Frie radikaler i Chemical Biology: fra Kjemisk Behavior til utvikling av biomarkører

Summary

Radikal-baserte biomimetic kjemi har blitt brukt til oppbygging biblioteker som er nødvendig for utvikling av biomarkører.

Abstract

Involvering av frie radikaler i biovitenskap har stadig økt med tiden og har blitt koblet til flere fysiologiske og patologiske prosesser. Dette emnet omfatter ulike fagområder som spenner fra fysiske, biologiske og bioorganic kjemi til biologi og medisin, med søknader til forbedring av livskvalitet, helse og aldring. Tverrfaglig kompetanse er nødvendig for full undersøkelse av de mange fasetter av radikale prosesser i den biologiske miljøet og kjemisk kunnskap spiller en avgjørende rolle i avdukingen grunnleggende prosesser og mekanismer. Vi utviklet en kjemisk biologi tilnærming kunne koble frie radikaler kjemisk reaktivitet med biologiske prosesser, og gir informasjon om de mekanistiske trasé og produkter. Kjernen i denne tilnærmingen er utformingen av biomimetic modeller for å studere biomolecule atferd (lipider, nukleinsyrer og proteiner) i vandige systemer, skaffe innsikt i reaksjonsveier samt ens oppbygging molekylære bibliotek av den frie radikale reaksjonsprodukter. Denne sammenheng kan med hell brukes til biomarkører og eksempler er gitt med to klasser av forbindelser: mono-trans isomerer av kolesteryl estere, som er syntetisert og brukt som referanser for påvisning i humant plasma, og purin 5 ',8-cyclo-2 '-deoxyribonucleosides, forberedes og brukes som referanse i protokollen for påvisning av slike lesjoner i DNA-prøver, etter ioniserende stråling eller hentes fra ulike helsemessige forhold.

Introduction

Reaktiviteten av frie radikaler avslørte sin enorme betydning for mange biologiske hendelser, inkludert aldring og betennelser. I dag er det mer og mer tydelig at avklaring av hvert kjemisk trinn er involvert i denne reaktivitet er nødvendig, for å forstå de underliggende mekanismene og ser for effektive strategier for kontroll av frie radikaler og reparasjon av skaden. Bidraget fra kjemiske studier er grunnleggende, men den direkte studie i det biologiske miljøet kan være vanskelig, siden overlagring av ulike prosesser kompliserer og perturbs undersøkelse av resultatene og de relaterte konklusjoner. Derfor har strategien modellering frie radikaler reaksjoner i henhold biologisk relaterte forholdene blir et grunnleggende skritt i forskningen av kjemiske mekanismene i biologi.

I det siste tiåret vår gruppe utviklet modeller av frie radikaler prosesser under biomimetic forhold. Spesielt no vivisaged biologisk relevante transformasjoner av umettede fettsyrer, nucleosides, og svovelholdige aminosyrer og sette dem i sporet til å bli vurdert og godkjent som biomarkører for helsestatus. ^1-4

Vårt generelle tilnærming består av tre moduler:

• Organisk syntese, som gir tilgang til riktig modifiserte biomolekyler. Den syntetiske plan kan også utformes for å simulere den frie radikale prosesser i det biologiske miljøet, og dermed anvende betingelser i stand til å simulere den biologiske prosessen av interesse, som er prinsippet biomimetic radikal kjemi. I biomimetic modeller reaksjonsmediet er vann eller en heterogen medium grunnet sameksistens av hydrofile og hydrofobe segmenter. Fordel å arbeide med biomimetic modeller er å ha en forenklet miljø med kjente stoffer som reagerer, hvor reaktivitet og produktene kan bli undersøkt i flere detaljer, muligens oppdagenye kjemiske trasé. Fra dette trinnet mekanistiske og kinetisk informasjon kan samles;
• Rensing, analyse og karakterisering av produktene, noe som gir strukturell og kjemisk informasjon av de modifiserte biomolekyler for å organisere molekylære bibliotek og lette recognition.in de mer komplekse biologiske miljø. Protokoller etableres også i lys av løse komplekse blandinger av forbindelser som de som stammer fra biologiske prøver;
• Utvikling av biomarkører ved hjelp av biologiske prøver, avledet enten ved in vitro eksperimenter med cellekulturer, og in vivo studier fra dyr og mennesker. Protokollene utviklet i biomimetic modeller er deretter brukt til komplekse analyser av prøver å se for seg den frie radikale transformasjoner under forskjellige forhold. Molekylære bibliotek utviklet av syntese er av enorm hjelp til life science funn. Informasjonen som samles inn på frie radikaler transformasjoner GIVe muligheten til å finne ut reparasjon og forebyggende strategier. Databaser over resultatene kan brukes for en nøye vurdering av multivariat analyse av biomarkører betydning samt mulig assosierte faktorer.

Vi valgte to klasser av relevante biomarkører for å akkreditere denne tilnærmingen: kolesteryl estere og purin 5 ',8-cyclo-2'-deoxyribonucleosides.

