Frie radikaler i Chemical Biology: fra Chemical adfærd til Biomarker Development

Summary

Radikal-baseret biomimetisk kemi er blevet anvendt på opbygning biblioteker er nødvendige for biomarkør udvikling.

Abstract

Inddragelsen af ​​frie radikaler i biovidenskab vokset konstant med tiden og er blevet forbundet med flere fysiologiske og patologiske processer. Dette emne omfatter forskellige videnskabelige områder, der spænder fra fysiske, biologiske og bioorganisk kemi til biologi og medicin, med ansøgninger til forbedring af livskvalitet, sundhed og aldring. Tværfaglige færdigheder er nødvendige for den fulde undersøgelse af de mange facetter af radikale processer i det biologiske miljø og kemiske viden spiller en afgørende rolle i afsløringen grundlæggende processer og mekanismer. Vi udviklede et kemisk biologi tilgang stand til at forbinde fri radikal kemisk reaktivitet med biologiske processer, der giver oplysninger om de mekanistiske veje og produkter. Kernen i denne fremgangsmåde er udformningen af ​​biomimetiske modeller til at studere biomolekyle adfærd (lipider, nukleinsyrer og proteiner) i vandige systemer, opnå indsigt i reaktionsveje samt ens opbygning af molekylære biblioteker af fri-radikal reaktionsprodukter. Denne forbindelse kan med succes anvendes til biomarkør opdagelse og eksempler er tilvejebragt med to klasser af forbindelser: mono-trans-isomerer af cholesterylestere, som syntetiseres og anvendes som reference til påvisning i humant plasma, og purin 5 ',8-cyclo-2 «-deoxyribonucleosider, fremstilles og anvendes som reference i protokollen for påvisning af sådanne læsioner i DNA-prøver, efter ioniserende stråling eller indhentet fra forskellige helbredsproblemer.

Introduction

Reaktiviteten af ​​frie radikaler afslørede sin enorme betydning for mange biologiske begivenheder, herunder aldring og inflammation. I dag er det mere og mere tydeligt, at en afklaring af hvert kemikalie trin involveret i denne reaktivitet er behov for, for at forstå de underliggende mekanismer og der fremsættes effektive strategier til bekæmpelse af frie radikaler og reparation af skaderne. Bidraget fra kemiske undersøgelser er fundamental, men den direkte undersøgelse i det biologiske miljø kan være svært, da overlejring af forskellige processer vanskeliggør og foruroliger gennemgangen af ​​resultaterne og de dertil knyttede konklusioner. Derfor har strategien med at modellere frie radikaler reaktioner under biologisk beslægtede forhold bliver et afgørende skridt i forskningen af ​​kemiske mekanismer i biologi.

I det sidste årti vores gruppe udviklede modeller af frie radikaler processer under biomimetiske betingelser. I særdeleshed har vi davisaged biologisk relevante transformationer af umættede fedtsyrer, nukleosider og svovlholdige aminosyrer og læg dem i det spor, der skal evalueres og valideres som biomarkører for sundhedstilstanden. ^1-4

Vores generelle tilgang består af tre moduler:

• Organisk syntese, som giver adgang til de nødvendige ændringer biomolekyler. Den syntetiske plan kan også udformes for at simulere de fri radikal-processer i det biologiske miljø, således at anvende betingelser, der kan simulere biologisk proces af interesse, som er princippet om biomimetisk radikal kemi. I biomimetiske modeller reaktionsmediet er vand eller et heterogent medium på grund af den samtidige tilstedeværelse af hydrofile og hydrofobe segmenter. Fordelen at arbejde med biomimetiske modeller er at have et forenklet miljø med kendt reaktionspartner, hvor reaktiviteten og produkter kan blive behandlet i flere detaljer, eventuelt opdagehidtil ukendte kemiske processer. Fra dette trin mekanistisk og kinetiske oplysninger kan samles;
• Oprensning, analyse og karakterisering af produkterne, der giver strukturel og kemisk information af de modificerede biomolekyler med henblik på at organisere molekylære biblioteker og lette recognition.in den mere komplekse biologiske miljø. Protokoller er etableret også med henblik på løsning af komplekse blandinger af forbindelser, såsom sådanne afledt af biologiske prøver;
• Biomarkør udvikling ved hjælp af biologiske prøver, afledt enten ved in vitro-eksperimenter under anvendelse af cellekulturer, og in vivo undersøgelser fra dyr og mennesker. De protokoller, der er udviklet i biomimetiske modeller anvendes derefter til den komplekse analyse af prøver, til at overveje de frie radikale omlægninger under forskellige forhold. Molekylære biblioteker udviklet af syntese, er af enorm hjælp til life science opdagelser. De indsamlede oplysninger om de frie radikaler transformationer give mulighed for at finde ud af reparationer og forebyggende strategier. Databaser af resultaterne kan bruges til en grundig evaluering af multivariate analyse af biomarkør betydning så godt som muligt associerede faktorer.

