Summary
כאן אנו מדווחים טכניקה ניסויית של מיקרוסקופיה intravital פלואורסצנטי לדמיין אינטראקציות heterotypic טסיות דם נויטרופילים על האנדותל הופעל במהלך דלקת כלי דם והיווצרות קרישים בעכברים חיים. טכנולוגיה מיקרוסקופית זה תהיה יקרה כדי לחקור את המנגנון המולקולרי של מחלת כלי דם ולבדוק סוכנים תרופתיים בתנאי pathophysiological.
Abstract
אינטראקציה של טסיות הופעלה ולויקוציטים (בעיקר הנויטרופילים) על פקק הפעילים האנדותל המתווכים ודלקת בכלי דם. 1,2 במהלך היווצרות פקיק באתר של פציעת ארטריולות, טסיות חסיד לאנדותל הופעל וחלבוני מטריקס subendothelial לתמוך מתגלגלים והידבקות נויטרופילים. 3 לעומת זאת, בתנאים דלקתיים venular, נויטרופילים חסיד לאנדותל הופעל יכולים לתמוך הידבקות והצטברות של טסיות דם במחזור. צבירת heterotypic טסיות דם נויטרופילים דורשת תהליכים רציפים על ידי אינטראקציות הקולטן קולט ללא מרשם הספציפיות בין תאים. 4 זה ידוע כי תאי האנדותל הופעלו לשחרר מולקולות דבקות כגון גורם Willebrand פון, ובכך ליזום הידבקות והצטברות טסיות דם בתנאי גזירה גבוהים. 5 כמו כן, תאי האנדותל הופעלו לתמוך מתגלגלים נויטרופילים והידבקות ידי selectins מבטאמולקולה-1 ד אינטר הידבקות (Icam-1), בהתאמה, בתנאי גזירה נמוכות. 4 טסיות דם P-selectin אינטראקציה עם נויטרופילים דרך P-גליקופרוטאין selectin יגנד-1 (PSGL-1), וכך גורם הפעלה של β2 integrins ומשרד נויטרופילים הדבקה בין שני סוגי תאים. למרות ההתקדמות בניסויים במבחנה שבה אינטראקציות heterotypic טסיות דם נויטרופילים נקבעות בדם או תאים מבודדים, 6,7 מחקרים אלו לא יכולים לתפעל את תנאי עקת חמצון במהלך מחלת כלי דם. בדו"ח זה, באמצעות נוגדנים שכותרת-fluorescently, ספציפיים נגד הטסיות וסמן עכבר נויטרופילים, אנו מתארים פרוטוקול מיקרוסקופי intravital מפורט לנטר אינטראקציות heterotypic של טסיות דם ונויטרופילים על האנדותל הופעל במהלך דלקת-α-Induced TNF או לאחר ליזר מושרה פציעה בשריר cremaster microvessels של עכברים חיים.
Protocol
1. הכנת מיקרוסקופ Intravital (איור 1 א)
- הכן את חיץ superfusion (125 mM NaCl, KCl 4.5 מ"מ, 2.5 המ"מ CaCl 2, 1 mM MgCl 2, ומ"מ NaHCO 17 3, 7.4 pH).
- הפעל אמבט מי דם כדי לשמור על טמפרטורה של חיץ ושמיכה תרם מבוקרת על 37 ° C. לאוורר חיץ עם גז חנקן (5% CO 2 מאוזן עם חנקן).
- הפעל את מערכת מיקרוסקופ (סאטר מבדה DG-4 במהירות גבוה גל מחליף, תחנת עבודת מחשב, מיקרוסקופ BX61W אולימפוס, MPC-200 רב מניפולטור, בקר השלב ROE-200, מצלמה במהירות גבוהה, ומגבר).
- למודל דלקת כלי דם, להשתמש 100% מראה Dichroic. כדי לגרום להיווצרות קרישים על ידי פגיעת ליזר, החלף מראה 100% עם מראה% 50/50 ולהפעיל מערכת אבלציה ליזר micropoint.