Protocol

1. Syntese av Mono-trans isomerer kolesteryl estere

1. Oppløs kolesteryl estere (linoleat eller arachidonate kolesteryl ester) i 2-propanol (15 mM). For en bedre solubilisering ble prøvene sonikert i 15 minutter under argon.
2. Overfør løsningen til et kvarts fotokjemisk reaktor, tilsett 2-merkaptoetanol i 2-propanol (for å nå 7 mM konsentrasjon, fra en 2 M stamløsning av tiolen). Skyll reaksjonsblandingen med argon i 20 minutter for å eliminere tilstedeværelsen av oksygen i oppløsningen.
3. Irradiate reaksjonsblandingen ved UV-lys ved hjelp av en 5,5 W lavtrykks kvikksølvlampe ved 22 ± 2 ° C i 4 min. Overvåk ved analytisk Ag-TLC (sølv-tynnsjiktskromatografi) til bevis dannelsen av mono-trans kolesteryl estere (se figur 1 for den kjemiske formler). TLC farging utføres ved å helle platen i cerium ammonium molibdate (CAM) løsning og flekker på oppvarmingplate. Stoppe reaksjonen på et tidlig stadium, for å gjenopprette utgangsmaterialet, som kan brukes om igjen til å utføre andre runder isomerisering, skaffe en økning av det totale utbytte.
4. Samle reaksjonsblandingen i en rundkolbe, vasking anordningen med noen ml av 2-propanol. Fjern løsningsmidlet og rense de mono-trans isomerer av kolesteryl estere av AG-TLC som beskrevet i litteraturen. ⁵ Bruk heksan-dietyleter (9:1 v / v) som elueringsmiddel for mono-trans kolesteryl linoleat isomerer, mens bruk heksan -dietyleter-eddiksyre (9:1:0,1 v / v) for mono-trans kolesteryl arachidonate isomerene.

2. Isolering av Cholesteryl estere Andel fra Human Serum

1. Fortynn en ml humant serum (erholdt ved sentrifugering av blod) med 1 ml saltoppløsning og helle løsningen i en skilletrakt under en strøm av argon for å unngå gjenstander (f.eks oksidering addukter). Tilsett 10 ml kloroform-metanol (2: 1 v / v) tre ganger. Rist skilletrakten meget langsomt for å begrense dannelsen av emulsjonen på grunn av tilstedeværelsen av albumin.
2. Vask de organiske lagene en gang med saltvann (10 ml), og samle det i en Erlenmeyer kolbe under en argonstrøm, tørk over vannfritt natriumsulfat. Fjern flyktige etter rotasjonsfordamper for å gi en gul olje (totalt plasma lipidfraksjonen).
3. Ta opp det urene med 1 ml kloroform-metanol (2:1 v / v), lastes på en preparativ TLC under en strøm av argon og bruke en blanding av heksan-dietyleter (9:1 v / v) som elueringsmiddel . Skrape av silika delen inneholder kolesteryl ester brøk og hell i et hetteglass. Deretter pakker silika (3 x 5 ml) med kloroform-metanol (2:1 v / v), samle de organiske lag og fjerne løsningsmidlet etter inndampning til å gi den rene fraksjon av kolesteryl estere (vanligvis ~ 1,5 mg).
4. Hold kolesteryl estere i en mørk hetteglass dekket av aluminiumsfolie under argon og oppbevar ved -20 ° C. Kolesteryl esters er følsomme for lys og oksygen.