Vi valgte to klasser af relevante biomarkører at godkende denne fremgangsmåde: cholesterylestere og purin 5 ',8-cyclo-2'-deoxyribonucleosider.

Protocol

1. Syntese af Mono-trans-isomerer af cholesterylestere

1. Opløs cholesterylestere (linoleat eller arachidonat cholesterylester) i 2-propanol (15 mM). For en bedre solubilisering blev prøverne sonikeret i 15 minutter under argon.
2. Opløsningen overføres til en kvarts fotokemisk reaktor, add 2-mercaptoethanol i 2-propanol (at nå 7 mM koncentration, fra en 2 M stamopløsning af thiol). Skylle reaktionsblandingen med argon i 20 minutter for at eliminere tilstedeværelsen af ​​oxygen i opløsningen.
3. Bestråle reaktionsblandingen med UV-lys under anvendelse af en 5,5 W lavtryks kviksølvlampe ved 22 ± 2 ° C i 4 min. Monitor ved analytisk Ag-TLC (sølv-tyndtlagskromatografi) til bevismateriale dannelsen af mono-trans cholesterylestere (se figur 1 for den kemiske formler). TLC-farvning udføres ved at hælde pladen i cerium ammonium molibdate (CAM) opløsning, og de pletter på opvarmningpladen. Standse reaktionen på et tidligt tidspunkt, for at udvinde udgangsmaterialet, der kan genbruges til at udføre andre runder af isomerisering, indhentning af en forøgelse af det samlede udbytte.
4. Opsaml reaktionsblandingen i en rundbundet kolbe, idet apparatet med nogle få ml 2-propanol. Fjern opløsningsmidlet og oprense mono-trans-isomerer af cholesterylestere fra Ag-TLC som beskrevet i litteraturen. ⁵ Anvendelse hexan-diethylether (9:1 v / v) som elueringsmiddel for mono-trans cholesteryl linoleat isomerer, hvorimod anvendelse hexan -diethylether-eddikesyre (9:1:0,1 v / v) for mono-trans cholesteryl arachidonat-isomerer.

2. Isolering af cholesterylestere fraktion fra humant serum

1. Fortyndes 1 ml humant serum (opnået ved centrifugering af blod) med 1 ml saltvand, og opløsningen hældes en skilletragt under en strøm af argon for at undgå artifakter (f.eks oxidation addukter). Der tilsættes 10 ml chloroform-methanol (2: 1 v / v) tre gange. Ryst skilletragten meget langsomt for at begrænse dannelsen af ​​emulsionen på grund af tilstedeværelsen af ​​albumin.
2. Vask de organiske lag en gang med saltopløsning (10 ml), derefter indsamle i en Erlenmeyer kolbe under en argonstrøm, tørres over vandfrit natriumsulfat. Fjerne flygtige stoffer ved rotationsinddamper for at give en gul olie (total plasma lipid fraktion).
3. Fylder det rå med 1 ml chloroform-methanol (2:1 v / v), belastning på en præparativ TLC under en strøm af argon og anvende en blanding af hexan-diethylether (9:1 v / v) som elueringsmiddel . Skrabe silica del indeholdende den cholesterylester fraktion og hældes i et hætteglas. Derefter ekstraheres silica (3 x 5 ml) med chloroform-methanol (2:1 v / v), indsamle de organiske lag og fjerne opløsningsmidlet efter inddampning til opnåelse af den rene fraktion af cholesterylestere (sædvanligvis ~ 1,5 mg).
4. Holde cholesterylestere i en mørk hætteglas dækket af aluminiumfolie under argon og opbevares ved -20 ° C. Cholesteryl emestrer både er følsomme over for lys og oxygen.