2. ההכנה של שריר Cremaster למיקרוסקופיה Intravital (האיור 1B)
- הרדםעכבר זכר (6-8 שבועות, C57BL / 6) על ידי הזרקת ה-IP של קטמין (במשקל 125 מ"ג / קילו משקל גוף (BW)) וxylazine (12.5 מ"ג / קילו BW). אוניברסיטת אילינוי המוסדי טיפול בבעלי חיים ושימוש ועדה אשרה את כל הטיפול בבעלי החיים ופרוצדורות. למודל דלקת כלי דם, להזריק עכברי TNF-α (0.5 מיקרוגרם במלח μl 250) intrascrotally לתוך 3 שעות לפני עכבר ההדמיה (2-2.5 שעות לפני הניתוח).
- הנח את העכבר על שמיכה תרמה מבוקרת על 37 מעלות צלזיוס במגש מיקרוסקופ intravital.
- משוך את העור על פני השטח של הצוואר באמצעות מלקחיים וחתוך קו האמצע של עור הצוואר אופקי עד 1 סנטימטר עם מספריים.
- בעדינות לפתוח את שרירי צוואר הרחם באמצעות מספריים קהים ולהסיר את השריר המקיף את קנה הנשימה.
- Cannulate צינור לתוך קנה הנשימה PE90 לחסל קשיי נשימה.
- סור בעדינות את הצד השמאלי של שרירי צוואר רחם ולבודד את וריד הצוואר מרקמות סובבות.
- ג annuמאוחר צינור PE10 לתוך עורק הצוואר השמאלי לעירוי של נוגדנים וחומרי הרדמה נוספת.
- משוך בעדינות החוצה וחתוך עור אשכים בצורה אופקית. כדי לשמור על שלמות רקמות לאורך הניסוי, מאגר prewarmed היה superfused על שדה הניתוח.
- לחץ על הבטן התחתונה עם מלקחיים אחד ומושך בזהירות את אשך עם מלקחיים האחרים.
- הסר את רקמות חיבור המקיפים סביב האשך.
- חתוך שריר cremaster האנכי ולשטח את השריר על coverslip זכוכית על מגש מיקרוסקופ intravital ידי מצמיד הפריפריה.
- לאפשר 10-20 דקות לשרירים לייצוב לפני איסוף נתונים. arterioles Cremaster שרירים (להיווצרות פקיק) וvenules (לדלקת כלי דם) בקוטר של 30-45 מיקרומטר נבחרו למחקר שלנו.
- כדי לשמור על תנאי הרדמה, להזרים 30-50 מ"ל של חומר ההרדמה הזהה בערך כל 30 דקות באמצעות cannulus הצוואר.
- לאחר מיקום של העכבר על מיקרוסקופ intravital, תוכנת 5.0 הפתוחות SlideBook ולחץ על "חלון פוקוס" בשורת תפריט כדי להגדיר את אופטיקה והאובייקטיבית (60x) המתאימה.
- להשרות Dylight 488-מצומדות חולדה אנטי עכבר CD42c (0.1 מיקרוגרם / גרם BW במלח μl 100) ואלקסה פלואוריד-1-647 Gr נוגדנים מצומדות חולדה אנטי עכבר (0.05 מיקרוגרם / גרם BW במלח μl 100) דרך cannulus צוואר .
- עבור לשורת תפריט, ולחץ על "לכיד תמונה" בסרגל הכלים.
- תפריט חדש יצוץ; ב" תמונה ", בחר" פקטור סל "כ1x1 ולבחור" 640 "ברוחב ו" 460" בגובה.
- ב" סט מסנן ", סמן את תיבת סימון עבור הערוצים שברצונך לחשוף ולהגדיר את זמן החשיפה לכל אחד. לדוגמה, ערוץ פתוח: 10 אלפיות שני, FITC ערוץ: 50 אלפית שני, וCy5 ערוץ: 50 אלפית שני.
- בחר "לכידת זמן לשגות" כדי להתאים את מספר נקודתי זמן והמרווח. For מודל הדלקת, מספר נקודתי זמן מוגדר 1,000-1,500 עם מרווח של 200 אלפיות שני (סך כל זמן שחלף: 5 דקות).
