Summary
Aquí se presenta una técnica experimental de microscopía intravital de fluorescencia para visualizar heterotípicas plaquetas neutrófilos interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos. Esta tecnología microscópica será valiosa para estudiar el mecanismo molecular de la enfermedad vascular y para poner a prueba los agentes farmacológicos bajo condiciones fisiopatológicas.
Abstract
La interacción de las plaquetas activadas y leucocitos (principalmente neutrófilos) en el endotelio activado trombosis media y la inflamación vascular. 1,2 Durante la formación de un trombo en el sitio de la lesión arteriolar, las plaquetas adherentes al endotelio activado y proteínas subendoteliales matriz de soporte de rodadura de neutrófilos y la adherencia. 3 A la inversa, bajo venulares condiciones inflamatorias, neutrófilos adherentes al endotelio activado puede soportar la adhesión y acumulación de plaquetas circulantes. Heterotípicos plaquetas agregación de neutrófilos requiere procesos secuenciales por las interacciones con los receptores específicos de receptor-contador entre las células. 4 Se sabe que las células endoteliales activadas liberan moléculas de adhesión tales como el factor de von Willebrand, iniciando así la adhesión de las plaquetas y la acumulación bajo condiciones de alto cizallamiento. 5 Además, células endoteliales activadas soporte rodante de neutrófilos y la adhesión por selectinas que expresan unmolécula-1 d adhesión intercelular (ICAM-1), respectivamente, en condiciones de bajo cizallamiento. 4 de plaquetas P-selectina interactúa con los neutrófilos a través de P-selectina glicoproteína ligando-1 (PSGL-1), induciendo de ese modo la activación de neutrófilos β2 integrinas y firmes adhesión entre dos tipos de células. A pesar de los avances en los experimentos in vitro en el que heterotípicas plaquetas neutrófilos interacciones se determinan en sangre entera o de células aisladas, 6,7 esos estudios no se pueden manipular las condiciones de estrés oxidativo durante la enfermedad vascular. En este informe, utilizando marcadas con fluorescencia, anticuerpos específicos contra un ratón de plaquetas y neutrófilos marcador, se describe un protocolo detallado intravital microscópico para monitorear las interacciones heterotípicas de plaquetas y neutrófilos sobre el endotelio activado durante TNF-α inducida por inflamación o por láser inducida lesión del músculo cremáster en microvasos de ratones vivos.
Protocol
1. Preparación de microscopio intravital (Figura 1A)
- Preparar tampón superfusión (125 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, y 17 mM NaHCO 3, pH 7,4).
- Girar en un baño de agua circulatorio para mantener la temperatura de tampón y una manta termo controlada a 37 ° C. Airear tampón con gas nitrógeno (5% de CO 2 en equilibrio con nitrógeno).
- Encienda el sistema de microscopio (Sutter Lambda DG-4 de alta velocidad longitud de onda cambiador, estación de trabajo, Olympus microscopio BX61W, MPC-200 multi-manipulador, el ROE-200 controlador de fase, cámara de alta velocidad y multiplicador).
- Para el modelo de inflamación vascular, utilizar un espejo dicroico 100%. Para inducir la formación de trombos por lesión con láser, sustituir un espejo 100% con un espejo de 50/50% y activar un sistema de ablación láser micropoint.
2. Preparación del músculo cremáster para microscopía intravital (Figura 1B)
- Anestesiar a unratón macho (6-8 semanas de edad, C57BL / 6) por inyección ip de ketamina (125 mg / kg de peso corporal (BW)) y xilazina (12,5 mg / kg de peso corporal). La Universidad de Illinois Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión aprobó todo cuidado de los animales y los procedimientos experimentales. Para un modelo de inflamación vascular, inyectar murino TNF-α (0,5 g en 250 l de solución salina) en un ratón intrascrotally 3 h antes de la formación de imágenes (2-2.5 horas antes de la cirugía).
- Coloque el ratón sobre una manta térmica controlada a 37 º C en una bandeja de microscopio intravital.
- Tire hacia arriba de la piel en la superficie del cuello utilizando fórceps y una incisión en la línea media horizontal de la piel del cuello hasta 1 cm con unas tijeras.
- Abra suavemente el músculo cervical utilizando tijeras de punta roma y eliminar el músculo que rodea la tráquea.
- Canular un tubo en la tráquea PE90 para eliminar la dificultad para respirar.