3. Karakterisering av Mono-trans kolesteryl estere etter Raman spektroskopi

1. Utdrag kolesteryl estere fra humant serum (≥ 0,7 mg) som beskrevet i kapittel 2, oppløses i en liten mengde karbontetraklorid (≤ 10 pl) og plasser i et hetteglass. CCl ₄ er valgt som løsningsmiddel fordi dens Raman signal ikke overlapper med regionen av interesse av kolesteryl ester analyse.
2. Overfør løsningen til prøveholderen gjennom en engangs glass pipette deretter forsiktig fjerne løsningsmidlet ved en langsom strøm av argon. Når en ensartet fet film er dannet på den indre vegg av prøveholderen, plasserer det sistnevnte i instrumentet for måling.
3. Fourier Transformed Raman spekter av kolesteryl estere er direkte hentet på lipid ekstrakter uten derivatisering reaksjon. Lasereffekten på prøven er <100 mW til unngå prøven skade. Det totale antall skanningerfor hvert spektrum er ≥ 800 å minimere bakgrunnsstøy.
4. Den 1,700-1,630 cm ^-1 rekkevidde Raman spektrum analyseres siden det gjenspeiler bidraget fra C = C dobbeltbindinger tilstede i molekylet (C = C strekking modus). En kurvetilpasning Analysen er utført på dette området, og dermed gir skille av de superponerte bidrag fra cis-og trans-dobbeltbindinger i fettstoffer alkylkjede og dobbeltbindingen i ring B i kolesterol (se Figur 2).
5. Slik at den passer de vibrasjonelle band, bør noen parametere være fast eller begrenset innenfor rimelighetens grenser. Komponenten peak profilene er beskrevet som en lineær kombinasjon av Lorentzian og Gaussian funksjoner, mens halv høyde båndbredder er best bestemmes av datamaskinen optimalisering rutinen. Antallet og plasseringen av komponentene toppene oppnås ved hjelp av fjerde deriverte spektra, som tillater å oppdage også noen svake komponent band. Siden signaletstøyforhold som forverres ved differensiering av signalet kan utelukke bruken av fjerde derivatet, glattet fjerde derivater med en tretten-punkts Savitsky-Golay funksjon, er av fordel, derfor er en rett kompromiss mellom oppløsning og signal til støyforhold oppnås . Best kurvetilpasning oppnås til lavest mulig c ² verdier.
6. Tilstedeværelsen av transisomerene er åpenbart av komponenten på 1671 ± 1 cm ^-1, i tillegg til, i det minste, to komponenter, litt forskjøvet mot lavere frekvenser, på grunn av den fettsyrekjeden og kolesterol C = C dobbeltbindinger. Representativt Raman spektrum av plasma kolesteryl ester er vist i figur 9. I det innfelte sammenligningen av en bestemt region med kolesteryl linoleat og mono-trans kolesteryl linolsyre isomerer er vist.

4. Derivatisering til Fettsyremetylestere (FAME) og analyse av gasskromatografi

1. Oppløsekolesteryl estere (~ 1,5 mg) med 0,5 ml av en 1 M oppløsning av natrium-hydroksyd i benzen-metanol (2:3 v / v) og plasser i en mørk hetteglass dekket av aluminiumsfolie under argon.
2. La blandingen omrøring ved romtemperatur og monitor ved TLC med en blanding av heksan-dietyleter (9:1 v / v) som elueringsmiddel. Reaksjonstiden er vanligvis 30 minutter, men en omhyggelig reaksjon overvåking er nødvendig. Faktisk, når de tilsvarende metylestere dannes, må reaksjonen bråkjølt for å unngå dannelse av nedbrytningsprodukter og side-produkter. TLC viste kvantitativ dannelse av metylestere.
3. Slukke reaksjonsblandingen ved tilsetning av 1 ml saltoppløsning og ekstraher metylestere med n-heksan (3 x 2 ml). Samle de organiske lagene inn i et hetteglass og fjerne løsningsmidlet ved rotasjonsinndamping for å gi metylesteren fraksjon, som deretter brukes for GC analyse uten ytterligere rensing.
4. Oppløse metylesterne i minimum mengde av n-heksan (vanligvis 1 mg i 50 ul) og injiser i GC utstyrt med en 60 m x 0,25 mm x 0,25 mikrometer (50%-cyanopropyl)-methylpolysiloxane kolonnen. Bruk en flamme ionisering detektor (FID) med følgende ovn program: temperatur starter ved 165 ° C, hold i 3 minutter, etterfulgt av økning av 1 ° C / min opp til 195 ° C, holder i 40 minutter, etterfulgt av en andre økning på 10 ° C / min opp til 240 ° C, og hold i 10 min. En konstant overtrykk (29 psi) er valgt. Helium eller hydrogen kan brukes som bæregass. Metylestere identifiseres ved sammenligning med retensjonstidene for autentiske prøver. Fig. 10 viser et representativt GC analyse av FAME oppnådd fra plasma kolesteryl estere.