- לחץ על "בדיקה" כדי לראות תמונה אחת מטוס בזמן החשיפה המצוין עבור ערוץ זה. התאם זמן חשיפה ו / או מיקרוסקופ אור עד ההיסטוגרמה מראה חלוקת עוצמת נאותה (ללכידה רבה ערוצית, חזור על תהליך זה עבור כל ערוץ).
- לאחר שכל אחד מהפרמטרים מוגדרים (ערוצים, זמני חשיפה, וכן הלאה) ב" הלכיד תמונה ", בחר" התחל "כדי להתחיל לכידה.
- לפקח וטסיות נויטרופילים מתגלגלות וחסיד ל5 דקות במחצית העליונה של רדיד cremaster מודלק במודל הדלקת בכלי הדם. שמונה עד עשר venules שונה נרשמים בעכבר אחד.
- תמונות צולמו באמצעות גדלה כוללת של 60x (1.0 אובייקטיבי טבילה במי NA) נותנת גודל חלון של 157 x 118 מיקרומטר מיקרומטר.
- עם השלמת הניסוי, העכברים מורדמים דרך צוואר הרחם dislocation.
4. ניתוח נתונים לדגם דלקת Venular
- פתח את תוכנת 5.0 SlideBook ולחץ על "תיקייה" בשורת התפריטים כדי לפתוח קובץ.
- לחץ על התפריט הנפתח הערוץ ובחר "פתח, FITC, Cy5, וכו '"
- לחץ על "Renormalize (פסים אדומים וירוקים)" ובחר את הערוץ. גרור את הסורגים האדומים וירוקים לשמאל או לימין בערך כדי לייעל את אות פלואורסצנטי.
- לחץ על "החל" ועל "אישור" כדי לעדכן את התמונה.
- לחץ על הלחצן "תמונה ממוזערת" כדי לבחור תצוגה נוכחית כברירת המחדל.
- שחק תמונת timelapse נתפס, ולספור נויטרופילים מתגלגלים וחסיד בתקופת 5 דקות.
- כדי לנתח את היווצרות פקיק הטסיות, ללכת "מסכה" ובחר באפשרות "צור".
- תן שם מסיכה וסימן "בתמונה הנוכחית".
- לחץ על "סמל עיפרון גדול" ב" כלי Marquee "בתצוגה הראשית.
- צובע את האזור מחוץ לכלי בתצוגה הראשית להגדיר מסכת רקע.
- עבור to "מסכה", לחץ על "העתק המטוס הזה", לחץ על "מסכה העתק בtimepoint הנוכחי" ובחר "כל נקודתי הזמן", ולחץ על "אישור".
- כדי לחשב אות רקע, ללכת "סטטיסטיקה" ולחץ על "סטטיסטיקת מסכה".
- לחץ על "זמן פקיעה נוכחית 2D או 4D תמונה (ות)" בהיקף תמונה, ובחר "מסכה כולה" בהיקף מסיכה. בתכונות, בחר "זמן שחלף (hh: mm: ms)" תחת תאריך של לכידה, בחר "שטח (פיקסלים)" תחת Morphometry, בוחר "עצמה מרבית" תחת עצמה, ולחץ על "יצוא" (שיטת נתון זה מאפשר לנו עוצמת חישוב אוטומטי פלואורסצנטי (אות רקע)).
- פתח את קובץ הטקסט ב-MS Office Excel ולחשב את הערך הממוצע של אות רקע לאורך תקופת ההקלטה. זו עוצמת קרינת הרקע.
- כדי לקבוע עוצמת פקיק, לחץ על "סמל עיפרון גדול" שוב ב" כלי Marquee "בתצוגה הראשית.
- צבע בתוך הכלי בתצוגה הראשית להגדיר אות טסיות דם.
- עבור ל" מסכה ", לחץ על" העתק המטוס הזה ", לחץ על" מסכה העתק בtimepoint הנוכחי ", בחר" כל נקודתי הזמן ", ולחץ על" אישור ".
- עבור ל" סטטיסטיקה "ולחץ על" סטטיסטיקת מסכה ".