- Retire suavemente el lado izquierdo del músculo cervical y aislar la vena yugular de los tejidos circundantes.
- C annutarde un tubo PE10 en la vena yugular izquierda para la infusión de anticuerpos y anestésicos adicionales.
- Tire suavemente hacia fuera y una incisión en la piel del escroto horizontalmente. Para mantener la integridad de los tejidos durante todo el experimento, tampón precalentado se superfused sobre el campo quirúrgico.
- Pulse en la parte inferior del abdomen con una pinza y tire con cuidado un testículo con el fórceps otro.
- Quite los tejidos conectivos que rodean todo el testículo.
- Incisión en el músculo cremáster verticalmente y aplanar el músculo sobre un cubreobjetos de vidrio sobre una bandeja de microscopio intravital fijando la periferia.
- Permitir 10-20 min para el músculo para estabilizar antes de la recogida de datos. Arteriolas del músculo cremáster (para la formación de trombos) y vénulas (para la inflamación vascular) con un diámetro de 30-45 micras fueron elegidos para el estudio.
- Para mantener las condiciones de anestesia, infusión de 30-50 ml de la misma anestesia aproximadamente cada 30 minutos a través de la cannulus yugular.
- Después de la colocación del ratón en el microscopio intravital, abierto SlideBook software 5.0 y haga clic en "Ventana de enfoque" en la barra de menú para configurar la óptica adecuadas y objetivas (60X).
- Infundir DyLight 488-rata conjugado anti-ratón CD42c (0,1 mg / g de peso corporal en 100 l de solución salina) y Alexa Fluor 647-conjugado anti-ratón de rata Gr-1 anticuerpos (0,05 mg / g de peso corporal en 100 l de solución salina) a través de un cannulus yugular .
- Ir a la barra de menús y haga clic en "Captura de imagen" en la barra de herramientas.
- Un nuevo menú aparecerá, en "Imagen", seleccione "Factor Bin" como 1x1 y seleccione "640" en la anchura y "460" en la altura.
- En "Set Filter", marque la casilla de verificación de los canales que le gustaría exponer y definir el tiempo de exposición para cada uno. Por ejemplo, canal abierto: 10 mseg, FITC canal: 50 mseg, y Cy5 canal: 50 mseg.
- Seleccione "Time-Lapse Capture" para ajustar el número de puntos de tiempo e intervalo. For el modelo de inflamación, el número de puntos de tiempo se establece en 1,000-1,500 con un intervalo de 200 ms (el tiempo total transcurrido: 5 min).
- Haga clic en "Test" para ver una imagen de un solo avión en el tiempo de exposición especificado para ese canal. Ajuste el tiempo de exposición y / o la luz del microscopio hasta que el histograma muestra una distribución de intensidad suficiente (para captura multi-canal, repita este proceso para cada canal).
- Una vez que todos los parámetros se ajustan (canales, tiempos de exposición, etc) en la "Captura de imagen", seleccione "Start" para comenzar la captura.
- Monitorear las plaquetas rodantes y adherentes y los neutrófilos durante 5 min en la mitad superior de una vénula cremáster inflamado en el modelo de inflamación vascular. De ocho a diez vénulas diferentes se registran en un ratón.
- Las imágenes fueron tomadas con un aumento total de 60x (1,0 NA objetivo de inmersión en agua), dando un tamaño de ventana de 157 m x 118 micras.
- Al finalizar el experimento, los ratones fueron sacrificados mediante cervical dislocation.
4. Análisis de datos para el modelo de inflamación vénulas
- Abra SlideBook software 5.0 y haga clic en "carpeta" en la barra de menú para abrir un archivo.
- Haga clic en el menú de canales desplegable y seleccionar "Abrir con FITC, Cy5, etc"
- Haga clic en "renormalizar (barras de color rojo y verde)" y seleccione el canal. Arrastre las barras rojas y verdes a la izquierda oa la derecha para optimizar o menos la señal de fluorescencia.
- Haga clic en "Aplicar" y "OK" para actualizar la imagen.
- Haga clic en botón "Miniaturas" para seleccionar la visualización actual como predeterminado.
- Juega imagen capturada timelapse, y contar neutrófilos rodantes y adherentes durante el período de 5 min.
- Para el análisis de la formación del trombo plaquetario, vaya a "Máscara" y seleccione "Crear".
- Nombre una máscara y la marca "A imagen actual".
