Summary
कट्टरपंथी आधारित biomimetic रसायन इमारत biomarker विकास के लिए आवश्यक पुस्तकालयों के लिए लागू किया गया है.
Abstract
जीवन विज्ञान में मुक्त कण की भागीदारी लगातार समय के साथ वृद्धि हुई है और कई शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं के लिए जोड़ा गया है. इस विषय के विविध वैज्ञानिक क्षेत्रों को गले लगाती है, जीव विज्ञान और चिकित्सा के लिए भौतिक, जैविक और bioorganic रसायन शास्त्र से जीवन, स्वास्थ्य और उम्र बढ़ने की गुणवत्ता के सुधार के लिए आवेदन के साथ फैले. इन दोनों क्षेत्रों कौशल जैविक वातावरण और ज्ञान बुनियादी प्रक्रियाओं और तंत्र का अनावरण करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता रासायनिक में कट्टरपंथी प्रक्रियाओं के कई पहलुओं की पूर्ण जांच के लिए आवश्यक हैं. हम एक रासायनिक जीव विज्ञान जैविक प्रक्रियाओं के साथ मुफ्त कट्टरपंथी रासायनिक जेट कनेक्ट, यंत्रवत रास्ते और उत्पादों पर जानकारी प्रदान करने में सक्षम दृष्टिकोण विकसित किया है. इस दृष्टिकोण के कोर biomimetic मॉडल के डिजाइन करने के लिए सिस्टम में जलीय biomolecule व्यवहार (lipids, न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन) का अध्ययन, प्रतिक्रिया की अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के रूप में एक अच्छी तरह से रास्तेऊपर मुफ्त कट्टरपंथी प्रतिक्रिया उत्पादों की आणविक पुस्तकालयों के निर्माण. इस संदर्भ में सफलतापूर्वक biomarker खोज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और उदाहरण यौगिकों के दो वर्गों के साथ प्रदान की जाती हैं: मोनो ट्रांस cholesteryl एस्टर के isomers, जो संश्लेषित और मानव प्लाज्मा में पता लगाने के लिए संदर्भ के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं और purine 5 ',8-cyclo-2 'deoxyribonucleosides तैयार है, और डीएनए नमूनों में इस तरह के घावों का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल में संदर्भ के रूप में प्रयोग किया जाता है, या ionizing विकिरण के बाद विभिन्न स्वास्थ्य स्थितियों से प्राप्त.
Introduction
मुक्त कण के जेट उम्र बढ़ने और सूजन सहित कई जैविक घटनाओं, के लिए भारी महत्व का पता चला. आजकल, यह अधिक से अधिक स्पष्ट है कि प्रत्येक रासायनिक इस जेट में शामिल कदम के स्पष्टीकरण की जरूरत है, क्रम में अंतर्निहित मुक्त कण और क्षति की मरम्मत के नियंत्रण के लिए और तंत्र की परिकल्पना की गई प्रभावी रणनीति को समझने के लिए. रासायनिक अध्ययन से योगदान मौलिक है, लेकिन जैविक वातावरण में प्रत्यक्ष अध्ययन करने के लिए मुश्किल हो सकता है, क्योंकि विभिन्न प्रक्रियाओं के superimposition पेचीदा हो सकते हैं और परिणाम और निष्कर्ष से संबंधित परीक्षा perturbs. इसलिए, biologically संबंधित स्थितियों के तहत मुफ्त कट्टरपंथी प्रतिक्रियाओं मॉडलिंग की रणनीति रासायनिक तंत्र के जीव विज्ञान में अनुसंधान के क्षेत्र में एक मौलिक कदम बन गया है.
पिछले दशक में हमारे समूह biomimetic शर्तों के तहत मुक्त कट्टरपंथी प्रक्रियाओं के मॉडल विकसित किया है. हम विशेष रूप से एनअसंतृप्त फैटी एसिड, nucleosides, और सल्फर युक्त अमीनो एसिड के biologically प्रासंगिक परिवर्तनों अनुहार का और उन्हें ट्रैक में डाल करने के लिए मूल्यांकन और स्वास्थ्य की स्थिति के बायोमार्कर के रूप में मान्य किया जा 1-4.
हमारी सामान्य दृष्टिकोण तीन मॉड्यूल के होते हैं:
- कार्बनिक संश्लेषण, जो उचित संशोधित biomolecules पहुँच प्रदान करता है. सिंथेटिक योजना भी क्रम में मुक्त कट्टरपंथी जैविक वातावरण में होने वाली प्रक्रियाओं का अनुकरण कर सकते हैं, इस प्रकार के लिए ब्याज की जैविक प्रक्रिया जो biomimetic कट्टरपंथी रसायन शास्त्र के सिद्धांत है अनुकरण करने में सक्षम शर्तों को लागू करने. Biomimetic मॉडल में प्रतिक्रिया मध्यम पानी या एक विषम हाइड्रोफिलिक और hydrophobic डिब्बों के साथ साथ मौजूदगी की वजह से मध्यम है. biomimetic मॉडलों के साथ काम करने के लिए लाभ के लिए ज्ञात प्रतिक्रिया भागीदारों, जहां जेट और उत्पादों को अधिक विवरण में जांच की जा सकती है के साथ एक सरलीकृत वातावरण है, संभवतः की खोजउपन्यास रासायनिक रास्ते. इस कदम से यंत्रवत और गतिज जानकारी इकट्ठा किया जा सकता है;
- विश्लेषण, शोधन और उत्पादों के लक्षण, संशोधित biomolecules के संरचनात्मक और रासायनिक जानकारी उपलब्ध कराने के क्रम में आणविक पुस्तकालयों को व्यवस्थित करने के लिए और अधिक जटिल जैविक वातावरण recognition.in को सुविधाजनक बनाने के. प्रोटोकॉल भी जैविक नमूनों से प्राप्त उन लोगों के रूप में इस तरह के यौगिकों के जटिल मिश्रण को हल करने के दृश्य में स्थापित कर रहे हैं;
- Biomarker विकास जैविक नमूने, द्वारा या तो सेल संस्कृतियों का उपयोग करते हुए इन विट्रो प्रयोगों में प्राप्त किया है, और पशुओं और मनुष्यों से vivo अध्ययन में उपयोग. biomimetic मॉडल में विकसित प्रोटोकॉल तो नमूने की जटिल विश्लेषण करने के लिए लागू कर रहे हैं, के लिए अलग अलग परिस्थितियों में मुफ्त कट्टरपंथी परिवर्तनों की परिकल्पना की गई है. आण्विक पुस्तकालयों संश्लेषण द्वारा विकसित जीवन विज्ञान की खोजों के लिए भारी मदद की हैं. जानकारी मुक्त कट्टरपंथी परिवर्तनों giv पर इकट्ठाई अवसर बाहर मरम्मत और रोकथाम रणनीति आंकड़ा. परिणामों के डेटाबेस biomarker के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संभव महत्व से जुड़े कारकों की बहुभिन्नरूपी विश्लेषण के अनुसार एक सावधान मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Cholesteryl एस्टर और 5 purine ',8-cyclo-2' deoxyribonucleosides: हम प्रासंगिक बायोमार्कर के दो वर्गों के लिए इस दृष्टिकोण को मान्यता के लिए चुना है.