- לחץ על "זמן פקיעה נוכחית 2D או 4D תמונה (ות)" בהיקף תמונה, ובחר "מסכה כולה" בהיקף מסיכה. בתכונות, בחר "זמן שחלף (hh: mm: ms)" תחת תאריך של לכידה, בחר "שטח (פיקסלים)" תחת Morphometry, בחר "עצמת סכום" תחת עצמה, ולחץ על "יצוא" (שיטת נתון זה מאפשר לנו לחשב את עוצמת הקרינה בתוך הכלי).
- פתח את קובץ הטקסט ב-MS Office Excel. אות קרינה של טסיות מחושבת על ידי הפחתת הערך הממוצע של שטח x עוצמת רקע (פיקסל) מעוצמת הסכום של חלק הפנימי של כלי הדם. זו עוצמת הקרינה של פקיק טסיות הדם.
- חזור על פעולה זו ב30 venules שונה ב3-5 עכברים שונים. ואז, לחשב ערך החציוני של עוצמת הקרינה של טסיות דם.
- אללנתח מתגלגלים והידבקות נויטרופילים, זרם הגלגול של הנויטרופילים נקבע על 5 דקות בכל אחד ורדיד ומוצג כמספרים סלולריים לדקה. מספר הנויטרופילים חסיד שהיו נייחים ל> 30 שניות וזחלו לאט (<10 מיקרומטר מעל 30 שניות), אך לא להתהפך, נספר והוצג כמספרים סלולריים לכל 5 דקות.
5. מיקרוסקופיה Intravital לפקק arteriolar ליזר מושרה
5-1 כיול של ליזר אבלציה
- הנח שקופית שיקוף על במת מיקרוסקופ, תחול ירידה קטנה של מים מזוקקים לראש המגלשה, ולהתאים את העוצמת ולהתמקד באמצעות העינית.
- פתח חלון "פוקוס" ובחר בכרטיסייה "FRAP" בתוכנת 5.0 SlideBook.
- הגדר את עוצמת הליזר ב40-50, ולהגדיר שתי החזרות הכפולות "קליק", "גודל לחץ לחיצה כפול" ל8. סמן בתיבה "המדריך" כדי להעלות את הערכה של כוונת.
- בחר בסמל "החץ" משורת המשימות on החלק העליון של המסך.
- תחת הלשונית "יישור FRAP", לחץ על "אש הבאה". נקודה קטנה צריכה להופיע בסמוך לפינה השמאלית התחתונה בצג. ברגע שהנקודה מופיעה, לחץ לחיצה כפולה על מרכזה. לאחר שילחץ, מקום אחר צריך להופיע מעל ומהימין למקום הראשון; לחיצה כפולה עליו. חזור על פעולה זו במשך 16 נקודות (המקום 16 ביופיע בפינה הימנית התחתונה.) לחץ על "שמורות" כששלם כדי לעדכן את הפרמטרים של הכיול.
- כדי לבדוק את הדיוק של הכיול, לחץ על "המרכז" כפתור נקודה הקטנה אמורים להופיע במרכז המסך. אם לא, חזור כיול עד דיוק רצוי מושג.
היווצרות ליזר מושרה ארטריולות 5-2 פקיק
- הנח את עכבר מורדם (עיין בהליך של 2-2 ל2-12) על במת מיקרוסקופ.
- מתחת לחלון "הלכיד", בחר פרוטוקול או ליצור אחד חדש. ההגדרות הן כדלקמן: CY5 (70 אלפיות חשיפה), פתוח (10 MSEג חשיפה), וFITC (50 אלפיות חשיפה). צילום תמונה מעל 20 דקות (כ -2,400 נקודתי זמן עם זמן מרווח של 500 אלפיות שני).
- להשרות Dylight 647-מצומדות אנטי עכבר Gr-1 נוגדנים 488-מצומדות אנטי עכבר Alexa פלואוריד CD42c וכפי שתוארו לעיל.
- לייעל פרמטרי מיקרוסקופ כולל עוצמת קרינה ותמונת שדה בהירה, כמתואר ב3-3 ל3-7.
- לחץ על הכפתור "הבדיקה" כדי להבטיח עצמה נכונה brightfield או אות נוגדנים, מיקום עורקיק ומיקוד.