3. Karakterisering af Mono-trans cholesterylestere fra Raman Spectroscopy

1. Uddrag cholesterylestere fra human serum (≥ 0,7 mg) som beskrevet i afsnit 2, opløses i en lille mængde tetrachlormethan (≤ 10 ul) og sted i et hætteglas. _CCI4 vælges som opløsningsmiddel, fordi dens Raman signal ikke overlapper området af interesse af cholesterylester analyse.
2. Opløsningen overføres til prøveholderen gennem en engangs glaspipette, derefter forsigtigt fjerne opløsningsmidlet ved en langsom strøm af argon. Når en ensartet oliefilm er dannet på den indre væg af prøveholderen, sæt den i instrumentet til måling.
3. Fourier-transformeres Raman-spektrum af cholesterylestere er direkte opnået på de lipidekstrakter uden derivatiseringsreaktion. Den lasereffekt på prøven er <100 mW for at undgå prøve skader. Det samlede antal scanningerfor hvert spektrum er ≥ 800 for at minimere baggrundsstøj.
4. Den 1,700-1,630 ^cm-1 område af Raman-spektrum analyseres da det afspejler bidraget fra C = C-dobbeltbindinger til stede i molekylet (C = C strækningsmåde). En kurvetilpasning analyse udføres på dette område, således at det karakteristiske for de overlejrede bidrag fra cis-og trans-dobbeltbindinger i fedtalkyl kæde og dobbeltbindingen i ring B af cholesterol (se figur 2).
5. Til at passe korrekt de vibrationelle bands, bør nogle parametre være fast eller begrænset inden for rimelige grænser. De indgående peak profiler beskrives som en lineær kombination af Lorentz-og Gauss-funktioner, hvorimod halv højde båndbredder bedst bestemmes af computeren optimeringsrutine. Antallet og placeringen af ​​komponenter toppe opnås ved anvendelse af den fjerde afledte spektre, som gør det muligt at detektere også nogle svage komponent bands. Da signaletstøjforhold, der forringes efter differentiation af signalet kan udelukke brugen af ​​den fjerde derivat, udglattet 4. derivater med en tretten-punkts Savitsky-Golay-funktion, er en fordel, og dermed er en ret kompromis mellem opløsning og signal-støjforhold opnås . Bedste kurvetilpasning opnås til de lavest mulige C ² værdier.
6. Tilstedeværelsen af trans-isomerer er afsløret af komponenten på 1671 ± 1 ^cm-1, ud over i det mindste de to komponenter, lidt forskudt mod lavere frekvenser som følge af fedtsyrekæden og cholesterol C = C-dobbeltbindinger. Repræsentative Raman-spektrum af plasma cholesterylester er vist i figur 9. I den indsatte sammenligning af en specifik region med cholesteryl linoleat og mono-trans cholesteryl linolsyre isomerer er vist.

4. Derivatisering til fedtsyremethylestere (FAME) og analyse ved gaschromatografi

1. Opløscholesterylestere (~ 1,5 mg) med 0,5 ml af en 1 M opløsning af natriumhydroxid i benzen-methanol (2:3 v / v) og anbringes i et mørkt hætteglas dækket af aluminiumfolie under argon.
2. Lad blandingen under omrøring ved stuetemperatur og skærm ved TLC under anvendelse af en blanding af hexan-diethylether (9:1 vol / vol) som elueringsmiddel. Reaktionstiden er sædvanligvis 30 min, men en omhyggelig reaktion overvågning er påkrævet. Faktisk, når de tilsvarende methylestere dannes, skal reaktionen bratkøles for at undgå dannelsen af ​​nedbrydnings-og biprodukter. TLC viste den kvantitative dannelse af methylestere.
3. Slukke reaktionsblandingen ved tilsætning af 1 ml saltvand og ekstraheres methylestere med n-hexan (3 x 2 ml). Indsaml de organiske lag i et hætteglas, og opløsningsmidlet fjernes ved rotationsfordampning til opnåelse af methylesteren fraktion, som derefter bruges til GC-analyse uden yderligere oprensning.
4. Opløs methylesterne i den minimale mængde af n-hexan (sædvanligvis 1 mg i 50 ul), og injicere i GC udstyret med en 60 m x 0,25 mm x 0,25 um (50%-cyanopropyl)-methylpolysiloxan kolonne. Anvende en flammeioniseringsdetektor (FID) med følgende ovn-program: temperaturen starter ved 165 ° C, hold i 3 min, efterfulgt af stigning på 1 ° C / minut op til 195 ° C, hold i 40 min, efterfulgt af en anden stigning på 10 ° C / min op til 240 ° C, og hold i 10 minutter. En konstant tryktilstand (29 psi) vælges. Helium eller hydrogen, kan anvendes som bæregas. Methylestere identificeres ved sammenligning med retentionstiderne for autentiske prøver. Figur 10 viser en repræsentativ GC-analyse af FAME opnået fra plasma cholesterylestere.