5. Syntese av (5'R) - og (5'S) -5 ',8-cyclo-2'-deoksyadenosin

1. Oppløs 33 mg av 8-brom-2'-deoksyadenosin (8-Br-Dado) i acetonitril (100 ml) for å nå en mM konsentrasjon. Regulere gasstrømmen (Ar eller N2) i photoreactor og fyll Apparatus med løsningen av 8-Br-Dado.
2. Forbered et septum med riktig størrelse for photoreactor innspill og passere en nål koblet til den inerte gass linje gjennom midten av den. Lukk systemet med septum. Skyll inertgass for 30 min.
3. Irradiate ved UV lys ved hjelp av en 125W middels trykk kvikksølvlampe ved 22 ± 2 ° C i 15 min, samle oppløsningen i en 250 ml rundbunnet kolbe. Vask photoreactor med 10 ml acetonitril og samle skyllevæsken i samme kolbe.
4. Slukke urene reaksjonsblandingen med 1 M NH ₄ OH-løsning og fordamp løsningsmidlet i rotasjonsfordamperen.
5. Kjør høyytelses væskekromatografisk analyse (HPLC-UV) med analytisk kolonne (se instrumentering seksjon) under kjente betingelser, og sammenligne profilen med referanseforbindelser.
6. Kjør høyytelses væskekromatografisk analyse (HPLC-UV) med en analytisk kolonne (se instrumentering seksjon) ved hjelp av følgende solåpninger og graderinger: 2 mM ammoniumformiat som oppløsningsmiddel A og acetonitril som oppløsningsmiddel B. Innstill infusjonshastigheten til 1 ml / min og gradient fra 0% løsningsmiddel B til 0,3% løsningsmiddel B for å bli nådd i 2,2 min. Deretter 0,8% løsningsmiddel B i i 4,0 min, og deretter 1% løsningsmiddel B i 4,8 min. Liggende på 1% løsemiddel B for 9 min og deretter gå til 8% løsemiddel B i 6 min. Etter gå til 10% løsningsmiddel B i 4 min og til 30% løsningsmiddel B i 5 min og forbli på 30% oppløsningsmiddel B for andre 5 min. Samle de kromatografiske topper som tilsvarer de to diastereomere produkter i to forskjellige ampuller.
7. Måle absorbansen til to innsamlede fraksjoner i UV spektrofotometer og beregne den nøyaktige konsentrasjon basert på Lamber-Beer loven (A = εlC, hvor A er absorbans, ε utryddelse koeffisient og l lengden av cellen). Bruk ekstinksjonskoeffisient ε av 2'-deoksyadenosin (Dado) (15 400 M ^-1 cm ^-1 ved 260 nm).

6. Syntese av (5'R) - end (5'S) -5 ',8-cyclo-2'-deoxyguanosine

1. Oppløs 35 mg av 8-brom-2'-deoxyguanosine (8-Br-dGuo) og 30 mg natriumjodid (NaI) i destillert vann (100 ml) for å nå 1 mM og 2 mM konsentrasjon, henholdsvis. Reguler inertgass (Ar eller N ₂₎ strømning koblet til photoreactor og fylle photoreactor med reaksjonsløsningen.
2. Degass reaksjonsblandingen som beskrevet i prosedyre 5 (trinn b).
3. Irradiate ved UV lys ved hjelp av en 125W middels trykk kvikksølvlampe ved 22 ± 2 ° C i 30 min, samle oppløsningen i en 250 ml rundbunnet kolbe. Vask photoreactor med 10 ml vann og samle skyllevæsken i samme kolbe.
4. Slukke urene reaksjonsblandingen med 1 M NH ₄ OH-løsning og fordamp løsningsmidlet under vakuum.
5. Utføre analyser som beskrevet i prosedyre 5 (trinn E til G). Bruk ekstinksjonskoeffisient ε av 2'-deoxyguanosine (dGuo) (11 700 M ^-1 cm ^-1 ved 260 nm).

7. Syntese av isotopisk Merkede Purine (5'R) - og (5'S) -5 ',8-cyclonucleosides

1. Forbered 2 ml 1 mM vandig løsning (destillert vann) av de ¹⁵ N isotopisk merkede purinnukleosider ([15N ^5] DADO eller [15N ^5] dGuo) i et hetteglass (4 ml) med en septum cap.
2. Koble hetteglasset med septum hetten og koble til gassledningen (N ₂ O for metning av løsningen) gjennom en nål i septum som når bunnen av ampullen. Et annet kort nål i septum cap fungerer som gass exit.
3. Skyll løsningen med N ₂ O i 30 minutter. Gasstrømmen reguleres for å være svært lav.
4. Avkjøringen nålen er først tatt ut og etter en 'lang en følger, for å ha en liten trykk inne i ampullen.
5. Sette løsningen i anordningen av gamma radiolyse for 8 timers (beregning på grunnlag av en dosehastighet ca. 4,5 Gy / min).
6. Etter reaksjon slukke urene med 1 M NH ₄
7. Kjør høyytelses væskekromatografisk analyse (HPLC-UV) under kjente betingelser, ⁶ og sammenligne kromatogrammet med standard referanser.

8. Gamma radiolyse av DNA vannløsninger

1. Forbered 1 ml av 0,5 mg / ml oppløsning (destillert vann) av kalvethymus DNA og satt i et hetteglass (2 ml) med en septum cap.
2. Degass reaksjonen som beskrevet i Fremgangsmåte 7 (trinn BD).
3. Sette løsningen i anordningen av gamma radiolyse i 30 min (beregning på grunnlag av dose / sats ca. 4,5 Gy / min).

9. Enzymatisk nedbrytning av DNA

1. Til en Eppendorf rør som inneholder 80 ug DNA, legg 8 U av nuklease P1, 0,01 U av fosfodiesterase II, 20 nmol av EHNA i 20 pl av 300 mM natriumacetat (pH 5,6) og 10 mM sink-klorid. Inkuber blandingen ved 37 ° C i 48 timer.
2. Deretter tilsettes en blanding av 8 U av alkalisk fosfatase, 0,02 U av phosphodiesterase I, i 40 pl av 0,5 M Tris-HCl-buffer (pH 8.9) til blandingen fordøyelsen. Prøven inkuberes ved 37 ° C i 2 timer.
3. Blandingen nøytraliseres ved tilsetning av 10% maursyre.
4. Overfør prøven til en Amicon Ultra-0.5 sentrifugalfilter enhet (cutoff 3 kDa), tilsett 200 ul tridistilled H ₂ O. Plasser Ultra-filteret i sentrifugerotor ved 14.000 xg i 15 min. Deretter skille Ultra filter enheten fra mikrosentrifugerør. Lyophilize det enzym-fri løsning i mikrosentrifugerør.