- לחץ על "התחל" כדי להתחיל את התהליך לכיד תמונה.
- לפני ירי ליזר אבלציה, ודא שסמל מצביע העכבר נבחר ושקיר הכלי הוא במיקוד ברור.
- לירות ליזר, לחץ לחיצה כפולה על נקודה פנימית 2-3 מיקרומטר מדופן כלי הדם. פציעה של תאי האנדותל arteriolar גורמת לשינוי צורה ויזואלית שצריכה להיות ברורים בתמונת brightfield, ואחריו הצטברות טסיות דם. הצג פקיקהיווצרות למשך 5 דקות לאחר פציעה בליזר.
- חמש דקות לאחר פציעת ליזר (גודל פקיק צריך עכשיו להיות יציב) לעצור ולבטל את לכידתו. לאחר מכן, תתחיל ללכוד עם 2400 נקודתי זמן עם מרווח 500 אלפיות שני כדי להקליט טסיות חסיד ונויטרופילים מתגלגלים / חסיד למשך 20 דקות. שלוש עד חמישה arterioles נרשמים בעכבר אחד.
- עם השלמת הניסוי, עכברים מורדמים באמצעות נקע בצוואר רחם.
6. ניתוח נתונים לדגם פקק arteriolar
- עבור על שלבים 4.1 עד 4.5.
- כדי להשיג את עוצמת קרינת הרקע במהלך היווצרות פקיק הטסיות, תעבור על שלבים 4.7 עד 4.14.
- עבור ל" מסכה ", לחץ על" מגזר ", בחר בערוץ FITC, והכנס את הערך הממוצע של אות רקע על נמוך. לחץ על "החל" ועל "אישור".
- כדי לנתח את עוצמת הקרינה של פקיק טסיות (נוגדן 488-מצומדות אנטי CD42c Dylight),
- כדי לכמת את הנויטרופילים המתגלגלים וחסיד, לשחק timelapse ולספור את מספר התאים שבעליל להתגלגל על פקיק הטסיות מעל 20 דקות. רולינג מוגדר כירידה במהירות נויטרופילים תוך אינטראקציה עם פקיק טסיות הדם לפחות 2 שניות. הנויטרופילים חסיד מוגדרים ככל נויטרופילים שנשארים צמוד לפקיק הטסיות לפחות 2 דקות. מספר הנויטרופילים מתגלגלים וחסיד הוצג כמספרים סלולריים ל20 דקות. מהירות רולינג חושבת באמצעות מערכת מעקב חלקיקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות ניתוח מיקרוסקופי intravital מפורט, אינטראקציות heterotypic טסיות דם נויטרופילים על האנדותל הופעל היו דמיינו ידי עירוי של נוגדנים שכותרת-fluorescently נגד הטסיות (CD42c) או נויטרופילים סמן (Gr-1) לעכברים חיים.
במודל של דלקת venular-α-Induced TNF, נויטרופילים המתגלגלים ביותר דבקו ביציבות לאנדותל ככל הנראה על ידי אינטראקציה של β2 integrins הופעל עם Icam-1 בתקופת ההקלטה (3-4.5 שעות לאחר הזרקה של TNF-α, האיור 2A ). 8 רולינג ונויטרופילים חסיד כבר היו קיים לפני לכידת הווידאו החלה עקב הפעלת תאי אנדותל TNF-α-Induced. מספר הנויטרופילים מתגלגלים וחסיד על תאי האנדותל המודלקים היה 0.25 ± 0.05 תאים לדקה ו 18.5 ± 0.7 תאים לכל 5 דקות, בהתאמה (איורים ו2B 2C). רוב נויטרופילים דבקו tהוא הפעיל האנדותל למשך לכיד וידאו (1-1.5 שעות), ולא הייתה רק ירידה מזערית בתאי חסיד יחד עם עלייה מינימאלית בתאים מתגלגלים (מידע לא מוצג). גילינו כי רוב טסיות לדבוק נויטרופילים חסיד וזחילה ולא קיר הכלי המודלק (איור 2 א, וידאו 1). thrombi טסיות דם מצטבר ואמבוליזציה שוב ושוב לתקופה הלכידה וידאו. אות פלואורסצנציה המשולבת קשורה טסיות חסידות הייתה מוצגת באיור 2 ד.