5. Syntese af (5'R) - og (5'S) -5 ',8-cyclo-2'-deoxyadenosin

1. Opløs 33 mg 8-brom-2'-deoxyadenosin (8-Br-Dado) i acetonitril (100 ml) for at nå 1 mM koncentration. Regulere gasstrømmen (Ar eller N2) i fotoreaktor og fylde appaRatus med opløsning af 8-Br-Dado.
2. Der fremstilles en skillevæg med en passende størrelse for fotoreaktor input og passerer en nål forbundet med den inerte gas linie gennem centrum af den. Lukke systemet med septum. Skyl inert gas i 30 minutter.
3. Bestråle med UV-lys under anvendelse af en 125 W middelstort tryk kviksølvlampe ved 22 ± 2 ° C i 15 min, opsamling af opløsningen til en 250 ml rundbundet kolbe. Vask fotoreaktor med 10 ml acetonitril og indsamle vask i den samme kolbe.
4. Quench den rå reaktionsblanding med 1 M _{NH4OH-opløsning} og opløsningsmidlet afdampes i rotationsinddamper.
5. Kør HPLC analyse (HPLC-UV) med analytisk søjle (se instrumentering afsnit) under kendte betingelser, og sammenligne profilen med referenceforbindelser.
6. Kør HPLC-analyse (HPLC-UV) med et analytisk søjle (se instrumentering sektion) ved hjælp af følgende solventilationskanaler og gradienter: 2 mM ammoniumformiat som opløsningsmiddel A og acetonitril som opløsningsmiddel B. Indstil strømningshastighed på 1 ml / min og gradient fra 0% opløsningsmiddel B til 0,3% opløsningsmiddel B skal nås i 2,2 min. Derefter 0,8% opløsningsmiddel B i i 4,0 min, derefter 1% opløsningsmiddel B i 4,8 min. Forbliv på 1% opløsningsmiddel B for 9 minutter og derefter gå til 8% opløsningsmiddel B i 6 min. Efter gå til 10% opløsningsmiddel B i 4 min og til 30% opløsningsmiddel B i 5 minutter, og på 30% opløsningsmiddel B i andre 5 min. Indsaml de chromatografiske toppe svarende til de to diastereomere produkter i to forskellige hætteglas.
7. Måles absorbansen af ​​de to opsamlede fraktioner i UV-spektrofotometer og beregne den nøjagtige koncentration baseret på Lamber-Beer (A = εlC, hvor A er absorbansen, ε ekstinktionskoefficienten og l længden af ​​cellen). Brug ekstinktionskoefficienten ε af 2'-deoxyadenosin (Dado) (15.400 m ^{-1 cm-1} ved 260 nm).

6. Syntese af (5'R) - end (5'S) -5 ',8-cyclo-2'-deoxyguanosin

1. Opløs 35 mg af 8-brom-2'-deoxyguanosin (8-Br-dGuo) og 30 mg natriumiodid (NaI) i destilleret vand (100 ml) for at nå 1 mM og 2 mM koncentration, hhv. Regulere inert gas (Ar eller _N2) flow forbundet til fotoreaktor og fyld fotoreaktor med reaktionsopløsningen.
2. Degass reaktionsblandingen som beskrevet i procedure 5 (trin b).
3. Bestråle med UV-lys under anvendelse af en 125 W middelstort tryk kviksølvlampe ved 22 ± 2 ° C i 30 minutter, opløsningen samle til en 250 ml rundbundet kolbe. Vask fotoreaktor med 10 ml vand og opsamles vask i den samme kolbe.
4. Quench den rå reaktionsblanding med 1 M _{NH4OH-opløsning} og opløsningsmidlet afdampes under vakuum.
5. Udfør analyse som beskrevet i Procedure 5 (trin e til g). Brug ekstinktionskoefficienten ε af 2'-deoxyguanosin (dGuo) (11.700 m ^{-1 cm-1} ved 260 nm).

7. Syntese af isotopisk mærket purin (5'R) - og (5'S) -5 ',8-cyclonucleosides

1. Klargør 2 ml 1 mM vandig opløsning (destilleret vand) af de ¹⁵ N isotopisk mærkede purinnukleosider ([15N ^5] Installationskanaler eller [15N ^5] dGuo) i et hætteglas (4 ml) med en septumhætte.
2. Tilslut hætteglasset med septumhætte og forbindelse til gasledningen (N ₂ O til mætning af opløsningen) gennem en nål i skillevæggen, som når bunden af hætteglasset. Et andet kort kanyle i septumhætte fungerer som gas-udgangen.
3. Skylles opløsningen _med N2 O i 30 minutter. Gasstrømmen reguleres til at være meget lav.
4. Udgangen nålen er først taget ud, og efter 1 'den lange følger, for at have en lille tryk inde i hætteglasset.
5. Sætte opløsningen i apparatet i gamma radiolyse i 8 timer (beregning på basis af en dosishastighed ca. 4,5 Gy / min).
6. Efter reaktion standsning det rå med 1 M _NH4
7. Kør HPLC analyse (HPLC-UV) under kendte betingelser, ⁶ og sammenligne kromatogrammet med de standardreferenceværker.

8. Gamma radiolyse af DNA vandige opløsninger

1. Fremstilling af 1 ml 0,5 mg / ml opløsning (destilleret vand) af kalvethymus-DNA og sat i et hætteglas (2 ml) med en septumhætte.
2. Degass reaktionen som beskrevet i procedure 7 (trin bd).
3. Sætte opløsningen i apparatet i gamma radiolyse i 30 minutter (beregning på basis af dosis / hastighed ca. 4,5 Gy / min).

9. Enzymatisk fordøjelse af DNA

1. Til et Eppendorf-rør indeholdende 80 ug DNA, 8 U nuklease P1, 0,01 U af phosphodiesterase II, 20 nmol EHNA i 20 ul 300 mM natriumacetat (pH 5,6) og 10 mM zinkchlorid tilsættes. Inkuber blandingen ved 37 ° C i 48 timer.
2. Næste tilsættes en blanding af 8 U af alkalisk phosphatase, 0,02 U phosphodiesterase I i 40 pi 0,5 M Tris-HCI-buffer (pH 8,9) til blandingen fordøjelse. Prøven inkuberes ved 37 ° C i 2 timer.
3. Blandingen neutraliseres ved tilsætning af 10% myresyre.
4. Overføre prøven til en Amicon Ultra-0.5 centrifugal filterindretning (cutoff 3 kDa), der tilsættes 200 pi tridistilled H ₂ O. Placer Ultra-filteret i centrifugen rotor ved 14.000 x g i 15 minutter. Derefter adskille Ultra filter enhed fra mikrocentrifugerør. Lyofilisere den enzym-fri opløsning i mikrocentrifugerør.