Protocol
1. मोनो Cholesteryl Esters ट्रांस isomers का संश्लेषण
- 2-propanol में cholesteryl एस्टर (linoleate या arachidonate cholesteryl एस्टर) (15 मिमी) को भंग. एक बेहतर solubilization के लिए नमूने argon के तहत 15 मिनट के लिए sonicated थे.
- एक क्वार्ट्ज photochemical रिएक्टर समाधान स्थानांतरण, 2-propanol में 2 mercaptoethanol (7 मिमी एकाग्रता, thiol एक 2 एम स्टॉक समाधान तक पहुँचने से). फ्लश argon क्रम में समाधान में ऑक्सीजन की उपस्थिति को खत्म करने के लिए 20 मिनट के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण.
- यूवी 22 पर एक 5.5W पारा कम दबाव दीपक का उपयोग कर प्रकाश से प्रतिक्रिया मिश्रण चमकाना ± 2 ° C 4 मिनट के लिए. मॉनिटर द्वारा एजी टीएलसी (चांदी पतली परत क्रोमैटोग्राफी) मोनो पार cholesteryl एस्टर (रासायनिक फार्मूले के लिए 1 चित्रा देखें) के गठन के सबूत के लिए विश्लेषणात्मक. टीएलसी धुंधला हो सैरियम अमोनियम molibdate समाधान (सीएएम) में प्लेट गिरने से बाहर किया जाता है, और स्पॉट हीटिंग पर दिखाई देते हैंथाली. एक प्रारंभिक चरण में प्रतिक्रिया बुझाने के क्रम में शुरू सामग्री, कि isomerization के दूसरे दौर की कुल उपज का एक वृद्धि प्राप्त करने करने के लिए reused किया जा सकता है ठीक है.
- राउंड नीचे एक फ्लास्क में प्रतिक्रिया मिश्रण ले लीजिए, 2-propanol कुछ मिलीलीटर के साथ तंत्र धोने. विलायक निकालें और एज - टीएलसी द्वारा मोनो पार cholesteryl एस्टर के isomers के रूप में साहित्य में वर्णित शुद्ध. 5 उपयोग मोनो ट्रांस cholesteryl linoleate isomers के लिए eluent के रूप में ईथर हेक्सेन diethyl (09:01 वी / वी) का है, जबकि उपयोग के हेक्सेन diethyl मोनो ट्रांस cholesteryl arachidonate isomers के लिए ईथर - एसिटिक एसिड (9:1:0,1 वी / वी).
2. Cholesteryl Esters भिन्न की मानव सीरम से अलगाव
- नमकीन के 1 मिलीलीटर के साथ मानव सीरम (खून की centrifugation द्वारा प्राप्त) के 1 मिलीलीटर पतला और कलाकृतियों (जैसे ऑक्सीकरण adducts) से बचने के क्रम में एक विभाजक कीप में argon की एक धारा के तहत समाधान डालना. जोड़ें 10 मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म मेथनॉल (21 वी / वी) तीन बार. जुदा कीप बहुत धीरे धीरे शेक क्रम में albumin की उपस्थिति के कारण पायस के गठन को सीमित करने के लिए.
- परतों जैविक नमकीन (10 मिलीग्राम) के साथ एक बार धोएं, तो एक argon प्रवाह के तहत एक Erlenmeyer फ्लास्क में इकट्ठा, सोडियम सल्फेट निर्जल पर सूखी. एक पीले रंग का तेल (कुल प्लाज्मा लिपिड अंश) वहन रोटरी बाष्पीकरण द्वारा वाष्पशील निकालें.
- क्लोरोफॉर्म मेथनॉल के 1 मिलीलीटर (2:1 वी / वी), एक प्रारंभिक टीएलसी पर argon की एक धारा के तहत लोड के साथ कच्चे तेल ले लो और eluent hexane diethyl ईथर (09:01 वी / वी) के एक मिश्रण का उपयोग . सिलिका cholesteryl एस्टर अंश युक्त भाग परिमार्जन और एक शीशी में डाल देना. फिर, सिलिका निकालने के (3 × 5 मिलीग्राम) क्लोरोफॉर्म मेथनॉल (02:01 वी / वी) के साथ, परतों जैविक इकट्ठा और वाष्पीकरण के बाद हटाने विलायक cholesteryl एस्टर (आमतौर पर ~ 1.5 मिलीग्राम) का शुद्ध अंश खर्च.
- आर्गन और स्टोर के तहत एक अंधेरे एल्यूमीनियम पन्नी से -20 डिग्री सेल्सियस पर कवर शीशी में cholesteryl एस्टर रखें Cholesteryl ईमंत्रियों प्रकाश और ऑक्सीजन के प्रति संवेदनशील हैं.
3. रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी मोनो पार Cholesteryl Esters की विशेषता
- Cholesteryl एस्टर मानव सीरम (≥ 0.7 मिलीग्राम) से निकालें धारा 2 में वर्णित के रूप में, कार्बन टेट्राक्लोराइड (≤ 10 μl) और एक शीशी में जगह की एक छोटी राशि में भंग. सीसीएल 4 विलायक के रूप में चुना जाता है क्योंकि इसके रमन संकेत cholesteryl एस्टर विश्लेषण के हित के क्षेत्र के साथ ओवरलैप नहीं करता है.
- एक डिस्पोजेबल गिलास विंदुक के माध्यम से नमूना धारक समाधान स्थानांतरण, तो ध्यान argon एक धीमी धारा से हटाने विलायक. एक बार एक वर्दी तेल फिल्म नमूना धारक के आंतरिक दीवार पर बनाई है, साधन में माप के लिए बाद जगह.
- फूरियर बदल cholesteryl एस्टर के रमन स्पेक्ट्रम सीधे किसी भी derivatization प्रतिक्रिया के बिना लिपिड निष्कर्षों पर प्राप्त. नमूना पर लेजर शक्ति <नमूना क्षति से बचने के लिए 100 मेगावाट है. स्कैन की कुल संख्या≥ पृष्ठभूमि शोर को कम करने के प्रत्येक स्पेक्ट्रम के लिए 800 है.
