビデオキャプチャはTNF-α誘導内皮細胞活性化のために開始される前に）。8ローリングや接着好中球は、すでに存在していた。炎症を起こした内皮細胞上圧延及び接着好中球数は0.25±0.05であった分当たりの細胞および18.5±それぞれ5分間当たり0.7細胞（ 図2B及び2C）。最も好中球は、tに付着させた彼はビデオキャプチャの継続時間（1〜1.5時間）の内皮細胞を活性化し、接着した細胞内の最小限の減少は、ローリング細胞（データは示さず）で最小限の増加に伴ってのみありました。我々は、ほとんどの血小板が付着し、クロール好中球ではなく、炎症を起こした血管壁（ 図2A、ビデオ1）に準拠していることがわかった。血小板血栓が蓄積され、ビデオキャプチャの持続時間のために繰り返し塞栓。付着した血小板に関連付けられている統合された蛍光シグナルは、 図2Dに示された。
レーザー誘起動脈血栓モデルを駆使して、動脈壁の損傷部位に血小板および好中球の異型相互作用を調べ、特徴づけることができました。このモデルでは、血栓の大きさは、次の2〜3分（データは示していない）のための迅速な小さな塞栓のシリーズに続いて、レーザー損傷後100秒の周りにピークを迎えた。レーザー損傷後の9,10五分、血小板トンの大きさは、hrombusは、画像形成中に比較的一定のままであった（レーザー損傷後の5月25日分、 図3A〜3C）と好中球が上にロールバックされ、血小板血栓（ 図3A-3B、ビデオ2）に付着した。循環血小板からの蛍光シグナルは血小板血栓からと比較してごくわずかであった。ローリングと接着好中球数は21.5であったそれぞれ±20分、（ 図3D-3E）以上3.0および1.6±0.4細胞。好中球の初期の迅速なローリングは内皮細胞に発生しました。一度好中球は±血小板血栓に好中球の転がり速度は8.2の範囲で変化させた、血小板血栓に連絡をP-セレクチンとの相互作用によって媒介される毎秒1.1ミクロン（ 図3F）、およびPSGL-1の11
図1。生体顕微鏡システムの概略図（a）および精巣挙筋微小血管（B）の準備。
図2。生きたマウスにおけるTNF-α誘導細静脈の炎症時に血小板や好中球の異型相互作用。血小板や好中球は、それぞれDylight 488結合抗マウスCD42cおよびAlexa Fluor 647標識抗マウスGR-1抗体によって検出した。（ ）代表は、好中球（赤）と180秒以上血小板（緑）に関連付けられた蛍光シグナルの外観の画像を二値化。矢印は、血流の方向を示しています。バー= 10μmである。（BC）の圧延の数（個/分）や炎症、内皮細胞上の接着性の好中球（細胞/ 5分）が示されています。データは、30ジの平均±SEMを表す4野生型マウスfferent細静脈は（D）血小板（血小板、F）の中央値は統合された蛍光シグナルを時間の関数としてプロットしたものである。シグナルがDylight 488共役コントロールラットIgG（データは示さず）で検出されなかった。
図3。図2で説明したように生きたマウスにおけるレーザー誘起動脈損傷部位に血小板血栓による好中球の異型の相互作用。血小板や好中球が検出された（A）単一の好中球（赤、黄色の矢印）血小板血栓をロールオーバー第二好中球（赤、白矢印）が急速に5秒かけ示す細動脈内皮細胞、ロールオーバーしている。（緑）、（B）は、単一の好中球（赤色）がロールオーバーし、15秒かけ示す血小板血栓（緑）に付着している。矢じりは、ローリングと接着NEを示していますutrophils。バー=10μmである。厚く、灰色の矢印は血流の方向を示しています。 （C）は血小板（血小板、F）の中央値は統合された蛍光シグナルを時間の関数としてプロットしたものである。（DE）は血小板血栓でローリングや接着好中球数（cells/20分）表示されます（F）の転がり速度血小板血栓以上の好中球。データは、5野生型マウスにおける14血栓の平均±SEMを表す。
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Discussion
ここでは、血管の炎症や血栓症の間に活性化内皮上の異血小板、好中球の相互作用を可視化するためのリアルタイム蛍光生体顕微鏡検査のための詳細なプロトコルを記述します。以前、似たような蛍光顕微鏡のアプローチは血栓形成と血管炎症の分子メカニズムを研究することが報告された。8,12異型細胞間の相互作用は、損傷部位での血管閉塞のために重要であるかもしれないので、この技術はのための貴重なツールとなるでしょう血管疾患の細胞および分子メカニズムを研究。リアルタイムイメージング技術の利点は、炎症性および血栓条件下で活性化/損傷した血管内皮細胞上の細胞の即時および後続の相互作用をモニターすることです。さらに、私たちの顕微鏡システムはフルオを使用して循環腫瘍細胞と内皮や血液細胞間の相互作用を研究する異型で利用することができるそのようなヒト上皮細胞接着分子（EpCAM）などの腫瘍細胞マーカーに対する腫瘍細胞または抗体rescently標識。蛍光標識された抗体を用いての13,14代わりに、この顕微鏡はまた、特定の細胞型で蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスを用いて実施することができるCD41-EYFP +巨核球など15