10. DNA-prøve Afsaltning før analyse

1. Kør HPLC analyse (HPLC-UV) med analytisk søjle (se instrumentering sektion) efter kendte betingelser. ⁶
2. Opløse det frysetørrede spaltet DNA i 20 ul _H2O og injicere i HPLC-UV.
3. Prøven opsamles i et hætteglas efter saltet eluering (første minutter) og lige før elueringen time af det første nucleosid (5'R-cdGuo), indtil udgangen af ​​det chromatografiske program.
4. Prøven frysetørres og genopløses i 20 pi vand.

11. LC-MS/MS kvantitativ analyse

1. Forbered HPLC-MS/MS (tripel kvadrupol) før analysen påbegyndes ved at indlæse den analytiske metode og metoden for MS detektor (ESI). ⁶
2. Tilsæt 1 ul af isotopiske mærkede forbindelser blanding i prøven fremstillet i Procedure 7.
3. Injiceres 20 pi af det udtagne fordøjede DNA opløsning i destilleret vand.
4. De opnåede kromatografiske data udarbejdet på grundlag af tidligere kalibrering med reference-forbindelser. Et repræsentativt HPLC køre indeholdende adenosin og guanosin 2'-deoxyribonucleosider og deres oxidative og cyclo-derivater er vist i figur 11..

Representative Results

Ved isomeriseringsprocessen er blevet beskrevet især til cholesterylestere, der giver de mono-trans-isomerer af linol-og arachidonsyre-syrer er vist i figur 1 som de første produkter i dette angreb, som kan forekomme under betingelser med fri radikal stress i det biologiske miljø. ^Fem

I figur 3 den kemiske mekanisme involveret i cis-trans-dobbeltbinding isomerisering er vist. Den radikale kilde er angivet i en generisk måde at give S-centrerede radikaler. I de beskrevne protokoller den radikale kilde er UV-lys, der er i stand til at bryde homolitically SH binding stede i thiol-molekylet RSH.

Figur 4 opsummerer de tre trin protokollen til syntese af den modificerede lipid-klasse og deres detektion i human plasma: syntesen repræsenterer en biomimetisk fri radikal-proces og tilvejebringer også en one-pot bekvem adgang til georical isomerer, uden kontaminering med positionsisomere efterfulgt af oprensning og isolation protokoller.

Adskillige analysemetoder kan anvendes til en høj følsom påvisning af trans-isomeren indhold og karakterisering af mono-trans cholesterylester bibliotek. Især kan Raman spektroskopi udføres direkte på cholesterylester fraktion uden derivatisering (se figur 2 og figur 9).

Det andet eksempel angår purin 5 ',8-cyclo-2'-deoxyribonucleosider, som er DNA-læsioner skabt af angreb af frie radikaler til positionen C5' i sukkerdelen og efterfølgende dannelse af en covalent binding mellem sukker og basen dele. Fire konstruktioner kan fremstilles, det vil sige 5 ',8-cyclo-2'-deoxyadenosin og 5',8-cyclo-2'-deoxyguanosin, både eksisterer i 5'R og 5'S diastereomere former (figur 5). I figur 6 tHan reaktionsmekanisme er vist, der involverer fotolyse af 8-bromopurine derivater 5 til opnåelse af de tilsvarende C8 radikal 6, som intramolekylært abstracts et hydrogenatom fra C5-stillingen selektivt til opnåelse af 2'-deoxyadenosin-5'-yl-radikalet 7. Radical 7 undergår ringdannelse med en hastighedskonstant i området 10 ⁵ -10 ^{6 s-1, 2} efterfulgt af oxidation af heteroaromatisk gruppe 8 til opnåelse af de endelige produkter ^9. Omsætningen af ​​hydroxylradikaler, genereret ved radiolyse af vand, med 2'-deoxyadenosin og 2'-deoxyguanosin (10) viste sig at være ca. 10% af hydrogen abstraktion fra C5 'position. ⁷

Vores kemisk biologi tilgang til biblioteker af purin 5 ',8-cyclo-2'-deoxyribonucleosider (herunder mærkede forbindelser) er illustreret i figur 7, med identifikationen af disse læsioner i oligonucleotider og i DNA-prøver fra various kilder, såsom for eksempel behandlet under ioniserende stråling betingelser, som efterligner af radikale stressbetingelser.