10. DNA-prøven desalinization før analyse

1. Kjør høyytelses væskekromatografisk analyse (HPLC-UV) med analytisk kolonne (se instrumentering seksjon) etter kjente forhold. ⁶
2. Oppløs den lyofiliserte fordøyd DNA i 20 pl av _H2O og injiser i HPLC-UV.
3. Samle prøven i hetteglass etter at saltet eluering (første minutter) og rett før elueringen time av første nukleosid (5'R-cdGuo), helt til slutten av den kromatografiske programmet.
4. Prøven er lyofilisert og resolubilized i 20 ul vann.

11. LC-MS/MS Kvantitativ analyse

1. Forbered HPLC-MS/MS (trippel kvadrupol) før du starter analysen ved å laste den analytiske metoden og metoden for MS detektor (ESI). ⁶
2. Tilsett 1 pl av den isotopiske merkede forbindelser blandingen i prøven fremstilt i Prosedyre 7.
3. Injiser 20fil spiked fordøyd DNA løsning i destillert vann.
4. De oppnådde data er kromatografiske utdypet grunnlag av tidligere kalibrering med referanseforbindelser. Et representativt HPLC kjøre inneholdende adenosin og guanosin 2'-deoxyribonucleosides og deres oksidative og cyclo derivater er vist i figur 11.

Representative Results

Isomeriseringen prosessen har blitt beskrevet spesielt for kolesteryl estere affording mono-trans isomerer av linolsyre og arachidonic syrer vist i figur 1 som de første produktene av dette angrepet, som kan oppstå under betingelser med frie radikaler stress i det biologiske miljøet. ⁵

I figur 3 den kjemiske mekanisme som er involvert i den cis-trans dobbeltbinding isomerisering vises. Den radikale kilden er angitt i en generisk måte å gi S-sentrerte radikaler. I de beskrevne protokoller radikale kilden er UV-lys som er i stand til å bryte homolitically SH bindingen stede i tiolen molekylet RSH.

Figur 4 oppsummerer de tre trinnene protokoll for syntese av den modifiserte lipid klasse og deres påvisning i humanplasma: syntesen representerer et biomimetic fri radikal prosess og gir også en en-potten praktisk oppføring til geometrisk isomerer, uten forurensning av posisjonelle isomerer etterfulgt av rensing og isolasjon protokoller.

Flere analytiske metoder kan brukes for en høy følsom påvisning av trans isomeren innholdet og karakterisering av de mono-trans kolesteryl ester biblioteket. Spesielt kan Raman spektroskopi utføres direkte på kolesteryl ester fraksjonen uten derivatisering (se figur 2 og figur 9).

Det andre eksemplet gjelder purin 5 ',8-cyclo-2'-deoxyribonucleosides, som er DNA lesjoner skapt av angrep av frie radikaler til stillingen C5 'av sukkerresten og påfølgende dannelse av en kovalent binding mellom sukker og base molekyldeler. Fire strukturer kan produseres, er det, 5 ',8-cyclo-2'-deoksyadenosin og 5 ',8-cyclo-2'-deoxyguanosine, både eksisterende i 5'R og 5'S diastereomere former (figur 5). I figur 6 than reaksjonsmekanisme vises, innebærer at fotolyse av 8-bromopurine derivater 5 å gi de tilsvarende C8 6 radikal, som intramolekylært abstracts en hydrogenatom fra C5 'posisjonen selektivt affording 2'-deoxyadenosin-5'-yl-resten 7. Radikal 7 gjennomgår cyklisering med en rate konstant i området 10 ⁵ -10 ^{6 -1} s, ² etterfulgt av oksydasjon av den heteroaromatiske radikal 8 å gi sluttproduktene ^9. Omsetningen av hydroksylradikaler, generert av radiolyse av vann, med 2'-deoksyadenosin og 2'-deoxyguanosine (10) ble funnet å oppstå ca. 10% av hydrogen abstraksjon fra C5 'stilling. ⁷

Vår kjemiske biologi tilnærming for bibliotekene av purin 5 ',8-cyclo-2'-deoxyribonucleosides (inkludert merkede forbindelser) er illustrert i figur 7, med identifikasjon av disse lesjoner i oligonukleotider samt i DNA-prøver oppnådd fra various kilder som, for eksempel, behandlet under ioniserende stråling betingelser, som etterligner av radikale stressbetingelser.