ניצול המודל פקק ארטריולות ליזר המושרה, היינו יכול לבחון ולאפיין את אינטראקצית heterotypic של טסיות דם ונויטרופילים באתר של פציעת הקיר ארטריולות. במודל זה, הגיע לשיא גודל פקיק סביב 100 שניות לאחר פגיעת ליזר, ואחריו סדרה של אמבוליזציה הקטנה המהירה ל2-3 הדקות הבאות (מידע לא מוצג). 9,10 חמש דקות לאחר פציעת ליזר, בגודל של לא טסיותhrombus נשאר קבוע יחסית במהלך הדמיה (5-25 דקות לאחר פציעת ליזר, איורי 3A-3C) והתגלגלו על הנויטרופילים ודבקים בפקיק טסיות (איורי 3A-3B, וידאו 2). אות הקרינה מן טסיות במחזור הייתה זניחה בהשוואה לזה מפקיק טסיות הדם. מספר הנויטרופילים מתגלגלים וחסיד היה 21.5 ± 3.0 ו -1.6 ± 0.4 תאים מעל 20 דקות, בהתאמה (נתוני 3D-3E). גלגול מהיר ראשוני של הנויטרופילים התרחש בתאי האנדותל. ברגע שפנו לנויטרופילים פקיק טסיות, מהירות הגלגול של הנויטרופילים בפקיק הטסיות השתנתה עם טווח של 8.2 ± 1.1 מיקרומטר לשנייה (איור 3F), אשר מתווך על ידי אינטראקציה של P-selectin וPSGL-1. 11
איור 1.סכמטי של מערכת intravital מיקרוסקופ () והכנת cremaster שריר microvessel (B).
איור 2. אינטראקציות heterotypic של טסיות ונויטרופילים במהלך דלקת venular-α-Induced TNF בעכברים חיים. טסיות דם ונויטרופילים זוהו על ידי Dylight 488-מצומדות אנטי עכבר CD42c וAlexa פלואוריד-1-647 Gr נוגדנים מצומדות אנטי עכבר, בהתאמה. ( ) נציג binarized תמונות של ההופעה של אותות קרינה הקשורים נויטרופילים (אדום) וטסיות דם (ירוק) על 180 שניות. חץ מראה כיוון של זרימת דם. בר = 10 מיקרומטר. (לפנה"ס) מספר מתגלגל (תאים / דקה) וחסיד נויטרופילים (תאים / 5 דקות) על תאי האנדותל מודלקים מוצג. נתונים מייצגים ± SEM הממוצע של 30 דיvenules fferent ב 4 עכברי סוג פראי. (ד ') אות פלואורסצנציה משולבת חציון של טסיות דם (טסיות דם F) זממה כפונקציה של זמן. אין אות זוהתה עם Dylight שליטת חולדת IgG 488-מצומדת (מידע לא מוצג).