- रमन स्पेक्ट्रम की 1,700-1,630 सेमी -1 रेंज के बाद से यह सी सी = डबल अणु (सी = C मोड खींच) में मौजूद बांड से योगदान को दर्शाता है विश्लेषण किया है. एक वक्र ढाले विश्लेषण इस क्षेत्र पर किया जाता है, इस तरह की अनुमति फैटी alkyl श्रृंखला और कोलेस्ट्रॉल की अंगूठी बी में डबल बांड (2 चित्रा देखें) में सीआईएस और ट्रांस डबल बांड से आरोपित योगदान का भेद.
- सही ढंग से कंपन बैंड फिट करने के लिए, कुछ मापदंडों या तय किया जाना चाहिए उचित सीमाओं के भीतर विवश. घटक शिखर प्रोफाइल Lorentzian और गाऊसी कार्यों के एक रेखीय संयोजन के रूप में वर्णित हैं, है जबकि आधी ऊंचाई bandwidths सबसे अच्छा कंप्यूटर अनुकूलन दिनचर्या द्वारा निर्धारित कर रहे हैं. और घटक चोटियों की संख्या की स्थिति 4 व्युत्पन्न स्पेक्ट्रा, जो भी कुछ कमजोर घटक बैंड का पता लगाने की अनुमति का उपयोग करके प्राप्त कर रहे हैं. चूंकि संकेतइस प्रकार, संकल्प और शोर अनुपात करने के लिए संकेत के बीच एक सही समझौता प्राप्त किया जाता है, शोर अनुपात जो संकेत के भेदभाव पर कमजोर होती जाती है 4 व्युत्पन्न का उपयोग छीन सकता है, एक तेरह सूत्री समारोह Savitsky Golay साथ 4 डेरिवेटिव smoothed, लाभ के हैं . सर्वश्रेष्ठ वक्र ढाले न्यूनतम संभव ग 2 मूल्यों को प्राप्त कर रहे हैं.
- ट्रांस isomers की उपस्थिति 1671 में घटक ± 1 -1 करने के लिए इसके अलावा में, कम से कम, सेमी, दो घटकों, थोड़ा कम आवृत्तियों की ओर स्थानांतरित कर दिया, फैटी एसिड श्रृंखला के कारण और कोलेस्ट्रॉल सी = C डबल बांड से पता चला है. प्लाज्मा cholesteryl एस्टर की प्रतिनिधि रमन स्पेक्ट्रम 9 चित्र में दिखाया गया है. इनसेट में cholesteryl linoleate और मोनो ट्रांस cholesteryl linoleic एसिड isomers के साथ एक विशिष्ट क्षेत्र की तुलना में दिखाया गया है.
4. फैटी एसिड मिथाइल (प्रसिद्धि) Esters और गैस क्रोमैटोग्राफी द्वारा विश्लेषण Derivatization
- भंगcholesteryl एस्टर सोडियम हाइड्रोक्साइड के बेंजीन मेथनॉल में एक 1 एम समाधान (02:03 वी / वी) और एक अंधेरे argon तहत एल्यूमीनियम पन्नी द्वारा कवर शीशी में जगह की 0.5 मिलीलीटर के साथ (~ 1.5 मिलीग्राम).
- कमरे के तापमान और टीएलसी द्वारा निगरानी eluent रूप hexane diethyl ईथर (09:01 वी / वी) के एक मिश्रण का उपयोग मिश्रण सरगर्मी छोड़ दो. प्रतिक्रिया समय आमतौर पर 30 मिनट है, लेकिन एक सावधान प्रतिक्रिया की निगरानी की आवश्यकता है. वास्तव में, एक बार इसी मिथाइल esters का गठन कर रहे हैं, प्रतिक्रिया क्रम में गिरावट और पक्ष उत्पादों के गठन से बचने के quenched किया जाना चाहिए. टीएलसी मिथाइल esters की मात्रात्मक गठन दिखाया.
- नमकीन पानी के 1 मिलीलीटर जोड़कर प्रतिक्रिया मिश्रण बुझाने और मिथाइल esters निकालने n-hexane (3 × 2 मिलीलीटर) के साथ. परतों जैविक को एक शीशी में ले लीजिए और रोटरी वाष्पीकरण द्वारा विलायक को दूर करने के लिए मिथाइल एस्टर अंश है, जो फिर आगे शोधन के बिना जीसी विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है वहन.
- N-hexane की न्यूनतम मात्रा (आमतौर पर 5 में 1 मिलीग्राम में मिथाइल esters भंग0) μl और एक 60 × 0.25 मिमी × 0.25 (50% cyanopropyl सुक्ष्ममापी) methylpolysiloxane स्तंभ मीटर के साथ सुसज्जित जीसी में इंजेक्षन. निम्न ओवन कार्यक्रम के साथ एक लौ ionization डिटेक्टर (खूंटी) का प्रयोग करें: सी / 195 मिनट के लिए ऊपर 165 पर तापमान शुरू डिग्री सेल्सियस, 3 मिनट, 1 की वृद्धि के बाद के लिए पकड़ डिग्री सेल्सियस, 40 मिनट, एक दूसरे के द्वारा पीछा के लिए पकड़ ° 10 की वृद्धि हुई ° C / 240 के लिए न्यूनतम ° C, और 10 मिनट के लिए पकड़. एक लगातार दबाव मोड (29 साई) को चुना है. हीलियम या हाइड्रोजन गैस वाहक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. मिथाइल esters प्रामाणिक नमूनों की अवधारण समय के साथ तुलना के द्वारा की पहचान कर रहे हैं 10 चित्रा प्रसिद्धि के एक प्रतिनिधि जीसी विश्लेषण प्लाज्मा cholesteryl एस्टर से प्राप्त से पता चलता है.
5. संश्लेषण (5'R) और (5) -5 - deoxyadenosine ',8-cyclo-2'
- 8-ब्रोमो 2'-deoxyadenosine के 33 मिलीग्राम (8-BR-Dado है) acetonitrile में (100 मिलीलीटर) भंग क्रम में 1 मिमी एकाग्रता तक पहुँचने के लिए. Photoreactor में गैस प्रवाह (Ar या N2) को विनियमित करने और भरने के अप्पा8-BR-Dado के समाधान के साथ ratus.
- Photoreactor इनपुट के लिए उपयुक्त आकार के साथ एक पट तैयार और एक इसे के केंद्र के माध्यम से अक्रिय गैस लाइन से जुड़ा सुई पास. पट साथ प्रणाली बंद करें. 30 मिनट के लिए अक्रिय गैस फ्लश.