- Haga clic en "icono de lápiz grande" en "Marquee Tool" en la vista principal.
- Colorea una región fuera del recipiente en la vista principal para establecer una máscara de fondo.
- Ir to "máscara", haga clic en "Copiar Esta Plane", haga clic en "máscara Copia en punto de tiempo actual" y seleccione "Todos los puntos de tiempo", y haga clic en "OK".
- Para el cálculo de la señal de fondo, vaya a "Estadísticas" y haga clic en "Estadísticas máscara".
- Haga clic en "Current Time Lapse 2D o imagen 4D (s)" en el ámbito de imagen y seleccione "Máscara entera" en Ámbito Mask. En Funciones, seleccione "Tiempo transcurrido (hh: mm: ms)" en Fecha de captura, seleccione "Area (píxeles)" bajo Morfometría, seleccione "Nivel máximo" bajo Intensidad, y haga clic en "Exportar" (Este método estadístico nos permite calcular auto-fluorescencia intensidad (señal de fondo)).
- Abrir el archivo de texto en MS Office Excel y calcular el valor medio de la señal de fondo durante todo el período de registro. Esta es la intensidad de fluorescencia de fondo.
- Para determinar la intensidad de trombos, haga clic en "icono de lápiz grande" de nuevo en el "Marquee Tool" en la vista principal.
- Color en el interior del recipiente en la vista principal para ajustar la señal de plaquetas.
- Vaya a "Mask", haga clic en "Copiar Esta Plane", haga clic en "máscara Copia en punto de tiempo actual", seleccione "Todos los puntos de tiempo", y haga clic en "OK".
- Vaya a "Estadísticas" y haga clic en "Estadísticas máscara".
- Haga clic en "Current Time Lapse 2D o imagen 4D (s)" en el ámbito de imagen y seleccione "Máscara entera" en Ámbito Mask. En Funciones, seleccione "Tiempo transcurrido (hh: mm: ms)" en Fecha de captura, seleccione "Area (píxeles)" bajo Morfometría, seleccione "Nivel Sum" en intensidad, y haga clic en "Exportar" (Este método estadístico nos permite calcular la intensidad de fluorescencia en el interior del recipiente).
- Abra el archivo de texto en Microsoft Office Excel. La señal de fluorescencia de las plaquetas se calcula restando el valor medio de la intensidad de área de fondo x (píxel) de la suma de la intensidad en el interior de la vasija. Esta es la intensidad de fluorescencia de los trombos de plaquetas.
- Repita esto en 30 vénulas diferentes en 3-5 ratones diferentes. A continuación, calcular el valor de la mediana de la intensidad de fluorescencia de las plaquetas.
- Aanalizar la rodadura de neutrófilos y la adherencia, la afluencia de rodadura de neutrófilos se determinó durante 5 min en cada vénula y presentados como número de células por minuto. El número de neutrófilos adherentes que eran estacionaria durante> 30 seg y se arrastró lentamente (<10 micras durante 30 s), pero no rodar, se contaron y se presentaron como el número de células por 5 min.
5. Microscopía intravital de trombosis inducida por láser arteriolar
5-1 de calibración de láser de ablación
- Colocar un portaobjetos de microscopio reflejado en el escenario, aplicar una pequeña gota de agua destilada a la parte superior de la corredera, y ajustar la intensidad y el enfoque utilizando el ocular.
- Abra "Ventana Focus" y seleccione la opción "FRAP" en la pestaña SlideBook software 5.0.
- Ajuste la potencia del láser en 40-50, y ajustar "repeticiones doble clic" y del "tamaño doble clic" a 8. Marque en la "guía" casilla para mostrar un conjunto de punto de mira.
- Seleccione la opción "Arrow" icono de la barra de tareas on la parte superior de la pantalla.
- En la sección "Alineación FRAP" haga click en "Fire siguiente". Un pequeño punto debería aparecer cerca de la esquina inferior izquierda de la pantalla. Una vez que la mancha aparece, haga doble clic en el centro de la misma. Una vez que se hace clic, otro punto debería aparecer por encima ya la derecha del punto primero, haga doble clic en él. Repita esto para 16 puntos (puntos 16 º aparecerá en la esquina inferior derecha.) Haga clic en "Guardar" cuando haya terminado de actualizar los parámetros de calibración.
- Para probar la exactitud de la calibración, haga clic en el "Centro" botón, un pequeño punto debe aparecer en el centro de la pantalla. Si no es así, repita la calibración hasta que la precisión deseada.