I figur 8 et typisk photoreactor utstyret vises. Enheten tillater bestråling av forbindelser oppløst i passende oppløsningsmiddel. Den består av: i) reaksjonskammeret utstyrt med innløpet for den inerte gass (på bunnen) og to innganger for gassen utkjørselen og for reagenser tillegg, ii) et indre kammer som inneholder den riktige kvikksølvlampe koblet til et kjølesystem og elektrisk kraft, som er satt inn i reaksjonskammeret gjennom et glass felles.

Figur 1. Mono-trans isomerer av kolesteryl linoleate og arachidonate.

Figur 2. Kolesteryl estere i humant serum og direkte analyse for mono-trans isomerer etter Raman spektroskopi.

Figur 3. Tillegg-eliminering prosess som fører til cis-trans isomerisering av dobbeltbindinger ved thiyl radikaler.

Figur 4. Tre trinn protokoll for utvikling av mono-trans kolesteryl estere som biomarkør av frie radikaler stress.

Figur 5. De fire purine 5 ',8-cyclo-2'-deoxyribonucleoside diastereoisomerer. Klikk her for å se større figur .

Figur 6. Generering av C5 'radikaler, enten ved fotolyse av 5 eller ved omsetning av 10 med HO • radikaler, og mekanismen av purin 5' ,8-cyclo-2 'deoxyribonucleoside formasjon. Klikk her for å vise større figur .

Figur 7. Protokoll feller identifikasjon av noen radikal-baserte DNA lesjoner; mtDNA: mitokondrie-DNA, nDNA: kjerne-DNA.

Figur 8. Fotokjemisk reaktoren.

Figur 9. Representativt Raman spektrum av plasma kolesteryl ester. I det innfelte sammenligningen av en bestemt region med kolesteryl linoleat og kolesteryl mono-trans linolsyre isomerene.

Figur 10. Representant GC analyse av FAME innhentet fra plasma kolesteryl estere.

<strong> Figur 11. Representant HPLC kjøre inneholder 2'-deoksyadenosin og 2'deoxyguanosine sammen med sin oksidative og purine 5 ',8-cyclo-2'-deoxyribo nukleosider. Klikk her for å se større figur .

Discussion

Omdannelsen av naturlig forekommende cis umettede fettsyrer til geometrisk transisomerene er en transformasjon forbundet med produksjon av radikale stress i det biologiske miljøet. Cell membranlipider, som inneholder fettsyrer, er en relevant biologisk mål for radikal stress og studerte vi først den endogene cis-trans fosfolipider isomerisering i cellekulturer, dyr og mennesker som vurderer analytiske protokoller i hvert tilfelle. ^8-10 Vi demonstrerte at denne transformasjonen kan oppstå ved en rekke S-holdige forbindelser, inkludert tioler, tioetere og disulfides, som under forskjellige radikale stressbetingelser er i stand til å generere thiyl radikaler, dvs. isomerisering agent (Figur 3). Eksempelet vist i denne artikkelen fokuserer på klassen av kolesteryl estere, som representerer en velkjent fraksjon av plasma lipider, strengt involvert i lipoprotein metabolismen. Ester kobling mellom fettsyrer og cholesterol er biosynthesized ved overføring av fettsyrer fra stillingen 2 av glyserol moiety av fosfatidylcholin til kolesterol, et skritt katalysert av enzymet lecitin kolesterol acyl transferase (LCAT). Derfor er plasma kolesteryl estere strengt forbundet med membran lipid omsetning, og inneholder relativt høye andeler av de flerumettede fettsyrer (PUFA) som typisk er tilstede i fosfatidylcholiner, dvs. linolsyre og arachidonic syrer. Lipoprotein formasjonen er involvert i hjerte-og metabolske sykdommer. Reaktiviteten av naturlige kolesteryl estere med frie radikaler kan oppstå på dobbeltbindinger av linoleat og arachidonate rester, som kan omdannes i den tilsvarende trans geometriske isomere (se Figur 1 for strukturer). Karakterisering av den trans kolesteryl esterinnhold i biologiske prøver er interessant for utvikling av biomarkører. En indirekte metodikk består av transformasjonen av cholesteryl estere isolert fra plasma til de tilsvarende fettsyremetylestere (FAME) og separasjon ved gasskromatografisk protokoller. I dette tilfellet, er kalibreringen av standard referanser av cis-og trans-fettsyremetylestere utført, for å tillate kvantitering av trans innholdet i prøvene. Basert på de analytiske studier utført på kolesteryl ester biblioteket foreslo vi å anvende også en metode basert på Raman spektroskopi, som kan utføres direkte på kolesteryl ester fraksjonen isolert fra plasma, uten ytterligere derivatisering til tilsvarende FAME (se figurene 2 og 9). Det er verdt å merke seg at inntil nå ingen vellykkede metoder er beskrevet for å skille cis-og trans-isomerene av fettsyrer som inneholder lipider ved HPLC, som i stedet beskrevet av kolesteryl ester hydroperoksider. Så langt er den indirekte gasskromatografisk metode fortsatt den beste tilgjengelige metoden så langt. Ved denne metoden første kvantitative evaluasjon av de mono-trans innhold avledet fra kolesteryl estere isolert fra plasma av friske personer ble levert. Bruke Flame Ionisering Detector (FID) grensen for oppdagbarheten tilfredsstillende (ppb) og nanomolare mengder av forbindelsene er blitt påvist. ^5. Med ulike sporingssystemer denne grensen kan bli enda lavere. Effekten av ioniserende stråling på kolesteryl estere er spørsmål videre studier, enten en lineær respons oppnås i forhold til den påførte dose.

