Summary
Burada vasküler inflamasyon ve canlı farelerde trombüs oluşumu sırasında aktive endotel üzerindeki heterotipik trombosit-nötrofil etkileşimleri görselleştirmek için floresan intravital mikroskobu deneysel bir tekniktir rapor. Bu mikroskobik teknoloji vasküler hastalığın moleküler mekanizmasını incelemek ve patofizyolojik durumlardaki farmakolojik ajanları test için değerli olacaktır.
Abstract
Arterioler yaralanma yerinde trombüs oluşumu sırasında aktive endotel aracılık tromboz ve vasküler inflamasyon üzerine aktive trombositler ve lökositler (özellikle nötrofiller) etkileşimi. 1,2, aktive endotel ve subendotelyal matriks proteinlerine yapışkan trombositlere nötrofil yuvarlanma ve yapışma destekliyoruz. 3 Tersine, venüler inflamatuar koşullarda, aktif endotele yapıştığında nötrofil trombositlerin dolaşımdaki adezyon ve birikimi destekleyebilir. Heterotipik trombosit-agregasyonu nötrofil hücreleri arasındaki spesifik reseptör-reseptör etkileşimleri yoluyla sayaç ardışık işlemler gerektirir. 4 O aktive edilmiş endotel hücreleri, böylece yüksek kesme koşulları altında trombosit yapışması ve birikim başlatılması, bu tür von Willebrand faktörü gibi yapışma molekülleri serbest olduğu bilinmektedir. 5 Ayrıca, aktive endotel hücreleri ifade selektinler nötrofil yuvarlanma ve adezyon bir destekd Hücrelerarası adezyon molekülü-1 (ICAM-1), sırasıyla, düşük kesme koşulları altında. 4 Trombosit P-selektin yoluyla nötrofiller ile etkileşime girer p-selektin glikoprotein ligandı-1 (PSGL-1), nötrofil ve böylece β2 integrinler ve sağlam aktivasyonunu uyararak İki hücre türleri arasındaki yapışma. Heterotipik trombosit-nötrofil etkileşimleri tam kan ya da izole edilmiş hücreler 6,7 olarak belirlendiği in vitro deneylerde gelişmelere rağmen, bu çalışmalar vasküler hastalık sırasında oksidatif stres koşulları manipüle edemez. Bu raporda, trombosit ve nötrofil işaretleyici bir fare karşı floresan-etiketli, spesifik antikorlar kullanılarak, TNF-α ile indüklenen inflamasyonu veya lazer kaynaklı takip sırasında aktive endotel üzerinde trombosit ve nötrofil heterotipik etkileşimlerini izlemek için ayrıntılı bir intravital mikroskopik protokol açıklar canlı farelerin cremaster kas mikrodamar yaralanma.
Protocol
1. Intravital Mikroskop hazırlanması (Şekil 1A)
- (125 mM NaCI, 4.5 mM KCI, 2.5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 17 mM NaHCO 3, pH 7.4) tampon superfusion hazırlayın.
- 37 tampon sıcaklık ve bir termo-kontrollü battaniye korumak için bir dolaşım su banyosu açın ° C. Azot gazı (% 5 CO 2, nitrojen ile dengeli) ile tampon havalandırınız.
- Mikroskop sistemi açın (Sutter Lambda DG-4 yüksek hızlı dalga değiştirici, iş istasyonu bilgisayar, Olympus BX61W mikroskop, MPC-200 çoklu manipülatör, ROE-200 sahne denetleyici, yüksek hızlı kamera ve yoğunlaştırıcı).
- Vasküler inflamasyon modeli için,% 100 dikroik ayna kullanın. Lazer yaralanma ile trombüs oluşumunu teşvik etmek için, 50/50% ayna ile% 100 ayna yerini ve Micropoint lazer ablasyon sistemi açın.