I figur 8 et typisk fotoreaktor udstyr vises. Anordningen muliggør bestråling af forbindelser opløst i det passende opløsningsmiddel. Den består af: i) reaktionskammeret udstyret med indløbet for den inerte gas (på undersiden) og to indløb for gas-udgangen, og for reagenserne tilsætning ii) et indre kammer, indeholdende den passende kviksølvlampe forbundet med et kølesystem og elektrisk energi, som indsættes i reaktionskammeret gennem et glasslib.

Figur 1. Mono-trans-isomerer af cholesteryl linoleat og arachidonat.

Figur 2. Cholesterylestere i humant serum og direkte analyse for mono-trans-isomerer af Raman spektroskopi.

Figur 3. Tilsætningen-elimination proces, der fører til cis-trans isomeriseringen af dobbeltbindinger ved thiyl radikaler.

Figur 4. Tre trin protokol for udvikling af mono-trans cholesterylestere som biomarkør for fri radikal-stress.

Figur 5. De fire purin 5 ',8-cyclo-2'-deoxyribonukleosid diastereoisomerer. Klik her for at se større figur .

Figur 6. Generering af C5 'radikaler, enten ved fotolyse af 5 eller ved omsætning af 10 med HO • radikaler, og mekanismen af purin 5' ,8-cyclo-2 'deoxyribonukleosid formation. se større tal .

Figur 7. Protokol feller identifikation af nogle radikal-baserede DNA-læsioner, mtDNA: mitokondrie-DNA, nDNA: nuclear DNA.

Figur 8. Fotokemisk reaktor.

Figur 9. Repræsentative Raman-spektrum af plasma cholesterylester. På den indsatte sammenligning af en specifik region med cholesteryl linoleat og cholesteryl mono-trans linolsyreolier isomerer.

Figur 10. Repræsentative GC-analyse af FAME opnået fra plasma cholesterylestere.

<strong> Figur 11. Repræsentant HPLC køre indeholdende 2'-deoxyadenosin og 2'deoxyguanosine sammen med deres oxidative og purin 5 ',8-cyclo-2'-deoxyribo nukleosider. Klik her for at se større figur .

Discussion

Omdannelsen af ​​naturligt forekommende cis-umættede fedtsyrer til geometriske trans-isomerer er en transformation forbundet med produktionen af ​​radikal stress i det biologiske miljø. Cellemembran-lipider, der indeholder fedtsyrer, er en relevant biologisk mål for radikal stress og vi først undersøgt det endogene cis-trans phospholipider isomerisering i cellekulturer, dyr og mennesker vurdering analysemetoderne i hvert tilfælde. ^8-10 Vi viste, at denne transformation kan ske ved en række S-holdige forbindelser, herunder thioler, thioethere og disulfider, der under forskellige radikal stressbetingelser er i stand til at generere thiyl grupper, dvs isomerisering middel (figur 3). Eksemplet vist i denne artikel fokuserer på klassen af ​​cholesterylestere, som repræsenterer en kendt brøkdel af plasmalipider, nøje involveret i lipoproteinmetabolismen. Esterbindingen mellem fedtsyrer og cholesterol biosyntetiseres ved overførsel af fedtsyrer fra 2-positionen i glyceroldelen af ​​phosphatidylcholin og cholesterol, et trin katalyseret af enzymet lecithin cholesterol acyl transferase (LCAT). Derfor er plasma cholesterylestere nøje forbundet med membranlipid omsætning, og indeholder relativt store andele af polyumættede fedtsyrer (PUFA) typisk til stede i phosphatidylcholiner, dvs linol-og arachidonsyre syrer. Lipoprotein formation er involveret i kardiovaskulære og metaboliske sygdomme. Reaktiviteten af naturlige cholesterylestere med frie radikaler kan forekomme ved dobbeltbindingerne af linoleat og arachidonat rester, som kan transformeres i de tilsvarende trans-geometriske isomerer (se figur 1 for de strukturer). Karakterisering af det transeuropæiske cholesterylester indhold i biologiske prøver, er interessant for biomarkør udvikling. En indirekte metode består af omdannelse af cholesteryl estere isoleret fra plasma til de tilsvarende fedtsyremethylestere (FAME) og adskillelse ved gaschromatografisk protokoller. I dette tilfælde er justeringen af ​​standardreferenceværker af cis-og trans fedtsyremethylestere udføres, for at muliggøre kvantificering af trans-indhold i prøverne. Ud fra de analytiske undersøgelser på cholesterylester biblioteket, foreslog vi at anvende også en metode baseret på Raman spektroskopi, som kan udføres direkte på cholesterylester fraktionen isoleret fra plasma uden yderligere derivatisering til den tilsvarende FAME (se figur 2 og 9). Det er værd at bemærke, at indtil nu ikke succesrige fremgangsmåder er beskrevet at separere cis-og trans-isomerer af fedtsyrer indeholdende lipider ved HPLC, som i stedet beskrevet af cholesterylester hydroperoxider. Hidtil har den indirekte gaschromatografiske metode er stadig den bedst tilgængelige metode hidtil. Ved denne fremgangsmåde den første kvantitativ evalueringtion af mono-trans-indhold afledt af cholesterylestere isoleret fra plasma fra raske forsøgspersoner blev leveret. Ved hjælp flammeionisationsdetektor (FID) grænsen for påviselighed er tilfredsstillende (ppb) og nanomolære mængder af forbindelserne er påvist. ^Fem. Med forskellige detektionssystemer denne grænse kan endda sænket. Virkningen af ​​ioniserende stråling på cholesterylestere er tale om yderligere undersøgelser, om en lineær respons opnås i forhold til den påførte dosis.