Som et annet eksempel, valgte vi modifiserte nukleosider som kan produseres av fri radikal skade av DNA. Hydroksylradikaler (HO •) er kjent for å være de mest skadelige reaktive oksygen arter (ROS) for deres evne til å forårsake kjemiske modifikasjoner til DNA. Én eller flere lesjoner kan oppstå på DNA, som i eukaryote celler er plassert i kjernen, og mitokondrier. Identifisering og måling av de viktigste klasser av oksidative genererte skader DNA krever approprIate molekylære bibliotek for å sette opp den analytiske protokoller. Vi fokuserte vår interesse på de minste tandem lesjoner, som er purine 5 ',8-cyclo-2'-deoxyribonucleosides, har en ekstra kovalent binding mellom basen og sukker enheter skapt av frie radikaler angrep. Forbindelsene er 5 ',8-cyclo-2'-deoksyadenosin og 5 ',8-cyclo-2'-deoxyguanosine eksisterende i 5'R og 5'S diastereomere former (figur 5). Deres potensial til å bli friradikal stresset markør er spørsmål grunnleggende forskning. ² Faktisk, når DNA utsettes for HO • radikal hydrogen abstraksjon fra C5 'posisjon av sukkeret er en av de mulige hendelser som fører til dannelsen av disse tandem lesjoner. Purin 5 ',8-cyclonucleosides kan måles som sum av diastereomerer etter HPLC-MS/MS i enzymatisk fordøyd γ-bestrålte DNA-prøver varierende 1-12 lesjoner / 10 ⁶ nukleosider / Gy går formen fravær av oksygen til fysiologisk nivå av oksygen jegn vev, det diastereomere ratio 5'R / 5'S blir ~ 4 og ~ 3 for 5 ',8-cdAdo og 5' ,8-cdGuo, henholdsvis (Figur 11). ^11. Det er verdt å merke seg at forholdet mellom stråledose og 5 ',8-cdAdo og 5' ,8-cdAdo lesjoner oppdaget i mobilnettet DNA er langt fra å bli forstått. Den enkelt eksperiment basert på 2kGy bestråling rapportert i den eksperimentelle kan ikke betraktes avgjørende. ¹¹ Videre forsøk av denne type og analytisk kvantifisering av fire lesjoner er nødvendig for å definere slik forholdet. Detekteringen av disse lesjonene og de ​​mer populære oksidative transformasjoner (eksempel 8-okso-2'-deoxyguanosine, 8-oxodGuo) er noen intense undersøkelser, beviser viktigheten av både lesjoner under oksidativ metabolisme. ^6,13 Bruken av HPLC -MS/MS (trippel kvadrupol) har en deteksjonsgrense nær 30fmol for alle fire lesjoner. Siste forbedringer hevdet å nå deteksjonsgrenser av attomol nivåer av instrumentet proCER. Basert på den aller siste litteraturen, ⁶ analytiske prosedyrer må inkludere riktig opprydding av prøven og berikelse for å møte påvisningsgrensene for MS / MS / MS (ion felle) eller MS / MS (trippel kvadrupol) brukt i vårt tilfelle.

Bio-inspirerte syntetiske prosedyrer av forbindelser 1-4 ble utviklet fra 8-bromopurine derivater under eller Fotolyse. ^7,12 Disse prosedyrene innebære en radikal kaskade reaksjon som etterligner DNA skade mekanismen for dannelse av 5 ',8-cdAdo og 5' ,8-cdGuo lesjoner. Fra biologiske perspektiver, ble det funnet at disse lesjoner akkumuleres med aldring i en vev-spesifikk måte (lever> nyre> hjernen), som gir bevis for at DNA-reparasjon mekanismer er utilstrekkelig for å bevare det genetiske materialet fra disse lesjoner. ¹³ Ja, nukleotid excision reparasjon (NER) er den eneste veien for tiden identifisert for reparasjon av disse lesjonene. ²

De to klassees av forbindelser vist i figurene 1 og 5 er ikke kommersielt tilgjengelig i øyeblikket, men ved de syntetiske strategier er beskrevet i litteraturen ikke at det ville være vanskelig å forberede disse forbindelsene for kommersiell bruk.