2. Intravital Mikroskopi Cremaster'ın kas hazırlanması (Şekil 1B)
- Bir uyuşturketamin (125 mg / kg vücut ağırlığı (BW)) ve atlara ip enjeksiyonu (12.5 mg / kg BW) göre erkek fare (6-8 hafta, eski C57BL / 6). Illinois Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu University tüm hayvan bakımı ve deney prosedürleri onayladı. Bir vasküler inflamasyon modeli için (cerrahi öncesi 2-2.5 saat) önceden görüntüleme intrascrotally bir fare 3 saat içine fare TNF-α (250 ul serum fizyolojik içinde 0.5 mg) enjekte.
- Bir intravital mikroskop tepside 37 ° C'de bir termo-kontrollü battaniye üzerinde fare yerleştirin.
- Forsepsi kullanarak boyun yüzeyinde deri çekin ve yukarı makas ile 1 cm yatay boyun deri orta hat kesilirken.
- Yavaşça künt makas kullanarak servikal kas açın ve trakea çevreleyen kas kaldırın.
- Solunum güçlüğü ortadan kaldırmak için trakea içine bir PE90 tüp kanüle.
- Nazikçe servikal kas sol tarafında kaldırmak ve çevre dokulardan juguler ven izole.
- C annuantikorlar ve ek anestezik infüzyonu için juguler ven içine geç PE10 tüp.
- Yavaşça çekin ve yatay olarak skrotal deride kesilirken. Deney boyunca doku bütünlüğünü korumak için, önceden ısıtılmış tampon cerrahi alan üzerinde superfused edildi.
- Tek forcep ile alt karın üzerine basın ve dikkatle diğer forcep ile testis çekin.
- Testis etrafında çevreleyen bağ dokuları çıkartın.
- Dikey cremaster kas kesilirken ve çevre iğneleyerek bir intravital mikroskop tepsi üzerinde bir cam lamel üzerinde kas düzleştirin.
- Veri toplamadan önce stabilize kası için 10-20 dk bekleyin. 30-45 um arasında bir çapa sahip Cremaster'ın kas arteriyoller (trombüs oluşumunu) ve venüllerin (damar iltihabı) çalışma için seçilmiştir.
- Anestezi koşulları sağlamak için, aynı anestezi juguler cannulus yaklaşık olarak her 30 dk 30-50 ml demlenmeye.
- Intravital mikroskop, açık SlideBook 5.0 yazılımı üzerinde fare yerleştirilmesinden sonra ve uygun optik ve objektif (60X) ayarlamak için menü çubuğunda "Odak Pencere" üzerine tıklayın.
- Dylight infüze 488-konjüge sıçan anti-fare CD42c (100 ul tuzlu su içinde 0.1 mg / g BW) ve Alexa Fluor 647-konjüge sıçan anti-fare Gr-1 antikor (100 ul tuzlu su içinde 0.05 mg / g BW) bir boyun cannulus sayesinde .
- Menü çubuğuna gidin ve araç çubuğundaki "Görüntü Yakala" üzerine tıklayın.
- Yeni bir menü açılır; "Resim" olarak, yüksekliği "460" 1x1 gibi "Bin Faktörü" seçeneğini seçin ve "640" width ve.
- "Filtre Seti" olarak, her biri için poz süresini teşhir ve ayarlamak istediğiniz kanallar için onay kutusunu işaretleyin. Örneğin, açık kanal: 10 msn, FITC kanal: 50 msn ve Cy5 kanal: 50 msn.
- Zaman noktalarında ve aralık sayısını ayarlamak için "Time-Lapse Yakalama" seçeneğini seçin. For inflamasyon modelinde, zaman noktalarının sayısını 200 msn lik bir aralıkla (: 5 dk Toplam geçen zaman) ile 1000-1500 ayarlanır.
- O kanal için belirlenen pozlama seferde tek bir düzlem görüntüyü görmek için "Test" i tıklayın. Histogram yeterli yoğunluk dağılımı (çok kanallı yakalama için, her bir kanal için bu işlemi yineleyin) gösterene kadar maruz kalma süresi ve / veya mikroskop ışık ayarlayın.
- Bir kez tüm parametreleri "Görüntü Yakala" in (kanalları, pozlama süreleri, vb) ayarlanır, yakalama başlamak için "Başlat" seçeneğini seçin.