- 22 पर एक 125W मध्यम दबाव पारा दीपक का उपयोग कर यूवी प्रकाश द्वारा चमकाना ± 2 ° C 15 मिनट के लिए, एक 250 मिलीलीटर दौर तली फ्लास्क में समाधान इकट्ठा. 10 मिलीलीटर acetonitrile के साथ photoreactor धोने और एक ही फ्लास्क में धोने के इकट्ठा.
- 1 एम एनएच 4 OH समाधान के साथ कच्चे तेल की प्रतिक्रिया मिश्रण बुझाने और रोटरी बाष्पीकरण में विलायक लुप्त हो जाना.
- ज्ञात शर्तों के तहत भागो विश्लेषणात्मक स्तंभ के साथ उच्च प्रदर्शन तरल chromatographic विश्लेषण (HPLC यूवी) (इंस्ट्रूमेंटेशन अनुभाग देखें), प्रोफाइल और संदर्भ यौगिकों के साथ की तुलना.
- निम्नलिखित प का उपयोग करके एक विश्लेषणात्मक स्तंभ (इंस्ट्रूमेंटेशन अनुभाग देखें) के साथ उच्च प्रदर्शन तरल chromatographic विश्लेषण (HPLC यूवी) चलाएँvents और gradients: 2 मिमी अमोनियम formate विलायक के रूप में एक और acetonitrile विलायक बी के रूप में 1 मिलीग्राम / मिनट और 0% विलायक बी से 0.3% विलायक बी ढाल करने के लिए 2.2 मिनट में पहुंचा जा प्रवाह दर सेट. फिर 0.8% मिनट में 4.0, तो 1% 4.8 मिनट में विलायक बी में विलायक बी. 9 मिनट के लिए 1% विलायक बी में रहने और फिर 6 मिनट में 8% विलायक बी. 10% विलायक बी 4 मिनट में जाने के लिए और 5 मिनट में 30% विलायक बी और अन्य 5 मिनट के लिए 30% विलायक ख में रहने के बाद. Chromatographic दो अलग शीशियों में दो diastereomeric उत्पादों के लिए इसी चोटियों ले लीजिए.
- यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में दो एकत्र भिन्नों के absorbance उपाय और सटीक कानून बच्चा जनने वाला भेड़ - बीयर (= εlC, जहां एक absorbance है ε विलुप्त होने गुणांक और एल सेल की लंबाई) के आधार पर एकाग्रता की गणना. (Dado) 2'deoxyadenosine (260 एनएम पर 15,400 एम -1 -1 सेमी) के विलुप्त होने के गुणांक ε का प्रयोग करें.
6. संश्लेषण (5'R) - एक(5) घ -5 ',8-cyclo-2' deoxyguanosine
- 8-ब्रोमो 2'-deoxyguanosine के 35 मिलीग्राम (8-BR-dGuo) और सोडियम आयोडाइड (NAI) के 30 मिलीग्राम आसुत जल (100 मिलीलीटर) में भंग क्रम में 1mm और 2mm एकाग्रता तक पहुँचने, क्रमशः. अक्रिय गैस (Ar या 2 एन) photoreactor से जुड़ा प्रवाह को नियंत्रित करने के लिए और समाधान के साथ प्रतिक्रिया photoreactor भर.
- प्रतिक्रिया के रूप में 5 प्रक्रिया में वर्णित (b कदम) मिश्रण Degass.
- यूवी प्रकाश द्वारा चमकाना एक 125W मध्यम दबाव पारा दीपक का उपयोग कर 22 पर 2 ± ° C 30 मिनट के लिए, एक 250 मिलीलीटर दौर तली फ्लास्क में समाधान इकट्ठा. पानी की 10 मिलीलीटर के साथ photoreactor धोने और एक ही फ्लास्क में धोने के इकट्ठा.
- 1 एम एनएच 4 OH समाधान के साथ कच्चे तेल की प्रतिक्रिया मिश्रण बुझाने और वैक्यूम के अंतर्गत विलायक लुप्त हो जाना.
- विश्लेषण प्रदर्शन के रूप में 5 प्रक्रिया में वर्णित (जी को ई कदम). (DGuo) 2'deoxyguanosine (260 एनएम पर 11,700 एम -1 -1 सेमी) के विलुप्त होने के गुणांक ε का प्रयोग करें.
7. समस्थानिक लेबल्ड Purine (5'R) के संश्लेषण और (5) -5 ',8-cyclonucleosides
- 1mm 15 एन समस्थानिक लेबल purine nucleosides के जलीय घोल (आसुत जल) के 2 मिलीलीटर तैयार ([5 15N] पनेल बैठाना या dGuo [15N 5]) (4 मिलीलीटर) एक पट टोपी के साथ एक गिलास शीशी में.
- शीशी को पट टोपी के साथ कनेक्ट और पट है कि शीशी के नीचे तक पहुँच में एक सुई के माध्यम से गैस लाइन (एन 2 हे समाधान की संतृप्ति के लिए) के लिए कनेक्ट. पट टोपी में एक और छोटी सुई गैस बाहर निकलने के रूप में काम करता है.
- एन 2 हे के साथ 30 मिनट के लिए समाधान फ्लश. गैस प्रवाह बहुत कम हो विनियमित है.
- बाहर निकलें सुई पहले बाहर ले लिया है और 1 'लंबे समय के बाद एक के बाद, क्रम में शीशी के अंदर एक छोटा सा दबाव है.
- गामा radiolysis के तंत्र में 8 घंटे (एक खुराक दर 4.5 Gy / मिनट क्षमताओं के आधार पर गणना) के लिए समाधान रखो.
- बाद प्रतिक्रिया 1 एम एनएच 4 के साथ कच्चे तेल की बुझा लेते हैं
- ज्ञात शर्तों, 6 के तहत उच्च प्रदर्शन तरल chromatographic विश्लेषण (HPLC यूवी) भागो और मानक संदर्भ के साथ chromatogram तुलना.
8. डीएनए जलकृत समाधान के गामा Radiolysis
- 0.5 मिलीग्राम / मिलीलीटर बछड़ा थाइमस डीएनए की समाधान (आसुत जल) की 1 मिलीग्राम तैयार और एक पट टोपी के साथ एक गिलास शीशी (2 मिलीलीटर) में डाल दिया.
- प्रतिक्रिया के रूप में 7 प्रक्रिया में वर्णित (bd कदम) Degass.
- गामा radiolysis के तंत्र में 30 मिनट (/ खुराक दर 4.5 Gy / मिनट क्षमताओं के आधार पर गणना) के लिए समाधान रखो.