איור 3. אינטראקצית heterotypic של נויטרופילים עם פקיק הטסיות באתר של פציעת ארטריולות ליזר מושרה בעכברים חיים. טסיות דם ונויטרופילים התגלו כמתואר באיור 2. () נויטרופילים בודדים (אדום, חץ צהוב) מתהפכים בפקיק טסיות (ירוק) ואילו נויטרופילים שניים (אדום, חץ לבן) במהירות מתהפכים תאי האנדותל arteriolar, המוצגים על 5 שניות. (ב) נויטרופילים בודדים (אדום) מתגלגלים והקפדה על פקיק טסיות (ירוק) מוצג מעל 15 שניות . ראש החץ מראה מתגלגל וחסיד neutrophils. בר = 10 מיקרומטר. העבה, החץ האפור מעיד על הכיוון של זרימת דם. (ג) אות פלואורסצנציה משולבת חציון של טסיות דם (טסיות דם F) זממה כפונקציה של זמן. (DE) מספר הנויטרופילים מתגלגלים וחסיד בפקיק טסיות מוצג (cells/20 דקות). (F) המהירות מתגלגלת של נויטרופילים לאורך פקיק טסיות הדם. נתונים מייצגים ± SEM הממוצע של 14 thrombi ב 5 עכברי סוג פראי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט למיקרוסקופיה intravital פלואורסצנטי בזמן אמת כדי לחזות אינטראקציות heterotypic טסיות דם נויטרופילים על האנדותל הופעל במהלך דלקת ופקק בכלי דם. בעבר, גישות מיקרוסקופיות קרינה דומות דווחו כדי לחקור את המנגנון המולקולרי של היווצרות פקיק ודלקת בכלי דם. 8,12 מאז אינטראקצית heterotypic תאי תאים יכולה להיות חשובה להרחבת כלי דם, חסימה באתר פציעה, טכנולוגיה זו תהיה לכלי חשוב עבור לומד את המנגנונים התאיים ומולקולריים של מחלת כלי דם. היתרון של טכנולוגיית הדמיה בזמן אמת הוא לנטר אינטראקציות מיידיות ולאחר מכן של תאי intravascular על האנדותל הופעל / פגום תחת מצבים דלקתיים ופקקת. יתר על כן, המערכת המיקרוסקופית שלנו יכולה להיות מנוצלת בלימוד יחסי גומלין בין תאים במחזור heterotypic סרטניים ואנדותל או תאי דם באמצעות Fluorescently שכותרתו תאים סרטניים או נוגדנים נגד סמני תאים סרטניים כגון מולקולה אנושית אפיתל תאי הידבקות (EpCAM). 13,14 במקום להשתמש בנוגדני שכותרת-fluorescently, מיקרוסקופיה זו יכולה גם להתבצע עם עכברים מהונדסים המבטאים חלבוני ניאון בסוג תא מסוים כגון CD41-EYFP + megakaryocytes 15.
שימוש בעצמה של נוגדנים שכותרת-fluorescently, אנו יכולים לקבוע את הקינטיקה של היווצרות קרישים טסיות וביטוי מולקולרי בתאי intravascular הופעלו בעקבות פגיעת כלי. עם זאת, רוב הנוגדנים המשמשים בעניין זה מעכבים את תפקוד אנטיגן אשר עלול לגרום לתוצאות בלתי צפויות. לכן, הניסוי צריך להתבצע בזהירות מיוחדת כדי לייעל את הריכוז שבו הנוגדן נותן את אות פלואורסצנציה מספיק על ידי קשירתו לאנטיגן מבלי להשפיע על תפקוד אנטיגן. בנוסף, הספציפי הנוגדן הוא iss אחרue. זה ידוע כי אוכלוסיות של תאים דנדריטים ומונוציטים מבטאות רמות נמוכות של Gr-1 16.
יחד עם זאת, מצא כי מונוציטים הם רק 3-5% של לויקוציטים מתגלגל במהלך דלקת חריפה והיווצרות פקיק, כפי שנקבע על ידי נוגדן מסומן-fluorescently נגד עכבר F4/80 שבא לידי ביטוי באופן בלעדי במונוציטים ותאים דנדריטיים (מידע לא מוצג). leukocytes לכן, מתגלגל והחסיד ביותר במהלך דלקת venular TNF-α-Induced ופקק ארטריולות ליזר המושרה יהיה נויטרופילים.