- Vasküler enflamasyon modelinde bir iltihaplı cremaster venül üst yarısı içinde 5 dakika boyunca haddeleme ve yapışkan trombositler ve nötrofil izler. Sekiz ila on farklı venüllerde bir fare kaydedilir.
- Görüntüleri 157 mikron x 118 mikron bir pencere boyutu veren 60X toplam büyütme (1.0 NA su immersiyon objektif) kullanılarak alınmıştır.
- Deney tamamlandıktan sonra, fareler servikal dislocatio ile ötenazin.
4. Venüler İnflamasyon Modeli için Veri Analizi
- SlideBook 5.0 yazılımı açın ve bir dosyayı açmak için menü çubuğunda "Klasör" tıklatın.
- Açılan kanal menüsünü tıklayın ve "Aç, FITC, Cy5, vb" seçeneğini
- "(Kırmızı ve yeşil çubuklar) Renormalize" ve kanalı seçin tıklayın. Kabaca floresans sinyali optimize sola veya sağa kırmızı ve yeşil çubuklar sürükleyin.
- "Uygula" ve "Tamam" görüntüyü güncellemek için tıklayın.
- Varsayılan olarak geçerli ekran seçmek için "Küçük Düğme" tıklayın.
- Yakalanan timelapse görüntü oynayın ve 5 dk süresince haddeleme ve yapışık nötrofil say.
- Trombosit trombüs oluşumunu analiz etmek, "Maske" gidin ve "Oluştur" u seçin.
- Bir maskeyi ve "mevcut görüntü olarak" işareti adlandırın.
- Ana görünümünde "Marquee Tool" in "Büyük kalem simgesi" tıklayın.
- Bir arka plan maske ayarlamak için ana görünümünde geminin dışındaki bir bölge renklendirin.
- T gito "Maske", "Bu Düzlem Kopyala", "mevcut timepoint Kopyala maske" tıklayın ve "tüm zaman noktalarında" seçeneğini tıklayın ve "Tamam" a tıklayın.
- Arka plan sinyalini hesaplamak için, "İstatistik" gidin ve "Maske İstatistikleri" butonuna tıklayınız.
- Görüntü Kapsam "Cari 2D Time Lapse veya 4D Resim (ler)" tıklayın ve Maske Kapsamında "Tüm Maske" seçeneğini seçin. Yakalama tarihi altında, "Alan (piksel)" Morfometri altında Yoğunluğu altında "Maksimum Yoğunluk" seçeneğini seçin ve "Export" (Bu istatistik yöntemini tıklatın bize sağlar Özellikler olarak, "Geçen Zaman (: mm ms hh)" seçin oto-floresans yoğunluğu (arka plan sinyali)) hesaplamak.
- MS Office Excel metin dosyasını açın ve kayıt dönemi boyunca arka sinyalin ortalama değerini hesaplamak. Bu, arka plan floresans şiddetidir.
- Trombüs yoğunluğunu belirlemek için, ana görünümde "Marquee Tool" tekrar "Büyük kalem simgesi" tıklayın.
- Trombosit sinyalini ayarlamak için ana görünümünde kabın içine Renk.
- "Maske" Git, "Bu Düzlem kopyala", "Tüm zaman noktalarında" select "Geçerli timepoint Kopyala maskesi" seçeneğine tıklayın ve "Tamam" tıklatın.
- "İstatistik" gidin ve "Maske İstatistikleri" butonuna tıklayınız.
- Görüntü Kapsam "Cari 2D Time Lapse veya 4D Resim (ler)" tıklayın ve Maske Kapsamında "Tüm Maske" seçeneğini seçin. Özellikler olarak, seçme "Geçen Süre (ss: dd: ms)" Capture Tarih altında, bize izin "Alan (piksel)" Morfometri altında Yoğunluğu altında "Sum Yoğunluğu" seçin ve "Export" (Bu istatistik yöntemini tıklatın seçin ) kabın içine floresans yoğunluğunu hesaplamak.