9. डीएनए के enzymatic पाचन
- एक Eppendorf डीएनए की 80 ग्राम युक्त ट्यूब, nuclease P1, 0.01 phosphodiesterase द्वितीय, 300 मिमी सोडियम (5.6 पीएच) एसीटेट और 10 मिमी जस्ता क्लोराइड के 20 μl में 20 EHNA की nmol यू के 8 यू जोड़ें. 37 डिग्री सेल्सियस से कम 48 घंटे के लिए मिश्रण सेते हैं.
- अगले alkaline फॉस्फेट के 8 यू का एक मिश्रण, phosphodiesteras की 0.02 यू जोड़ेंमैं ई, 0.5 एम Tris एचसीएल मिश्रण पाचन बफर (8.9 पीएच) की 40 μl में. नमूना 37 डिग्री सेल्सियस से कम 2 घंटे के लिए incubated है.
- मिश्रण 10% फार्मिक एसिड के अलावा द्वारा neutralized है.
- नमूना को एक Amicon अल्ट्रा 0.5 केन्द्रापसारक फ़िल्टर डिवाइस (cutoff 3 केडीए) के लिए स्थानांतरित करने के लिए, tridistilled एच 2 ओ की 200 μl जोड़ें अपकेंद्रित्र रोटर में 15 मिनट के लिए 14,000 XG पर जगह अल्ट्रा फिल्टर. Microcentrifuge ट्यूब से फिर अल्ट्रा फ़िल्टर डिवाइस अलग. Microcentrifuge ट्यूब में एंजाइम मुक्त समाधान Lyophilize.
10. डीएनए का नमूना विश्लेषण के लिए पहले desalinization
- भागो विश्लेषणात्मक उच्च स्तंभ के साथ प्रदर्शन तरल chromatographic विश्लेषण (HPLC यूवी) (इंस्ट्रूमेंटेशन अनुभाग देखें) ज्ञात शर्तों का पालन 6.
- एच 2 हे की 20 μl में lyophilized पचा डीएनए भंग और HPLC यूवी इंजेक्षन.
- एक शीशी में नमक क्षालन (1 मिनट) के बाद और सही प्रोद्धावन टिम पहले नमूना ले लीजिए1 (5'R cdGuo) chromatographic कार्यक्रम के अंत तक न्यूक्लीओसाइड ई.
- नमूना lyophilized और 20 μl पानी में resolubilized.
11. LC-MS/MS मात्रात्मक विश्लेषण
- विश्लेषणात्मक विधि और एमएस डिटेक्टर (ईएसआई) के लिए विधि लोड करके विश्लेषण शुरू करने से पहले तैयार HPLC-MS/MS (ट्रिपल quadrupole) 6.
- समस्थानिक लेबल 7 प्रक्रिया में तैयार नमूना में मिश्रण के यौगिकों 1 μl जोड़ें.
- बालीदार पचा आसुत जल में डीएनए समाधान के 20 μl इंजेक्षन.
- प्राप्त chromatographic डेटा संदर्भ यौगिकों के साथ पिछले अंशांकन के आधार पर सविस्तार हैं. एक प्रतिनिधि HPLC युक्त चलाने adenosine और 2'-deoxyribonucleosides और उनके oxidative और cyclo डेरिवेटिव ग्वानोसिन 11 चित्र में दिखाया गया है.
Representative Results
isomerization प्रक्रिया cholesteryl एस्टर linoleic की मोनो ट्रांस isomers और arachidonic एसिड इस हमले का पहला उत्पाद के रूप में चित्र 1 में दिखाया है, जो मुफ्त कट्टरपंथी तनाव की शर्तों के तहत जैविक वातावरण में हो सकता है affording के लिए विशेष रूप में वर्णित किया गया है 5.
चित्रा 3 रासायनिक तंत्र सीआईएस ट्रांस डबल बांड isomerization में शामिल दिखाया गया है. कट्टरपंथी स्रोत एक सामान्य एस केंद्रित कण वहन रास्ते में संकेत दिया है. वर्णित प्रोटोकॉल में कट्टरपंथी यूवी प्रकाश स्रोत है कि thiol अणु RSH में homolitically एसएच बंधन वर्तमान को तोड़ने में सक्षम है.
चित्रा 4 संशोधित लिपिड और मानव प्लाज्मा में उनकी पहचान वर्ग के संश्लेषण के लिए तीन चरणों का प्रोटोकॉल का सार: संश्लेषण एक biomimetic मुफ्त कट्टरपंथी प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है और यह भी एक एक पॉट सुविधाजनक प्रविष्टि प्रदान करता geometस्थितीय isomers द्वारा किसी भी संदूषण के बिना rical isomers, शोधन और अलगाव प्रोटोकॉल के द्वारा पीछा किया.
कई विश्लेषणात्मक तरीके ट्रांस isomer और मोनो ट्रांस cholesteryl एस्टर पुस्तकालय की सामग्री लक्षण वर्णन के एक उच्च संवेदनशील पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता है. विशेष रूप से, रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी cholesteryl एस्टर अंश पर सीधे बाहर किया जा सकता है बिना derivatization (2 चित्रा और 9 चित्रा देखें).
दूसरा उदाहरण चिंताओं 5 purine ',8-cyclo-2' deoxyribonucleosides, जो डीएनए चीनी आधा भाग की स्थिति 'C5 और चीनी और बेस के बीच एक सहसंयोजक बंधन के बाद गठन करने के लिए मुक्त कण के हमले के द्वारा बनाई गई घावों हैं moieties. चार संरचनाओं का उत्पादन किया जा सकता है, वह यह है कि, 5 - deoxyadenosine ',8-cyclo-2' और 5 ',8-cyclo-2' deoxyguanosine, दोनों 5'R और 5'S diastereomeric (5 चित्रा) रूपों में विद्यमान है. चित्रा 6 में टीवह प्रतिक्रिया तंत्र को दिखाया गया है, कि 8-bromopurine 5 डेरिवेटिव photolysis शामिल करने के लिए इसी C8 6 कट्टरपंथी है, जो intramolecularly C5 'चुनिंदा 2'-deoxyadenosin 5'-YL कट्टरपंथी 7 affording स्थिति से एक हाइड्रोजन परमाणु सार दे. कट्टरपंथी 7 रेंज 10 5 6 -10 -1 एस, 2 की heteroaromatic कट्टरपंथी 8 ऑक्सीकरण के लिए अंतिम उत्पाद 9 दे के द्वारा बाद में एक स्थिर दर के साथ चक्रगति आए. हाइड्रॉक्सिल कण की प्रतिक्रिया, पानी की radiolysis द्वारा उत्पन्न 2'-deoxyadenosine और 2'-deoxyguanosine, (10) ca हो पाए. हाइड्रोजन 'C5 स्थिति से अमूर्त द्वारा 10% 7.