Den tverrfaglige tilnærmingen gitt av kjemiske biologi studier ikke bare har en enorm verdi i identifisering av nye mekanismer som forekommer i det biologiske miljøet, men også gir en grunnleggende bidrag til biomarkører og diagnostikk, til slutt bringe nyheten i helsevesenet og forebyggingsstrategier. ^14. kjemisk bidrag er nødvendig for en vellykket utvikling av molekylær medisin, skape integrerte plattformer og paneler for metabolsk profilering som forventes å gi en optimal rasjonalisering av intervensjon design, enten terapeutisk og ernæringsmessige, redusere usikkerhet og feil når de kan være forutsigbare.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MATERIALS
Cholesteryl linoleate ≥98%	Sigma-Aldrich	C0289-100 mg
Cholesteryl arachidonate≥95%	Sigma-Aldrich	C8753-25mg
2-mercapt–thanol	Sigma-Aldrich	M6250-100 ml
2-propanol	Sigma-Aldrich	34965-1L
Methanol 215 SpS	Romil	H409-2,5 L
Ethanol	Sigma-Aldrich	02860-2.5L
Chloroform SpS	Romil	H135 2,5 L
n-Hexane 95% SpS	Romil	H389 2,5 L
Acetonitrile 230 SpS	Romil	H047 2,5 L
Dichloromethane SpS	Romil	H2022,5 L
Carbon tetrachloride	Sigma-Aldrich	107344-1L
Sodium iodide	Sigma-Aldrich	383112-100G
Sodium hydrogen carbonate	Carlo Erba	478536-500 g
Diethyl ether	Sigma-Aldrich	309966-1L
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653-5KG
NaOH solid	Sigma-Aldrich	221465-25G
NH4OH sol. 28%-30%	Sigma-Aldrich	221228-1L-A
Acetic acid	Sigma-Aldrich	320099-500ML
Ammonium Cerium(IV)sulfate dihydride	Sigma-Aldrich	221759-100G
Ammonium Molybdate tetrahydrate	Sigma-Aldrich	A7302-100G
Sulfuric Acid 95%-98%	Sigma-Aldrich	320501-1L
Silver Nitrate	Sigma-Aldrich	209139-25G
Sodium sulfate anhydrous	Sigma-Aldrich	238597-500G
Nuclease P-I from penicillium citrinum	Sigma-Aldrich	N8630-1VL
Phosphodiesterase II type I-sa	Sigma-Aldrich	P9041-10UN
Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine, hc	Sigma-Aldrich	E114-25MG
Phosphatase alkaline type VII-t from*bov	Sigma-Aldrich	P6774-1KU
Phosphodiesterase I type VI	Sigma-Aldrich	P3134-100MG
Deoxyribonuclease II type IV from*porcin	Sigma-Aldrich	D4138-20KU
Trizma(r) base, biotechnology performanc ce	Sigma-Aldrich	T6066-100G
EDTA	Sigma-Aldrich	E1644-100G
Succinic acid bioxtra	Sigma-Aldrich	S3674-250G
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670-100G
Formic acid, 98 %	Sigma-Aldrich	06440-100ML
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane	Millipore	UFC500324
8-Bromo-2'-deoxyguanosine	Berry Associates	PR3290-1 g
8-Bromo-2'-deoxyadenosine	Berry Associates	PR3300-1 g
Sodium iodide	Sigma-Aldrich	383112-100G
Sodium hydrogen carbonate	Carlo Erba	478536-500 g
2'-deoxyguanosine:H2O (U-15N5, 96-98%)	Cambridge Isotope Laboratories, Inc	CILNLM-3899-CA-0.1
2'-deoxyadenosine (U-15N5, 98%) 95%+ CHEMICAL PURITY	Cambridge Isotope Laboratories, Inc	CILNLM-3895-0.1
Nitrous oxide (N2O)	Air Liquide
Deoxyribonucleic acid from calf thymus	Sigma Aldrich	D4522-5MG
EQUIPMENT
60Co-Gammacell	AECL- Canada	220
Immersion well reaction medium pressure 125 watts	Photochemical reactors ltd	Model 3010
Evaporating flask 250 ml	Heidolph	P/N NS 29/32 514-72000-00
Luna 5 μm C18(2) 100 Å, LC Column 250 x 4.6 mm	Phenomenex	00A-4252-E0
Alltima C8 Column 250 x 10 mm 5 μm	Grace	88081	Semipreparative
SecurityGuard Kit	Phenomenex	KJ0-4282	Analytical holder kit and accessories
Holder for 10.0 mm ID cartridges	Phenomenex	AJ0-7220	Semipreparative holder
10.0 mm ID cartridges	Phenomenex	AJ0-7221
High-performance liquid chromatography (HPLC)	Agilent	1100
LC/MS/MS	Applied Biosystems	4000QTRAP System
Tandem mass ESI spectrometer	(Bruker Daltonics)	Esquire 3000 plus
Vial 2-4 ml	SUPELCO	Cod 27516
Vial 4 ml	SUPELCO	Cod 27517