- MS Office Excel metin dosyası açın. Trombositlerin Floresans sinyalinin geminin içindeki toplamı yoğunluğu arka plan yoğunluğu x Bölgesi ortalama değeri (piksel) çıkarılarak hesaplanır. Bu, trombosit trombüs floresans şiddetidir.
- 3-5 farklı farelerde 30 farklı venlerde bu işlemi tekrarlayın. Sonra, trombositlerin floresans şiddetinin ortanca değerini hesaplamak.
- Karşınötrofil yuvarlanma ve adezyon analiz, nötrofil haddeleme akını her venül 5 dk içinde belirlenir ve dakikada hücre sayıları olarak sunuldu. > 30 saniye için durağan ve yavaşça sürünerek (<10 mikron üzerinde 30 sn) ama üzerinde atmadım yapışık nötrofil sayısı, sayılan ve 5 dk hücre başına sayı olarak sunuldu.
5. Lazer kaynaklı Arteriolar Tromboz için intravital Mikroskopisi
Ablasyon lazer 5-1 Kalibrasyon
- Mikroskop sahne üzerine yansıtılmış bir slayt yerleştirin, slaytın üst distile su küçük bir damla uygulamak ve yoğunluğunu ayarlayın ve mercek kullanarak odaklanın.
- "Odak Pencere" açın ve SlideBook 5.0 yazılımı "FRAP" sekmesini seçin.
- 40-50 lazer güç ayarlama, hem de "çift tıklayın tekrar" ve "çift tıklayınız boyutu" 8 ayarlanır. Crosshair'i bir dizi getirmek için "Yerler" kutusunu işaretleyin.
- Görev o gelen "Ok" simgesini seçinn Ekranın üst.
- "FRAP Hizalama" sekmesi altında, "bir sonraki Fire" ı tıklatın. Küçük bir nokta monitörde sol alt köşesine yakın görünmelidir. Nokta göründüğünde, çift bunun ortasına tıklayın. Bir kez tıklandığında, başka bir nokta üstünde belirir ve ilk nokta sağında olmalıdır; bunun üzerine çift tıklayın. 16 puan (16 inci nokta sağ alt köşesinde görünecektir.) Kalibrasyon parametrelerini güncellemek tamamlandığında "Kaydet" düğmesini tıklatın için bu işlemi tekrarlayın.
- Kalibrasyon doğruluğunu sınamak için, ekranın ortasında görünmelidir "Merkezi" düğmesi-küçük bir nokta tıklayın. Değilse istenen doğruluk elde edilene kadar, kalibrasyon tekrarlayın.
5-2 Lazer kaynaklı arterioler trombüs oluşumu
- Mikroskop sahnede bir anestezi fare (2-2 2-12 yordama bakın) yerleştirin.
- "Yakalama" penceresi altında bir protokol seçin veya yeni bir tane oluşturun. Ayarları aşağıdaki gibidir: CY5 (70 msn maruz kalma), Açık (10 msec maruz kalma), ve FITC (50 msn maruz kalma). Görüntü 20 dk (500 msn bir zaman aralığı ile yaklaşık 2.400 kez puan) üzerinde yakalanır.
- Dylight yukarıda tarif edildiği gibi 488-konjüge fare anti-CD42c ile Alexa Fluor 647-konjüge fare anti-Gr-1 antikor süzülür.
- Olarak 3-7 3-3 açıklanan floresan yoğunluğu ve parlak saha görüntü dahil mikroskobu parametrelerini optimize.
- Uygun aydınlık şiddeti veya antikor sinyal, arteriyol yerleştirme ve odak sağlamak için "Test" düğmesine tıklayın.
- Görüntü yakalama işlemini başlatmak için "Başlat" a tıklayın.
- Ablasyon lazer ateş önce, fare işaretçisi simgesi seçilir ve damar duvarında net bir odak olduğunu olduğundan emin olun.