5 purine के पुस्तकालयों के लिए हमारे रासायनिक जीव विज्ञान के दृष्टिकोण ',8-cyclo-2' deoxyribonucleosides (लेबल यौगिकों सहित) 7 चित्रा में सचित्र oligonucleotides में इन घावों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पहचान के साथ डीएनए VA से प्राप्त नमूनों मेंइस तरह के रूप में कुख्यात सूत्रों का कहना है, उदाहरण के लिए, विकिरण की शर्तों के तहत कट्टरपंथी तनाव की स्थिति की नकल का इलाज किया.
8 चित्रा एक ठेठ photoreactor उपकरण दिखाया गया है. इस उपकरण में उपयुक्त विलायक में भंग यौगिकों के विकिरण के लिए अनुमति देता है. यह के होते हैं: i) प्रतिक्रिया अक्रिय गैस (तल पर) और गैस बाहर निकलने के लिए दो inlets और अभिकर्मकों के लिए इसके अलावा इनलेट के साथ सुसज्जित कक्ष, ii) एक आंतरिक उपयुक्त पारा लैंप वाले चैम्बर एक शीतलन प्रणाली से जुड़ा और बिजली, है जो प्रतिक्रिया कक्ष में एक गिलास संयुक्त के माध्यम से डाला जाता है.
चित्रा 1. Cholesteryl linoleate और arachidonate मोनो ट्रांस isomers.
चित्रा 2. रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मोनो ट्रांस isomers के लिए मानव सीरम और प्रत्यक्ष विश्लेषण में Cholesteryl esters.
चित्रा 3. अलावा उन्मूलन प्रक्रिया है कि डबल बांड की thiyl कण द्वारा सीआईएस पार isomerization करने के लिए होता है.
4 के बाहर चित्रा. मोनो ट्रांस मुफ्त कट्टरपंथी तनाव के biomarker के रूप में cholesteryl एस्टर के विकास के लिए तीन चरणों का प्रोटोकॉल.
चित्रा 5. चार 5 purine ',8-cyclo-2' diastereoisomers-deoxyribonucleoside. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
6 चित्रा. C5 के जनरेशन 'कण, या तो 5 की photolysis द्वारा या 10 के HO • कण के साथ प्रतिक्रिया, और 5 purine तंत्र द्वारा' ,8-cyclo-2 deoxyribonucleoside गठन. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 7. प्रोटोकॉल चकुछ कट्टरपंथी आधारित डीएनए घावों की पहचान या; mtDNA: mitochondrial डीएनए, nDNA: परमाणु डीएनए.
8 चित्रा. रसायनिक रिएक्टर.
9 चित्रा. प्लाज्मा cholesteryl एस्टर की प्रतिनिधि रमन cholesteryl linoleate और cholesteryl मोनो ट्रांस linoleic एसिड isomers के साथ एक विशिष्ट क्षेत्र के इनसेट तुलना में स्पेक्ट्रम.
10 चित्रा. प्रसिद्धि के प्रतिनिधि जीसी विश्लेषण प्लाज्मा cholesteryl एस्टर से प्राप्त की.
<मजबूत> 11 चित्रा. प्रतिनिधि HPLC 2'-deoxyadenosine युक्त चलाने के लिए और उनके oxidative और 5 purine के साथ मिलकर ',8-cyclo-2' nucleosides deoxyribo. 2'deoxyguanosine बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
Discussion
स्वाभाविक रूप से ज्यामितीय ट्रांस isomers सीआईएस असंतृप्त वसीय अम्लों घटनेवाला का रूपांतरण एक जैविक वातावरण में कट्टरपंथी तनाव के उत्पादन के साथ जुड़ा हुआ परिवर्तन है. सेल झिल्ली lipids, जो फैटी एसिड होते हैं कट्टरपंथी तनाव के लिए एक प्रासंगिक जैविक लक्ष्य कर रहे हैं और हम पहले सेल संस्कृतियों, जानवरों और इंसानों के प्रत्येक मामले में विश्लेषणात्मक प्रोटोकॉल का आकलन में अंतर्जात सीआईएस ट्रांस phospholipids isomerization का अध्ययन किया. 8-10 हमने दिखा दिया है कि इस परिवर्तन thiols thioethers disulfides, जो विभिन्न कट्टरपंथी तनाव की स्थिति के तहत thiyl कण उत्पन्न करने में सक्षम हैं यानी isomerizing एजेंट (3 चित्रा) सहित एस युक्त यौगिकों की एक किस्म के द्वारा हो सकता है. इस लेख में दिखाए गए उदाहरण cholesteryl एस्टर, जो प्लाज्मा लिपिड की अच्छी तरह से जाना जाता है, एक अंश का प्रतिनिधित्व करते हैं कड़ाई से लेपोप्रोटीन चयापचय में शामिल के वर्ग पर केंद्रित है. फैटी एसिड और चो के बीच एस्टर उठानाlesterol फैटी एसिड का phosphatidylcholine का ग्लिसरॉल आधा भाग के 2 स्थिति से कोलेस्ट्रॉल को हस्तांतरण एक एंजाइम लेसितिण कोलेस्ट्रॉल transferase एसाइल (LCAT) द्वारा उत्प्रेरित कदम द्वारा biosynthesized है. इसलिए, प्लाज्मा cholesteryl एस्टर कड़ाई से झिल्ली लिपिड कारोबार के साथ जुड़े हुए हैं, और पॉलीअनसेचुरेटेड फैटी एसिड (PUFA) आम तौर पर phosphatidylcholines में मौजूद, यानी linoleic और arachidonic एसिड के अपेक्षाकृत उच्च अनुपात होते हैं. लेपोप्रोटीन गठन हृदय और चयापचय रोग में शामिल है. मुक्त कण के साथ प्राकृतिक cholesteryl एस्टर की जेट linoleate के डबल बांड और arachidonate अवशेषों, जो इसी ट्रांस ज्यामितीय isomers में तब्दील किया जा सकता है (चित्रा 1 संरचनाओं के लिए देखें) पर हो सकता है. जैविक नमूने में ट्रांस cholesteryl एस्टर सामग्री की विशेषता biomarker विकास के लिए दिलचस्प है. एक अप्रत्यक्ष पद्धति cholestery के परिवर्तन होते हैंएल esters प्लाज्मा से इसी फैटी एसिड मिथाइल (प्रसिद्धि) esters और गैस chromatographic प्रोटोकॉल से अलग करने के लिए अलग है. इस मामले में, सीआईएस और ट्रांस फैटी एसिड मिथाइल esters के मानक संदर्भ के अंशांकन प्रदर्शन, क्रम में नमूनों में ट्रांस सामग्री की quantitation की अनुमति. विश्लेषणात्मक cholesteryl एस्टर पुस्तकालय पर किए गए अध्ययन के आधार पर, हम भी एक रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी के आधार पर विधि है, कि बाहर किया जा सकता cholesteryl एस्टर से प्लाज्मा अलग अंश पर सीधे लागू करने का प्रस्ताव है, इसी प्रसिद्धि के लिए आगे derivatization बिना (आंकड़े देखें 2 और 9). यह ध्यान देने योग्य बात है कि अब कोई भी सफल तरीके अलग सीआईएस और फैटी एसिड की ट्रांस isomers HPLC द्वारा lipids युक्त, बजाय cholesteryl एस्टर hydroperoxides द्वारा वर्णित वर्णित करने के लायक है. अब तक, अप्रत्यक्ष गैस chromatographic विधि अभी तक का सबसे अच्छा तरीका उपलब्ध है अब तक. इस विधि पहले मात्रात्मक evaluमोनो ट्रांस cholesteryl एस्टर स्वस्थ विषयों के प्लाज्मा से अलग से प्राप्त सामग्री का व्यावहारिक प्रदान किया गया. लौ Ionization (खूंटी) वेक्षक detectability की सीमा का उपयोग करना संतोषजनक है (पीपीबी) और यौगिकों के nanomolar मात्रा में पाया गया है 5. विभिन्न प्रणालियों का पता लगाने के साथ इस सीमा को भी कम किया जा सकता है. cholesteryl एस्टर पर विकिरण के प्रभाव के आगे के अध्ययन के बात है, कि क्या एक रैखिक प्रतिक्रिया लागू खुराक सापेक्ष प्राप्त की है.
