Summary
시상 하부의 기능 및 의료 중요성에도 불구하고,
Abstract
개발 포유류 뇌의 특정 영역의 유전자 변형은 매우 강력한 실험적인 방법입니다. 그러나 새로운 마우스 돌연변이를 생성하는 것은 종종 절망적 느립니다. 그것은 합리적인 포스트 치료실 생존 자궁에서 발전 마우스 뇌에 액세스 할 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 하지만이 절차의 결과가 두뇌 개발의 가장 피상적 쉽게 접근 할 부분에 거의 독점적으로보고되었습니다 피질 즉. 시상, 좁은보다 중간 지역은, 대상에 대한 더 어려운 입증되었습니다. 특히 깊은 핵, 시상 하부의 사람들로 형질은 가장 도전하기 때문에 거의 결과가보고되었다 아마도. 여기에서 우리는 전체 시상 하부 neuroepithelium 또는 electroporation을 통해 형질 전환을위한 그것의 일부를 (시상 하부 지역) 대상으로하는 절차를 보여줍니다. 우리의 접근에 키는 t의 긴 마취 시간, 주입하다HIRD 뇌실, 적절한 종류와 전극의 위치. 또한, 우리는 대상과 가장 오목한 시상 하부 핵, mammillary 몸의 후속 조직 학적 분석 결과를 보여줍니다.
Introduction
배아 마우스 뇌의 유전자 조작은 개발 규제에 대해 배울 수있는 바람직한 방법입니다. 돌연변이 마우스 라인의 세대는 그러나 느리고 비싸다. 포유류의 뇌의 뉴런을 개발 특정 유전자 변화를 소개하는 하나의 강력한 방법은 자궁의 electroporation에 있습니다. 기본적으로, 기술은 그 배아는 일정 시간 동안 생존 뇌를 수집하고 가능한 한 소설, 정보 표현형을 위해 그 (것)들을 검사 할 수있는 전기 펄스에 의해 배아 뇌 neuroepithelium에 DNA를 형질로 구성되어 있습니다. 이러한 방법으로, 실험 마우스 돌연변이의 생산에 필요한 긴 대기 기간없이 즉시 가설을 테스트 할 수 있습니다.
개발 배아에 DNA의 형질 전환 병아리 배아 1 비켜 electroporation을에 시작했다. 마우스 증명 (proof-of-concept) 필수는 문화에 수행 된
주요 문제는 그 (것)들 또는 어머니를 죽이지 않고 자궁에서 개발 태아의 두뇌를 형질하는 것입니다. (개복술, 사출, 일렉트로) 필요한 수술을 배우는 것은 긴 훈련 기간이 필요합니다. 수술은 태아의 생존 비율이 허용되는 지점을 마스터하고 나면, 그 다음 중요한 질문은 뇌 구조에 액세스 할 수있는? 당연히 자궁의 electroporation에서 얻은 결과를 보여주는 첫 번째 발표 논문 대뇌 피질의 개발 5-9에 집중했다. 수술에 가장 접근 개발에 마우스 뇌의 영역은 피질 (그림 1)이기 때문에 이것은이 기술을 사용하여 출판물의 대부분을 여전히 사실이다. 피질에 자궁의 electroporation에 대한 절차는 설명했습니다인쇄 10 비디오 11~14인치 기술의 수정은 telencephalon의 복부 부분 기저 신경절 15를 대상으로 할 수 있습니다.
telencephalon 이상, 간뇌는 (고전 시상과 시상 하부로 분할)에 도달하기 어려운 전뇌의 영역이다. 그 지느러미와 가장 접근 부분 시상 16-19의 대상 논문 보고서의 작은 숫자입니다.