- Lazer atışı için çift damar duvarının 2-3 mikron dahili bir noktayı tıklayın. Arteriyollerde endotel hücrelerinin Yaralanma aydınlık alan görüntü fark olması gereken bir görsel bir şekil değiştirme olur, trombosit birikim izledi. Monitör trombüslazer yaralanmadan sonra 5 dakika boyunca oluşumu.
- Lazer yaralanmadan sonra beş dakika bekleme (trombüs boyutu artık kararlı olmalıdır) ve yakalama iptal. Daha sonra, 20 dakika boyunca yapışkan trombositlere ve haddeleme / yapışık nötrofiller kaydetmek için 500 milisaniye aralığı ile 2400 kez puan ile bir yakalama başlar. Üç ila beş arteriyollerde bir fare kaydedilir.
- Deneyin tamamlanmasından sonra, fareler servikal dislokasyon yolu ile ötenazi yapıldı.
6. Arteriolar Tromboz Model Veri Analizi
- 4,5 adımları 4.1 üzerine gidin.
- Trombosit trombüs oluşumu sırasında arka plan floresan yoğunluğu elde etmek için, 4.14 adımlarda 4.7 üzerine gitmek.
- "Maske" Git, "Segment", kanal seçme FITC tıklatın ve Düşük arka plan sinyalin ortalama değerini ekleyin. Click "Uygula" ve "Tamam".
- Trombosit trombüs floresan yoğunluğu (Dylight 488-konjuge anti-CD42c antikor) analiz etmek,
- Haddeleme ve yapışık nötrofiller ölçmek için, timelapse oynamak ve gözle 20 dakika boyunca trombosit trombüs üzerinde rulo hücrelerinin sayısını saymak. En azından 2 saniye süre ile trombosit trombüs ile etkileşim sırasında Rolling nötrofil hızında bir azalma olarak tanımlanır. Bağlanan nötrofiller, en az 2 dakika süreyle trombosit trombus bağlı kalan herhangi bir nötrofiller olarak tanımlanır. Haddeleme ve yapışık nötrofil sayısı 20 Dakikada hücre sayıları olarak sunuldu. Rolling hızı bir partikül izleme sistemi kullanılarak hesaplanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ayrıntılı bir intravital mikroskopi analizi kullanarak, aktive endotel üzerindeki heterotipik trombosit-nötrofil etkileşimleri trombosit (CD42c) veya nötrofil işaretleyici (Gr-1) canlı farelere karşı floresan etiketli antikorlar infüzyonu ile görüntülenmiştir.
TNF-α-kaynaklı venüler enflamasyon modelinde, en çok haddeleme nötrofiller stabil kayıt süresi (3-4,5 saat TNF-α enjeksiyonundan sonra, Şekil 2A'da sırasında ICAM-1 ile aktive β2 İntegrinlerin etkileşim ile muhtemelen endotel yapıştırılır edildi video yakalama TNF-α ile indüklenen endotel hücre aktivasyonuna bağlı başlamadan önce). 8 Rulmanlar yapışık nötrofiller zaten mevcut idi. Iltihaplı endotel hücreleri üzerinde haddeleme ve yapışık nötrofil sayısı 0.25 idi dakika ve 18.5 ortalama ± 0.05 hücreleri ± sırasıyla 5 dakika, (Şekil 2B ve 2C) başına 0.7 hücreler. Çoğu nötrofiller t yapıştırılır edildio görüntü yakalama (1-15 saat) arasında süre için endotel aktive edilir ve haddeleme hücreler (veriler gösterilmemiştir) minimal bir artışla birlikte yapışık hücreler içerisinde sadece minimal azalma oldu. Biz en trombositler yapışık ve sürünerek nötrofiller ziyade iltihaplı damar duvarı (Şekil 2A, Video 1) uygun bulundu. Trombosit trombüs birikmiş ve video yakalama süresi boyunca art arda embolize. Yapışkan trombositlere ile ilişkili entegre floresans sinyali Şekil 2B'de gösterilmiştir.