Som et andet eksempel, valgte vi modificerede nucleosider, som kan fremstilles ved fri radikal-beskadigelse af DNA. Hydroxylradikaler (HO •) er kendt for at være de mest skadelige Reactive Oxygen Species (ROS) for deres evne til at forårsage kemiske modifikationer til DNA. Enkelte eller multiple læsioner kan forekomme på DNA, der i eukaryote celler er placeret i kernen og mitochondrier. Identifikation og måling af de vigtigste klasser af oxidative genererede skader på DNA kræver approprIATE molekylære biblioteker med henblik på at etablere de analytiske protokoller. Vi fokuserede vores interesse på de mindste tandem læsioner, som er purin-5 ',8-cyclo-2'-deoxyribonukleosider, der har en yderligere kovalent binding mellem basen og sukkergrupper skabt af den fri radikal-angreb. Forbindelserne er 5 ',8-cyclo-2'-deoxyadenosin og 5',8-cyclo-2'-deoxyguanosin eksisterer i 5'R og 5'S diastereomere former (figur 5). Deres potentiale til at blive fri radikal stress markør er tale om grundforskning. ² Faktisk, når DNA bliver udsat for HO • radikal hydrogenfjernelse fra C5-stillingen af sukkeret er en af de mulige begivenheder, der førte til dannelsen af disse tandem læsioner. Purin 5 ',8-cyclonucleosides kan måles som summen af diastereomerer ved HPLC-MS/MS i enzymatisk fordøjet γ-bestrålede DNA-prøver varierer fra 1 til 12 læsioner / 10 ⁶ nukleosider / Gy vil formular fravær af oxygen til fysiologisk niveau af oxygen Jegn væv, det diastereomere forhold 5'R / 5'S bliver ~ 4 og ~ 3 for 5 ',8-cdAdo og 5' ,8-cdGuo henholdsvis (figur 11). ¹¹ Det er værd at bemærke, at forholdet mellem strålingsdosis og 5 ',8-cdAdo og 5' ,8-cdAdo læsioner påvist i cellulært DNA er langt fra forstået. Den enkelt eksperiment baseret på 2kGy bestråling rapporteret i det eksperimentelle kan anses for usikker. ¹¹ Yderligere forsøg af denne art og analytisk mængdebestemmelse af de fire læsioner er nødvendige for at fastlægge denne forbindelse. Påvisningen af disse læsioner, og de ​​mere populære oxidative omdannelser (såsom 8-oxo-2'-deoxyguanosin, 8-oxodGuo) er spørgsmål om intense undersøgelser, der dokumenterer betydningen af begge læsioner ved oxidativ metabolisme. ^6,13 Anvendelsen af HPLC -MS/MS (tripel kvadrupol) har en detektionsgrænse tæt på 30fmol for alle fire læsioner. Sidste forbedringer hævdes at nå påvisningsgrænser attomol niveauer af instrumentets produproducenter. Baseret på den meget nyere litteratur, har ⁶ analysemetoder, der omfatter en korrekt oprydning af prøven og berigelse for at opfylde påvisningsgrænserne for den MS / MS / MS (ionfælde) eller af den anvendte MS / MS (tripel kvadrupol) i vores tilfælde.

Inspireret af biologiske syntesefremgangsmåder af forbindelserne 1-4 blev udviklet ud fra 8-bromopurine derivater under eller fotolyse. ^7,12 Disse procedurer involverer en radikal kaskadereaktion der efterligner DNA beskadigelse mekanisme for dannelse af 5 ',8-cdAdo og 5' ,8-cdGuo læsioner. Fra biologiske perspektiver, blev det konstateret, at disse læsioner ophobes med aldring i et væv-specifik måde (lever> nyre> hjerne), der beviser, at DNA reparation mekanismer er utilstrækkelige til at bevare det genetiske materiale fra disse læsioner. ¹³ Faktisk nukleotid excision reparation (NER) er den eneste vej nuværende tidspunkt identificeres til reparation af disse læsioner. ²

De to klassees af forbindelser vist i figur 1 og 5 ikke er kommercielt tilgængelige i øjeblikket, men de syntetiske strategier er beskrevet i litteraturen ville det ikke være vanskeligt at fremstille disse forbindelser til kommerciel brug.