5-2 inducida por láser formación de trombos arteriolar
- Coloque un ratón anestesiado (véase el procedimiento de 2-2 a 2-12) en la platina del microscopio.
- En virtud de la "captura" de la ventana, seleccione un protocolo o crear uno nuevo. Los ajustes son los siguientes: CY5 (70 ms de exposición), Open (10 mseexposición c), y FITC (50 exposición mseg). La imagen se capturó más de 20 minutos (aproximadamente 2.400 puntos de tiempo con un intervalo de tiempo de 500 ms).
- Infundir DyLight 488-anti-ratón conjugado CD42c y Alexa Fluor 647-anti-ratón conjugados Gr-1 anticuerpos como se describe anteriormente.
- Optimizar los parámetros de microscopio incluyendo la intensidad de fluorescencia y la imagen de campo brillante como se describe en 3-3 a 3-7.
- Haga clic en el botón "Test" para asegurar la intensidad adecuada campo claro o señal de anticuerpos, la colocación de las arteriolas y enfoque.
- Haga clic en "Inicio" para iniciar el proceso de captura de imágenes.
- Antes de disparar el láser de ablación, asegúrese de que el icono del puntero del ratón ha sido seleccionado y que la pared del vaso está enfocada.
- Para disparar el láser, haga doble clic en un punto de 2-3 micras interna de la pared del vaso. Lesión de las células endoteliales de las arteriolas provoca un cambio de forma visual que deben ser evidentes en la imagen de campo claro, seguido por la acumulación de plaquetas. Monitor de tromboformación de 5 min después de la lesión con láser.
- Cinco minutos después de la lesión con láser (el tamaño del trombo ahora debe ser estable) pausa y cancelar la captura. Posteriormente, iniciar una captura con 2400 puntos de tiempo con un intervalo de 500 ms para registrar las plaquetas adherentes y neutrófilos rodantes / adherentes durante 20 min. De tres a cinco arteriolas son registrados en un ratón.
- Al finalizar el experimento, los ratones fueron sacrificados mediante dislocación cervical.
6. Análisis de datos para el modelo de trombosis arteriolar
- Repase los pasos 4.1 a 4.5.
- Para obtener la intensidad de la fluorescencia de fondo durante la formación de trombos de plaquetas, pasar a través de los pasos 4,7 4,14.
- Vaya a "Mask", haga clic en "segmentos", seleccione FITC en el canal, e insertar el valor medio de la señal de fondo en Low. Haga clic en "Aplicar" y "OK".
- Para analizar la intensidad de fluorescencia de trombos de plaquetas (DyLight 488-conjugado anti-CD42c anticuerpo),
- Para cuantificar los neutrófilos rodantes y adherentes, jugar el timelapse y contar el número de células que visiblemente rodar sobre el trombo plaquetario más de 20 min. Rodadura se define como una disminución en la velocidad de neutrófilos, mientras que la interacción con el trombo de plaquetas durante al menos 2 segundos. Neutrófilos adherentes se definen como cualquier neutrófilos que permanecen unidos a los trombos de plaquetas durante al menos 2 min. El número de neutrófilos rodantes y adherentes se presentó como el número de células por 20 min. La velocidad de rotación se calculó utilizando un sistema de rastreo de partículas.
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Representative Results
Usando un análisis detallado microscopía intravital, heterotípicas plaquetas neutrófilos interacciones en el endotelio activado se visualizaron mediante la infusión de anticuerpos marcadas con fluorescencia contra una de plaquetas (CD42c) o neutrófilos marcador (Gr-1) en ratones vivos.
En un modelo de TNF-α inducida por inflamación venular, neutrófilos más de rodadura se adhirieron de forma estable al endotelio presumiblemente por la interacción de las integrinas β2 activados con ICAM-1 durante el período de registro (3-4.5 hr después de la inyección de TNF-α, la Figura 2A ). 8 Rodamientos, neutrófilos adherentes ya estaban presentes antes de la captura de vídeo comenzó debido a la activación de las células TNF-α inducida endotelial. El número de neutrófilos rodantes y adherentes en las células endoteliales inflamados fue 0,25 ± 0,05 células por minuto y 18,5 ± 0,7 células por 5 min, respectivamente (Figuras 2B y 2C). La mayoría de los neutrófilos se adhirieron a la tactivó endotelio durante la duración de captura de vídeo (1-1.5 hr), y había sólo una disminución mínima en células adherentes junto con un aumento mínimo de las células rodantes (datos no mostrados). Se encontró que la mayoría de las plaquetas se adhieren a los neutrófilos adherentes y se arrastra en lugar de la pared del vaso inflamado (Figura 2A, Video 1). Plaquetas trombos acumulada y embolizar repetidamente durante la duración de la captura de vídeo. La señal integrada de la fluorescencia asociada con plaquetas adherentes se muestra en la Figura 2D.