Lazer kaynaklı arterioler tromboz modelinin kullanılması, biz incelemek ve arterioler duvarı yaralanma yerinde trombosit ve nötrofil heterotipik etkileşimi karakterize başardık. Bu modelde, trombüsün boyutu önümüzdeki 2-3 dk (veriler gösterilmemiştir) için hızlı küçük embolizasyon bir dizi izledi, lazer yaralanma sonrası 100 sn civarında zirve yaptı. Lazer yaralanma sonrası 9,10 Beş dakika, trombosit t boyutuhrombus görüntüleme (lazer yaralanma sonrası 5-25 dk, Şekil 3A-3C) ve haddelenmiş nötrofiller boyunca nispeten sabit kalmıştır ve trombosit trombüs (Şekil 3A-3B, Video 2) yapıştırılır. Dolaşan trombositler floresan sinyali trombosit gelen trombus ile karşılaştırıldığında ihmal edilebilir düzeydedir. Haddeleme ve yapışık nötrofil sayısı 21.5 ± sırasıyla 20 dk (Şekil 3D-3E) üzerinde 3.0 ve 1.6 ± 0.4 hücreler. Nötrofillerin İlk hızlı haddeleme endotel hücreleri üzerinde oluştu. Bir kez nötrofillerin trombosit trombüs temas, bir trombosit trombüs nötrofil yuvarlanma hızının 8.2 aralığında ± P-selektin ve PSGL-1 etkileşimi aracılığı ile, saniyede 1,1 mikron (Şekil 3F) ile değiştirildi. 11.
Şekil 1.Intravital mikroskop sistemi (A) ve cremaster kas mikrodamar (B) hazırlanması şematik.
Şekil 2. Canlı farelerde TNF-α-kaynaklı venüler iltihap sırasında, trombosit ve nötrofil heterotipik etkileşimleri. Trombositler ve nötrofiller, sırasıyla Dylight 488-konjüge fare anti-CD42c ile Alexa Fluor 647-konjüge fare anti-Gr-1 antikor ile saptandı. ( A) Örnek nötrofiller (kırmızı) ve 180 saniye boyunca trombositlerin (yeşil) ile ilişkili flöresan sinyalleri ortaya görüntülerini binarized. Ok kan akımının yönünü gösterir. Bar = 10 mikron. (BC) haddeleme sayısı (hücre / dakika) ve iltihaplı endotel hücreleri üzerinde yapışık nötrofiller (hücre / 5 dk) gösterilir. Veriler 30 di ortalama ± SEM temsil4 yabani-tip farelerde fferent venüllerin. trombositlerin (F trombosit) (D) medyan entegre bir floresan sinyali zamanın bir fonksiyonu olarak çizilmiştir. Sinyal yok Dylight 488-konjuge kontrol sıçan IgG (veriler gösterilmemiştir) ile tespit edildi.
Şekil 3,. Şekil 2 'de tarif edildiği gibi canlı farelerde lazer kaynaklı Arteriyollerde yaralanma yerinde bir trombosit trombüs ile nötrofillerin heterotipik etkileşim. Trombositler ve nötrofil tespit edildi. (A) tek bir nötrofil (kırmızı, sarı bir ok) trombosit trombüs üzerinde rulo ikinci bir nötrofil (kırmızı, beyaz ok) hızla 5 sn üzerinde gösterilecek arteriolar endotel hücreleri, üzerinde rulo ise. (yeşil) (B) tek bir nötrofil (kırmızı) üzerinde haddeleme ve 15 sn üzerinde gösterildiği bir trombosit trombüs (yeşil) bağlı kalarak . Okbaşı haddeleme ve yapışık ne gösterirutrophils. Bar = 10 mikron. Kalın, gri ok kan akışının yönünü gösterir. (C) trombositlerin (F trombosit) medyan entegre bir floresan sinyali zamanın bir fonksiyonu olarak çizilmiştir. (DE) trombosit trombüs haddeleme ve yapışkan nötrofil sayısının (cells/20 dakika) gösterilmiştir. (F) dönme hızı trombosit trombüs üzerinde nötrofil. Veri 5 vahşi tip farelerdeki 14 trombüs ortalama ± SEM temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada vasküler inflamasyon ve tromboz sırasında aktive endotel üzerindeki heterotipik trombosit-nötrofil etkileşimleri görselleştirmek için gerçek zamanlı floresan intravital mikroskopi için ayrıntılı bir protokol açıklar. Daha önce, benzer floresans mikroskopik yaklaşımlar trombüs oluşumu ve vasküler inflamasyonun moleküler mekanizması çalışmaya bildirildi. 