एक दूसरा उदाहरण के रूप में, हम जो डीएनए के मुफ्त कट्टरपंथी नुकसान से उत्पादन किया जा सकता है संशोधित nucleosides चुना है. हाइड्रॉक्सिल कण (हो •) के लिए उनके डीएनए के लिए रासायनिक संशोधनों को पैदा करने की क्षमता के लिए सबसे अधिक हानिकारक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) के लिए जाना जाता है. एकल या एकाधिक घावों डीएनए पर होते हैं, हो सकता है कि कोशिकाओं में नाभिक और mitochondria में स्थित है. पहचान और माप oxidative उत्पन्न हर्जाना के मुख्य वर्गों के डीएनए को appropr की आवश्यकता हैक्रम में विश्लेषणात्मक प्रोटोकॉल स्थापित करने के लिए आणविक पुस्तकालयों की देर हो गई. हम छोटी मिलकर घावों, जो 5 purine ',8-cyclo-2' deoxyribonucleosides पर हमारे हित केंद्रित है, आधार और चीनी moieties मुफ्त कट्टरपंथी हमले के द्वारा बनाई गई के बीच एक अतिरिक्त सहसंयोजक बंधन होने. यौगिकों 5 - deoxyadenosine ',8-cyclo-2' और 5 ',8-cyclo-2' deoxyguanosine है 5'R और 5'S diastereomeric रूपों (चित्रा 5) में मौजूदा हैं. उनके लिए मुफ्त कट्टरपंथी तनाव मार्कर बनने की क्षमता मौलिक अनुसंधान की बात है 2. दरअसल, जब डीएनए HO से अवगत कराया है • चीनी का 'C5 स्थिति से कट्टरपंथी हाइड्रोजन अमूर्त संभव मिलकर इन घावों के गठन के लिए प्रमुख घटनाओं में से एक है. Purine 5 ',8-cyclonucleosides enzymatically पचा γ विकिरणित डीएनए नमूनों में 1 से 12 घावों / 10 6 nucleosides / Gy से अलग HPLC-MS/MS द्वारा diastereomers की राशि के रूप में मापा जा सकता है और ऑक्सीजन के मनोवैज्ञानिक स्तर के लिए ऑक्सीजन के रूप अनुपस्थिति जा रहा मैंn ऊतकों, diastereomeric अनुपात 5'R / 5 ~ 4 और 5 के लिए 3 ~ जा रहा है ',8-cdAdo और 5' ,8-cdGuo, क्रमशः (11 चित्रा) 11. यह ध्यान देने योग्य है कि विकिरण खुराक और के बीच के रिश्ते 5 ',8-cdAdo और 5 ,8-cdAdo सेलुलर डीएनए में पाया घावों से दूर समझा जा रहा है. एकल 2kGy विकिरण के आधार पर प्रयोग प्रयोगात्मक में सूचना दी निर्णायक नहीं किया जा माना जा सकता है. 11 इस तरह के और चार घावों के विश्लेषणात्मक quantitation के आगे के प्रयोगों से ऐसे रिश्ते को परिभाषित करने के लिए आवश्यक हैं. इन घावों का पता लगाने और अधिक लोकप्रिय oxidative परिवर्तनों (जैसे 8-oxo-2'-deoxyguanosine, 8-oxodGuo) गहन जांच की बात कर रहे हैं, oxidative चयापचय के दौरान दोनों घावों के महत्व साक्ष्य 6,13 HPLC का उपयोग. -MS/MS (ट्रिपल quadrupole) सभी चार घावों के लिए एक पहचान 30fmol के करीब सीमा होती है. अंतिम सुधार करने के लिए साधन produ द्वारा attomol के स्तर के सीमा का पता लगाने तक पहुंचने का दावा कर रहे हैंसीईआर. बहुत हाल ही में साहित्य के आधार पर, 6 विश्लेषणात्मक प्रक्रियाओं के लिए नमूना और संवर्धन के उचित सफाई शामिल है क्रम में एमएस / एमएस / एमएस (आयन जाल) या एमएस / एमएस (ट्रिपल quadrupole) का पता लगाने के लिए सीमाओं को पूरा करने के लिए है हमारे मामले में.
1-4 यौगिकों के जैव प्रेरित सिंथेटिक प्रक्रियाओं के तहत 8-bromopurine डेरिवेटिव या photolysis से शुरू विकसित किए गए 7,12 इन प्रक्रियाओं के एक कट्टरपंथी प्रतिक्रिया झरना कि 5 के गठन के डीएनए की क्षति तंत्र mimics ',8-cdAdo और 5' शामिल है. ,8-cdGuo घावों. जैविक दृष्टिकोण से, यह पाया गया है कि इन घावों एक ऊतक विशेष ढंग से (जिगर, गुर्दे> मस्तिष्क) में उम्र बढ़ने के साथ जमा, सबूत है कि डीएनए की मरम्मत तंत्र इन घावों से आनुवंशिक सामग्री की रक्षा करने के लिए अपर्याप्त हैं प्रदान 13 दरअसल, nucleotide छांटना मरम्मत (एनईआर) केवल मार्ग वर्तमान में इन घावों की मरम्मत के लिए की पहचान 2.