Utilizando este modelo de trombosis inducida por láser arteriolar, hemos sido capaces de examinar y caracterizar la interacción heterotípica de plaquetas y neutrófilos en el sitio de lesión de la pared arteriolar. En este modelo, el tamaño del trombo alcanzó su punto máximo alrededor de 100 segundos después de la lesión con láser, seguido por una serie de embolización pequeño rápido para el próximo 2-3 min (datos no mostrados). 9,10 Cinco minutos después de la lesión con láser, el tamaño de t plaquetashrombus se mantuvo relativamente constante durante la formación de imágenes (5-25 min después de la lesión con láser, las figuras 3A-3C) y neutrófilos arrolladas sobre y se adhiere a los trombos de plaquetas (Figuras 3B-3A, vídeo 2). La señal de fluorescencia de las plaquetas circulantes fue insignificante en comparación con la de los trombos de plaquetas. El número de neutrófilos rodantes y adherentes fue de 21,5 ± 3,0 y 1,6 ± 0,4 células durante 20 min, respectivamente (Figuras 3D-3E). Laminación inicial rápida de los neutrófilos se produjo en las células endoteliales. Una vez que los neutrófilos en contacto con los trombos de plaquetas, la velocidad de rodamiento de los neutrófilos en un trombo de plaquetas se cambió con un rango de 8,2 ± 1,1 micras por segundo (Figura 3F), que es mediada por la interacción de P-selectina y PSGL-1. 11
Figura 1.Esquema del sistema de microscopio intravital (A) y la preparación de la microvasos del músculo cremáster (B).
Figura 2. Interacciones heterotípicas de plaquetas y neutrófilos durante la inflamación venular TNF-α inducida en ratones vivos. Plaquetas y neutrófilos fueron detectados por DyLight 488-anti-ratón conjugado CD42c y Alexa Fluor 647-anti-ratón conjugados anticuerpos GR-1, respectivamente. ( Un representante) binariza imágenes de la aparición de señales de fluorescencia asociados con neutrófilos (rojo) y plaquetas (verde) durante 180 seg. La flecha muestra la dirección del flujo sanguíneo. Bar = 10 micras. (BC) El número de rodadura (células / minuto) y neutrófilos (células adherentes / min 5) en la inflamación de las células endoteliales se muestra. Los datos representan la media ± SEM de la di 30vénulas ferentes en 4 ratones de tipo salvaje. (D) Mediana de señal integrada de fluorescencia de las plaquetas (F plaquetas) se representa gráficamente como una función del tiempo. No se detectó señal con DyLight 488-conjugado de IgG de rata de control (datos no mostrados).
Figura 3. Interacción heterotípica de neutrófilos con un trombo de plaquetas en el sitio de la lesión inducida por láser arteriolar en ratones vivos. Las plaquetas y los neutrófilos se detectaron como se describe en la Figura 2. (A) un único neutrófilos (rojo, una flecha amarilla) se desplaza sobre el trombo de plaquetas (verde), mientras que un segundo de neutrófilos (rojo, una flecha blanca) rápidamente se desplaza sobre arteriolares células endoteliales, que se muestra durante 5 s. (B) Un neutrófilo única (rojo) rodando sobre y adherirse a un trombo de plaquetas (verde) se muestran más de 15 seg . La flecha muestra la rodadura y adherente neutrophils. Bar = 10 micras. El espesor, gris flecha muestra la dirección del flujo sanguíneo. (C) La mediana de la señal de fluorescencia integrada de plaquetas (F plaquetas) se representa gráficamente como una función del tiempo. (DE) El número de neutrófilos rodantes y adherentes en el trombo de plaquetas se muestra (cells/20 min). (F) La velocidad de rodamiento de los neutrófilos en los trombos de plaquetas. Los datos representan la media ± SEM de los trombos 14 en 5 ratones de tipo salvaje.