8,12 heterotipik hücre-hücre etkileşimi yaralanma yerinde vazo-oklüzyon için önemli olabilir bu yana, bu teknoloji için değerli bir araç olacaktır vasküler hastalık hücresel ve moleküler mekanizmaları okuyor. Gerçek-zamanlı görüntüleme teknolojisi avantaj enflamatuar ve trombotik koşullar altında aktive / zarar görmüş damar endotel hücreleri üzerinde hemen sonraki ve etkileşimleri izlemektir. Ayrıca, bizim mikroskopik sistemi fluo kullanarak dolaşan tümör hücreleri ve endotel veya kan hücreleri arasındaki heterotipik etkileşimleri okuyan yararlanılabilirBu tür insan epitel hücre yapışma molekülü (EpCAM) ve tümör hücre belirtileri karşı tümör hücreleri ya da antikorlar rescently-etiketli. floresan-etiketli antikorlar kullanılarak arasında 13,14 Bunun yerine, bu da bir mikroskop belirli hücre tipi içinde floresan proteinlerini ifade eden transjenik fareler ile yapılabilmektedir CD41-EYFP + megakaryosit gibi. 15
Floresan-etiketli antikor yoğunluğu kullanılarak, trombosit trombus oluşumu ve damar yaralanması sonrasında aktif damar hücrelerinde moleküler ifade kinetikleri belirleyebilir. Ancak, bu amaçla kullanılan antikorların en beklenmedik sonuçlara yol açabilir antijen fonksiyonunu inhibe ederler. Bu yüzden, deney antikor antijen işlev etkilemeden antijen bağlanmasında tarafından yeterli bir floresan sinyali verir ki konsantrasyon optimize etmek için özel bir itina gösterilmesi gerekmektedir. Buna ek olarak, antikor başka ISSvi. Bu, dendritik hücreler ve monositlerin subpopülasyonunun Gr-1 olarak düşük seviyelerde ifade ettiği bilinmektedir. 16
Bununla birlikte, monositler akut enflamasyon ve trombus oluşumu sırasında haddeleme lökositlerin sadece% 3-5 olduğu bulundu olarak monositler ve dendritik hücreler (veriler gösterilmemiştir), münhasıran ifade edilir fare F4/80 karşı bir floresan-etiketli antikor tarafından belirlenir. TNF-α-kaynaklı venüler iltihap ve lazer kaynaklı Arteriyollerde tromboz sırasında Bu nedenle, en çok haddeleme ve yapışkan lökositleri nötrofil olacaktır.
Bu yazıda, vasküler hastalığın iki fare modellerini kullandılar. Hiçbir hayvan modelinde insan hastalık koşulları tekrarlamak olduğunu anlamak de, iş bu teknolojiyi kullanarak canlı farelerde mikrodamar yapılan insan hastalık doğrudan bir öneme sahip olacaktır ve trombo-inflamatuar hastalıkların tedavisi için daha kolaylıkla çevrilebilir olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip finansal çıkara beyan.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri ile hibe (JC P30 HL101302 ve RO1 HL109439) ve Amerikan Kalp Derneği (JC SDG 5270005) tarafından kısmen desteklenmiştir. A. Barazia bir T32HL007829 NIH eğitim hibesi ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| MgCl2 6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | 144-55-8 | |
| 0.9% NaCl Saline | Hospira | 0409-4888-10 | |
| Ketamine | Hospira | 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Lloyd | ||
| Intramedic Tubing (PE 90) | BD Diagnostics | 427421 | |
| Intramedic Tubing (PE 10) | BD Diagnostics | 427401 | |
| Murine TNF-α | R&D Systems | 410-MT | |
| Dylight 488- labeled rat anti-mouse CD42b antibody | Emfret Analytics | X488 | |
| Alexa Fluor 647-conjugated anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) Antibody | BioLegend | 108418 | |
| NESLAB EX water bath/circulator | Thermo-Scientific | ||
| Olympus BX61W microscope | Olympus | ||
| TH4-100 Power | Olympus | ||
| Lambda DG-4 | Sutter | ||
| MPC-200 multi-manipulator | Sutter | ||
| R–-200 stage controller | Sutter | ||
| C9300 high-speed camera | Hamamatsu | ||
| Intensifier | Video Scope International | ||
| Ablation Laser | Photonic Instruments, Inc. | ||
| SlideBook 5.0 | Intelligent Imaging Innovations |
References
- Wagner, D. D., Frenette, P. S. The vessel wall and its interactions. Blood. 111, 5271-5281 (2008).