בדו"ח זה, השתמש בשני מודלי עכבר של מחלת כלי דם. למרות שאנו מבינים שאין מודל חיה יכול לסכם תנאי מחלה אנושים, העבודה שבצעה בmicrovessels של עכברים חיים באמצעות טכנולוגיה זו תהיה נגיעה ישירה למחלות של בני אדם ויהיה בקלות לתרגום לטיפול טוב יותר במחל thrombo דלקתיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שום אינטרס כלכלי מתחרה.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות (P30 HL101302 וRO1 HL109439 לJC) ואיגוד לב אמריקאי (SDG 5270005 לJC). א Barazia נתמך על ידי NIH T32HL007829 אימוני מענק.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| MgCl2 6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | 144-55-8 | |
| 0.9% NaCl Saline | Hospira | 0409-4888-10 | |
| Ketamine | Hospira | 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Lloyd | ||
| Intramedic Tubing (PE 90) | BD Diagnostics | 427421 | |
| Intramedic Tubing (PE 10) | BD Diagnostics | 427401 | |
| Murine TNF-α | R&D Systems | 410-MT | |
| Dylight 488- labeled rat anti-mouse CD42b antibody | Emfret Analytics | X488 | |
| Alexa Fluor 647-conjugated anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) Antibody | BioLegend | 108418 | |
| NESLAB EX water bath/circulator | Thermo-Scientific | ||
| Olympus BX61W microscope | Olympus | ||
| TH4-100 Power | Olympus | ||
| Lambda DG-4 | Sutter | ||
| MPC-200 multi-manipulator | Sutter | ||
| R–-200 stage controller | Sutter | ||
| C9300 high-speed camera | Hamamatsu | ||
| Intensifier | Video Scope International | ||
| Ablation Laser | Photonic Instruments, Inc. | ||
| SlideBook 5.0 | Intelligent Imaging Innovations |
References
- Wagner, D. D., Frenette, P. S. The vessel wall and its interactions. Blood. 111, 5271-5281 (2008).
- Nieswandt, B., Kleinschnitz, C., Stoll, G. Ischaemic stroke: a thrombo-inflammatory disease. J. Physiol. 589, 4115-4123 (2011).
- Yang, J., Furie, B. C., Furie, B. The biology of P-selectin glycoprotein ligand-1: its role as a selectin counterreceptor in leukocyte-endothelial and leukocyte-platelet interaction. Thromb. Haemost. 81, 1-7 (1999).
- Zarbock, A., Polanowska-Grabowska, R. K., Ley, K. Platelet-neutrophil-interactions: linking hemostasis and inflammation. Blood Rev. 21, 99-111 (2007).
- Chen, J., Lopez, J. A. Interactions of platelets with subendothelium and endothelium. Microcirculation. 12, 235-246 (2005).
- Konstantopoulos, K., et al. Venous levels of shear support neutrophil-platelet adhesion and neutrophil aggregation in blood via P-selectin and beta2-integrin. Circulation. 98, 873-882 (1998).
- Maugeri, N., de Gaetano, G., Barbanti, M., Donati, M. B., Cerletti, C. Prevention of platelet-polymorphonuclear leukocyte interactions: new clues to the antithrombotic properties of parnaparin, a low molecular weight heparin. Haematologica. 90, 833-839 (2005).
- Hidalgo, A., et al. Heterotypic interactions enabled by polarized neutrophil microdomains mediate thromboinflammatory injury. Nat. Med. 15, 384-391 (2009).
- Cho, J., Furie, B. C., Coughlin, S. R., Furie, B. A critical role for extracellular protein disulfide isomerase during thrombus formation in mice. J. Clin. Invest. 118, 1123-1131 (2008).
- Cho, J., et al. Protein disulfide isomerase capture during thrombus formation in vivo depends on the presence of beta3 integrins. Blood. 120, 647-655 (2012).
- Gross, P. L., Furie, B. C., Merrill-Skoloff, G., Chou, J., Furie, B. Leukocyte-versus microparticle-mediated tissue factor transfer during arteriolar thrombus development. Journal of Leukocyte Biology. 78, 1318-1326 (2005).
- Falati, S., Gross, P., Merrill-Skoloff, G., Furie, B. C., Furie, B. Real-time in vivo imaging of platelets, tissue factor and fibrin during arterial thrombus formation in the mouse. Nat. Med. 8, 1175-1181 (2002).
- Barthel, S. R., et al. Alpha 1,3 fucosyltransferases are master regulators of prostate cancer cell trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19491-19496 (2009).
- Trzpis, M., McLaughlin, P. M., de Leij, L. M., Harmsen, M. C. Epithelial cell adhesion molecule: more than a carcinoma marker and adhesion molecule. The American Journal of Pathology. 171, 386-395 (2007).
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317, 1767-1770 (2007).
- Egan, C. E., Sukhumavasi, W., Bierly, A. L., Denkers, E. Y. Understanding the multiple functions of Gr-1(+) cell subpopulations during microbial infection. Immunologic Research. 40, 35-48 (2008).