दो वर्गयौगिकों के तों आंकड़े 1 और 5 में दिखाया पल में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं, हालांकि सिंथेटिक साहित्य में वर्णित रणनीतियों से वाणिज्यिक उपयोग के लिए इन यौगिकों को तैयार करने के लिए मुश्किल नहीं होगा.
इन दोनों क्षेत्रों की रासायनिक जीव विज्ञान के अध्ययन के द्वारा प्रदान की दृष्टिकोण न केवल उपन्यास जैविक वातावरण में होने वाली तंत्र की पहचान में एक बहुत बड़ा मूल्य है, लेकिन यह भी biomarker खोज और निदान के लिए एक मौलिक योगदान देता है, अंत में स्वास्थ्य देखभाल और रोकथाम रणनीति में नवीनता लाने के 14. रासायनिक योगदान आणविक औषधि के सफल विकास के लिए जरूरत है, बनाने एकीकृत प्लेटफार्मों और चयापचय की रूपरेखा के लिए पैनलों जो हस्तक्षेप डिजाइन के एक इष्टतम युक्तिकरण, या तो चिकित्सकीय और पोषण, जब वे उम्मीद के मुताबिक हो सकता है अनिश्चितताओं और विफलताओं को कम करने के लिए अनुमति देने की उम्मीद कर रहे हैं.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
Ministero dell'Istruzione, dell'Universitá डेला Ricerca (Prin 2009K3RH7N_002) और मैरी क्यूरी इंट्रा - - यूरोपीय (CYCLOGUO २९८५५५) फैलोशिप के रूप में के रूप में अच्छी तरह से रासायनिक जीवविज्ञान में 'फ्री रेडिकल्स और लागत कार्रवाई पर लागत CM0603 लड़ाई के प्रायोजन से वित्तीय सहायता CM1201 "Biomimetic कट्टरपंथी कैमिस्ट्री" पर कृतज्ञता से स्वीकार कर रहे हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATERIALS | |||
| Cholesteryl linoleate ≥98% | Sigma-Aldrich | C0289-100 mg | |
| Cholesteryl arachidonate≥95% | Sigma-Aldrich | C8753-25mg | |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250-100 ml | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 34965-1L | |
| Methanol 215 SpS | Romil | H409-2,5 L | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 02860-2.5L | |
| Chloroform SpS | Romil | H135 2,5 L | |
| n-Hexane 95% SpS | Romil | H389 2,5 L | |
| Acetonitrile 230 SpS | Romil | H047 2,5 L | |
| Dichloromethane SpS | Romil | H2022,5 L | |
| Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 107344-1L | |
| Sodium iodide | Sigma-Aldrich | 383112-100G | |
| Sodium hydrogen carbonate | Carlo Erba | 478536-500 g | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 309966-1L | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-5KG | |
| NaOH solid | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
| NH4OH sol. 28%-30% | Sigma-Aldrich | 221228-1L-A | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099-500ML | |
| Ammonium Cerium(IV)sulfate dihydride | Sigma-Aldrich | 221759-100G | |
| Ammonium Molybdate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | A7302-100G | |
| Sulfuric Acid 95%-98% | Sigma-Aldrich | 320501-1L | |
| Silver Nitrate | Sigma-Aldrich | 209139-25G | |
| Sodium sulfate anhydrous | Sigma-Aldrich | 238597-500G | |
| Nuclease P-I from penicillium citrinum | Sigma-Aldrich | N8630-1VL | |
| Phosphodiesterase II type I-sa | Sigma-Aldrich | P9041-10UN | |
| Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine, hc | Sigma-Aldrich | E114-25MG | |
| Phosphatase alkaline type VII-t from*bov | Sigma-Aldrich | P6774-1KU | |
| Phosphodiesterase I type VI | Sigma-Aldrich | P3134-100MG | |
| Deoxyribonuclease II type IV from*porcin | Sigma-Aldrich | D4138-20KU | |
| Trizma(r) base, biotechnology performanc ce | Sigma-Aldrich | T6066-100G | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E1644-100G | |
| Succinic acid bioxtra | Sigma-Aldrich | S3674-250G | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670-100G | |
| Formic acid, 98 % | Sigma-Aldrich | 06440-100ML | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane | Millipore | UFC500324 | |
| 8-Bromo-2'-deoxyguanosine | Berry Associates | PR3290-1 g | |
| 8-Bromo-2'-deoxyadenosine | Berry Associates | PR3300-1 g | |
| Sodium iodide | Sigma-Aldrich | 383112-100G | |
| Sodium hydrogen carbonate | Carlo Erba | 478536-500 g | |
| 2'-deoxyguanosine:H2O (U-15N5, 96-98%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc | CILNLM-3899-CA-0.1 | |
| 2'-deoxyadenosine (U-15N5, 98%) 95%+ CHEMICAL PURITY | Cambridge Isotope Laboratories, Inc | CILNLM-3895-0.1 | |
| Nitrous oxide (N2O) | Air Liquide | ||
| Deoxyribonucleic acid from calf thymus | Sigma Aldrich | D4522-5MG | |
| EQUIPMENT | |||
| 60Co-Gammacell | AECL- Canada | 220 | |
| Immersion well reaction medium pressure 125 watts | Photochemical reactors ltd | Model 3010 | |
| Evaporating flask 250 ml | Heidolph | P/N NS 29/32 514-72000-00 | |
| Luna 5 μm C18(2) 100 Å, LC Column 250 x 4.6 mm | Phenomenex | 00A-4252-E0 | |
| Alltima C8 Column 250 x 10 mm 5 μm | Grace | 88081 | Semipreparative |
| SecurityGuard Kit | Phenomenex | KJ0-4282 | Analytical holder kit and accessories |
| Holder for 10.0 mm ID cartridges | Phenomenex | AJ0-7220 | Semipreparative holder |
| 10.0 mm ID cartridges | Phenomenex | AJ0-7221 | |
| High-performance liquid chromatography (HPLC) | Agilent | 1100 | |
| LC/MS/MS | Applied Biosystems | 4000QTRAP System | |
| Tandem mass ESI spectrometer | (Bruker Daltonics) | Esquire 3000 plus | |
| Vial 2-4 ml | SUPELCO | Cod 27516 | |
| Vial 4 ml | SUPELCO | Cod 27517 | |
References
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