- Nieswandt, B., Kleinschnitz, C., Stoll, G. Ischaemic stroke: a thrombo-inflammatory disease. J. Physiol. 589, 4115-4123 (2011).
- Yang, J., Furie, B. C., Furie, B. The biology of P-selectin glycoprotein ligand-1: its role as a selectin counterreceptor in leukocyte-endothelial and leukocyte-platelet interaction. Thromb. Haemost. 81, 1-7 (1999).
- Zarbock, A., Polanowska-Grabowska, R. K., Ley, K. Platelet-neutrophil-interactions: linking hemostasis and inflammation. Blood Rev. 21, 99-111 (2007).
- Chen, J., Lopez, J. A. Interactions of platelets with subendothelium and endothelium. Microcirculation. 12, 235-246 (2005).
- Konstantopoulos, K., et al. Venous levels of shear support neutrophil-platelet adhesion and neutrophil aggregation in blood via P-selectin and beta2-integrin. Circulation. 98, 873-882 (1998).
- Maugeri, N., de Gaetano, G., Barbanti, M., Donati, M. B., Cerletti, C. Prevention of platelet-polymorphonuclear leukocyte interactions: new clues to the antithrombotic properties of parnaparin, a low molecular weight heparin. Haematologica. 90, 833-839 (2005).
- Hidalgo, A., et al. Heterotypic interactions enabled by polarized neutrophil microdomains mediate thromboinflammatory injury. Nat. Med. 15, 384-391 (2009).
- Cho, J., Furie, B. C., Coughlin, S. R., Furie, B. A critical role for extracellular protein disulfide isomerase during thrombus formation in mice. J. Clin. Invest. 118, 1123-1131 (2008).
- Cho, J., et al. Protein disulfide isomerase capture during thrombus formation in vivo depends on the presence of beta3 integrins. Blood. 120, 647-655 (2012).
- Gross, P. L., Furie, B. C., Merrill-Skoloff, G., Chou, J., Furie, B. Leukocyte-versus microparticle-mediated tissue factor transfer during arteriolar thrombus development. Journal of Leukocyte Biology. 78, 1318-1326 (2005).
- Falati, S., Gross, P., Merrill-Skoloff, G., Furie, B. C., Furie, B. Real-time in vivo imaging of platelets, tissue factor and fibrin during arterial thrombus formation in the mouse. Nat. Med. 8, 1175-1181 (2002).
- Barthel, S. R., et al. Alpha 1,3 fucosyltransferases are master regulators of prostate cancer cell trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19491-19496 (2009).
- Trzpis, M., McLaughlin, P. M., de Leij, L. M., Harmsen, M. C. Epithelial cell adhesion molecule: more than a carcinoma marker and adhesion molecule. The American Journal of Pathology. 171, 386-395 (2007).
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317, 1767-1770 (2007).
- Egan, C. E., Sukhumavasi, W., Bierly, A. L., Denkers, E. Y. Understanding the multiple functions of Gr-1(+) cell subpopulations during microbial infection. Immunologic Research. 40, 35-48 (2008).