Den tværfaglige tilgang, som kemiske biologiske undersøgelser ikke alene har en enorm værdi i identifikationen af nye mekanismer, der forekommer i det biologiske miljø, men giver også et afgørende bidrag til biomarkør opdagelse og diagnostik, i sidste ende bringe nyhed inden for sundhedspleje og forebyggelsesstrategier. ¹⁴ Den kemisk støtte er nødvendig for en vellykket udvikling af molekylær medicin, skabe integrerede platforme og paneler til metabolisk profilering, som forventes at give mulighed for en optimal rationalisering af interventionen design, enten terapeutisk og ernæringsmæssige, reducere usikkerhed og fiaskoer, når de kan være forudsigelig.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MATERIALS
Cholesteryl linoleate ≥98%	Sigma-Aldrich	C0289-100 mg
Cholesteryl arachidonate≥95%	Sigma-Aldrich	C8753-25mg
2-mercapt–thanol	Sigma-Aldrich	M6250-100 ml
2-propanol	Sigma-Aldrich	34965-1L
Methanol 215 SpS	Romil	H409-2,5 L
Ethanol	Sigma-Aldrich	02860-2.5L
Chloroform SpS	Romil	H135 2,5 L
n-Hexane 95% SpS	Romil	H389 2,5 L
Acetonitrile 230 SpS	Romil	H047 2,5 L
Dichloromethane SpS	Romil	H2022,5 L
Carbon tetrachloride	Sigma-Aldrich	107344-1L
Sodium iodide	Sigma-Aldrich	383112-100G
Sodium hydrogen carbonate	Carlo Erba	478536-500 g
Diethyl ether	Sigma-Aldrich	309966-1L
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653-5KG
NaOH solid	Sigma-Aldrich	221465-25G
NH4OH sol. 28%-30%	Sigma-Aldrich	221228-1L-A
Acetic acid	Sigma-Aldrich	320099-500ML
Ammonium Cerium(IV)sulfate dihydride	Sigma-Aldrich	221759-100G
Ammonium Molybdate tetrahydrate	Sigma-Aldrich	A7302-100G
Sulfuric Acid 95%-98%	Sigma-Aldrich	320501-1L
Silver Nitrate	Sigma-Aldrich	209139-25G
Sodium sulfate anhydrous	Sigma-Aldrich	238597-500G
Nuclease P-I from penicillium citrinum	Sigma-Aldrich	N8630-1VL
Phosphodiesterase II type I-sa	Sigma-Aldrich	P9041-10UN
Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine, hc	Sigma-Aldrich	E114-25MG
Phosphatase alkaline type VII-t from*bov	Sigma-Aldrich	P6774-1KU
Phosphodiesterase I type VI	Sigma-Aldrich	P3134-100MG
Deoxyribonuclease II type IV from*porcin	Sigma-Aldrich	D4138-20KU
Trizma(r) base, biotechnology performanc ce	Sigma-Aldrich	T6066-100G
EDTA	Sigma-Aldrich	E1644-100G
Succinic acid bioxtra	Sigma-Aldrich	S3674-250G
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670-100G
Formic acid, 98 %	Sigma-Aldrich	06440-100ML
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane	Millipore	UFC500324
8-Bromo-2'-deoxyguanosine	Berry Associates	PR3290-1 g
8-Bromo-2'-deoxyadenosine	Berry Associates	PR3300-1 g
Sodium iodide	Sigma-Aldrich	383112-100G
Sodium hydrogen carbonate	Carlo Erba	478536-500 g
2'-deoxyguanosine:H2O (U-15N5, 96-98%)	Cambridge Isotope Laboratories, Inc	CILNLM-3899-CA-0.1
2'-deoxyadenosine (U-15N5, 98%) 95%+ CHEMICAL PURITY	Cambridge Isotope Laboratories, Inc	CILNLM-3895-0.1
Nitrous oxide (N2O)	Air Liquide
Deoxyribonucleic acid from calf thymus	Sigma Aldrich	D4522-5MG
EQUIPMENT
60Co-Gammacell	AECL- Canada	220
Immersion well reaction medium pressure 125 watts	Photochemical reactors ltd	Model 3010
Evaporating flask 250 ml	Heidolph	P/N NS 29/32 514-72000-00
Luna 5 μm C18(2) 100 Å, LC Column 250 x 4.6 mm	Phenomenex	00A-4252-E0
Alltima C8 Column 250 x 10 mm 5 μm	Grace	88081	Semipreparative
SecurityGuard Kit	Phenomenex	KJ0-4282	Analytical holder kit and accessories
Holder for 10.0 mm ID cartridges	Phenomenex	AJ0-7220	Semipreparative holder
10.0 mm ID cartridges	Phenomenex	AJ0-7221
High-performance liquid chromatography (HPLC)	Agilent	1100
LC/MS/MS	Applied Biosystems	4000QTRAP System
Tandem mass ESI spectrometer	(Bruker Daltonics)	Esquire 3000 plus
Vial 2-4 ml	SUPELCO	Cod 27516
Vial 4 ml	SUPELCO	Cod 27517