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Discussion
Aquí se describe un protocolo detallado para tiempo real microscopía de fluorescencia intravital para visualizar heterotípicas plaquetas neutrófilos interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y trombosis. Anteriormente, los enfoques similares microscópicas de fluorescencia se registraron para estudiar el mecanismo molecular de la formación de trombo y la inflamación vascular. 8,12 Desde el heterotípicos interacción célula-célula podría ser importante para la oclusión vascular en el sitio de la lesión, esta tecnología será una herramienta valiosa para los el estudio de los mecanismos celulares y moleculares de la enfermedad vascular. La ventaja de la tecnología de formación de imágenes en tiempo real es para controlar las interacciones inmediatas y posteriores de las células intravasculares en el endotelio activado / dañado bajo condiciones inflamatorias y trombóticas. Además, nuestro sistema microscópico podría ser utilizado en el estudio de las interacciones heterotípicas entre las células tumorales circulantes y endoteliales o células sanguíneas utilizando fluorescently marcado con las células tumorales o anticuerpos contra marcadores de células tumorales, como el humano molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM). 13,14 En lugar de usar anticuerpos marcadas con fluorescencia, microscopía este también podría ser realizado con ratones transgénicos que expresan proteínas fluorescentes en un tipo específico de célula tales como CD41-EYFP + 15 megacariocitos.
Utilizando la intensidad de anticuerpos marcadas con fluorescencia, se podría determinar la cinética de formación de trombos de plaquetas y la expresión molecular en las células activadas intravascular después de la lesión del vaso. Sin embargo, la mayoría de los anticuerpos utilizados en este fin inhibir la función de antígeno que puede dar lugar a resultados inesperados. Por lo tanto, el experimento se llevó a cabo con un cuidado especial para optimizar la concentración a la que el anticuerpo da la señal de fluorescencia suficiente por su unión al antígeno sin afectar a la función de antígeno. Además, la especificidad del anticuerpo es otro issue. Se sabe que las subpoblaciones de células dendríticas y monocitos expresan niveles bajos de Gr-1. 16
Sin embargo, se encontró que los monocitos son sólo 3-5% de los leucocitos de rodadura durante la inflamación aguda y la formación de trombos, como se determina por un anticuerpo marcado fluorescentemente contra ratón F4/80 que se expresa exclusivamente en monocitos y células dendríticas (datos no mostrados). Leucocitos Por lo tanto, la mayor parte de rodadura y adherente durante TNF-α inducida por inflamación venular y trombosis inducida por láser arteriolar sería neutrófilos.
En este informe, hemos utilizado dos modelos de ratón de la enfermedad vascular. Aunque entendemos que no existe un modelo animal puede recapitular las condiciones de enfermedades humanas, el trabajo llevado a cabo en los microvasos de ratones vivos utilizando esta tecnología tendrá una relación directa con la enfermedad humana y será fácilmente traducible a un mejor tratamiento de la trombosis enfermedades inflamatorias.
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Disclosures
Los autores declaran no tener ningún interés en competencia financiera.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (P30 HL101302 y RO1 HL109439 a JC) y la American Heart Association (SDG 5270005 a JC). A. Barazia fue apoyado por una beca de formación T32HL007829 NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| MgCl2 6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | 144-55-8 | |
| 0.9% NaCl Saline | Hospira | 0409-4888-10 | |
| Ketamine | Hospira | 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Lloyd | ||
| Intramedic Tubing (PE 90) | BD Diagnostics | 427421 | |
| Intramedic Tubing (PE 10) | BD Diagnostics | 427401 | |
| Murine TNF-α | R&D Systems | 410-MT | |
| Dylight 488- labeled rat anti-mouse CD42b antibody | Emfret Analytics | X488 | |
| Alexa Fluor 647-conjugated anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) Antibody | BioLegend | 108418 | |
| NESLAB EX water bath/circulator | Thermo-Scientific | ||
| Olympus BX61W microscope | Olympus | ||
| TH4-100 Power | Olympus | ||
| Lambda DG-4 | Sutter | ||
| MPC-200 multi-manipulator | Sutter | ||
| R–-200 stage controller | Sutter | ||
| C9300 high-speed camera | Hamamatsu | ||
| Intensifier | Video Scope International | ||
| Ablation Laser | Photonic Instruments, Inc. | ||
| SlideBook 5.0 | Intelligent Imaging Innovations |
References
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