蛍光標識された抗体の強度を用いて、我々は、血管損傷後に活性化された血管内の細胞で血小板血栓の形成および分子発現の動態を決定することができる。しかし、この目的で使用されるほとんどの抗体は、予期しない結果になることがあり抗原機能を阻害する。したがって、実験は抗体が抗原の機能に影響を与えることなく、抗原との結合により、十分な蛍光シグナルを与えた濃度を最適化するために特別な注意を払って行われるべきである。また、抗体の特異性は、別のISSですUE。これは、樹状細胞および単球の亜集団は、GR-1の低レベルで発現することが知られている16
それにもかかわらず、我々は、単球や樹状細胞（データは示さず）で排他的に発現しているマウスF4/80に対する蛍光標識抗体によって決まり、単球は急性炎症や血栓形成の間圧延白血球の3〜5％であることがわかった。したがって、TNF-α誘導細静脈の炎症やレーザー誘起動脈血栓症の間に最も圧延および付着白血球は好中球であろう。
本稿では、血管疾患の2つのマウスモデルを使用していました。我々は動物モデルはヒトの疾病状態を再現できないことを理解しているが、この技術を用いて生きたマウスの微小血管内に行われた作業は、ヒトの疾患に直接関連を有することになり、血栓炎症性疾患のより良い治療への翻訳を簡単にするようになります。
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Disclosures
著者らは競合する経済的利害関係を宣言しない。
Acknowledgments
この作品は、国立衛生研究所からの助成金（JC〜P30のHL101302とRO1 HL109439）とアメリカ心臓協会（JCへSDG 5270005）によって部分的にサポートされていました。 A. BaraziaはT32HL007829 NIHの訓練助成金によって支えられている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| MgCl2 6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | 144-55-8 | |
| 0.9% NaCl Saline | Hospira | 0409-4888-10 | |
| Ketamine | Hospira | 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Lloyd | ||
| Intramedic Tubing (PE 90) | BD Diagnostics | 427421 | |
| Intramedic Tubing (PE 10) | BD Diagnostics | 427401 | |
| Murine TNF-α | R&D Systems | 410-MT | |
| Dylight 488- labeled rat anti-mouse CD42b antibody | Emfret Analytics | X488 | |
| Alexa Fluor 647-conjugated anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) Antibody | BioLegend | 108418 | |
| NESLAB EX water bath/circulator | Thermo-Scientific | ||
| Olympus BX61W microscope | Olympus | ||
| TH4-100 Power | Olympus | ||
| Lambda DG-4 | Sutter | ||
| MPC-200 multi-manipulator | Sutter | ||
| R–-200 stage controller | Sutter | ||
| C9300 high-speed camera | Hamamatsu | ||
| Intensifier | Video Scope International | ||
| Ablation Laser | Photonic Instruments, Inc. | ||
| SlideBook 5.0 | Intelligent Imaging Innovations |
References
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