시상 하부, 전뇌의 대부분의 복부 부분 때문에 하나의 지느러미 표면 (피질) (그림 1) 가장 깊이 지역화. 이 지역은 유전자 자궁에서 마우스 뇌를 조작하기 위해 최선을 다하고 연구자를위한 어려운 과제로 남아. 우리의 지식에, 극소수의 기사는 마우스의 시상 하부 20,21으로 자궁 형질에서의 결과를보고합니다. 그러나 시상 하부 canno의 기능적 중요성그것은, 짝짓기, 번식 및 양육 22 먹고 마시는 같은 행동을 조절 때문에 t은 아무리 강조해도 지나치지. 또한, 시상 하부 개발의 변경은 나중에 비만, 고혈압, 당뇨병 및 조숙 한 사춘기 23과 같은 생활 조건의 발생에 기여한다. 개발하는 동안 유전자 시상 하부를 변경할 수 있다는 것은 이해하기 위해 매우 강력한 도구를 제공 할 것입니다.
우리가 사용하는 임신 한 쥐의 개복 수술에 대한 기본적인 수술 프로토콜은 다른 프로토콜 11,13,14,24에서 사용하는 것과 비슷합니다. 우리는 완전성에 대해 간략히을 설명합니다. 우리의 절차의 핵심, 다른 한편으로는, 마취의 종류, 주입 위치, 전극의 종류와 삽입 및 태아의 머리에 대하여 긍정적 인 전극의 위치입니다. 전자는 대한 수 있기 때문에 우리는 간단한 복강 내 마취를 통해 가스 흡입 마취를 유도하고 유지하는 것을 선호마취의 다소 긴 기간은 어려운 수술이 필요합니다. 마취에서 빨리 회복 isoflurane을 흡입 결과, 일반적으로 어머니가 이미 수술 후 분 정상 동작을 보여줍니다 때문이다. 유리 micropipette를 가진 DNA 용액의 주입 쉬운 점은 그러나 시상 하부 electroporation을 위해 완전하게 적합하지 않은 측면 뇌실입니다. 직접 뇌실에 주입 참으로 깊은 diencephalic 구조를 대상으로 중요합니다. 이것은 표준, off-the-shelf 전극 E12.0 또는 E12.5에서 시상 하부 형질 할 수 있습니다. 우리는 특히이 목적에 적합 NEPA 유전자 (치바, 일본)에 의해 제조 된 전극의 일부를 발견했다.
우리의 절차를 우리는 전체 시상 하부 neuroepithelium 또는 전극 방향에 따라 부분, 지역 형질의 형질을 구하십시오. 여기에서 우리는 틀림없이, mammillary 몸 형질하여 기술을 보여깊은 모든 시상 하부 핵의 가장 오목한. 또한, 우리는 해상도 세포 수준에 형질 전환 세포의 자세한 조직 학적 분석을 보여줍니다.
자궁에서 마우스 두뇌 개발을 형질에 대한 다른 접근 방법 자궁의 electroporation에서의 비교 토론 섹션에서 찾을 수 있습니다.
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Protocol
1. 주사 DNA 유리 마이크로 피펫의 준비
- 좋은 품질의 유리 마이크로 피펫은 양수의 손실로 인해 초기 높은 낙태 비율을 줄이기 위해 필수적입니다. 유리 마이크로 피펫을 당겨하는 절차가 잘 13,18,25를 기록하고있다. 열 = 300; 1.2 mm 직경의 모세관을 사용하여 설정 P = 500와 기존의 셔터에 P-97 장치를 뽑아 = 40을 당겨 속도 = 50; 시간 = 50. 3mm "구유"필라멘트 (셔터 악기 FT330B)와 풀러 맞 춥니 다. 2mm 크기의 필라멘트는 우리 덜 만족스러운 결과를 굴복했다. 한편, 마이크로 피펫 팁의 경사지는 것은 우리에 대한 결과를 개선하지 않는 것.
- 1 ~ 2 ㎍ / μL의 최종 농도에 녹색 빠른 0.1 %를 포함하는 PBS의 정화, 독소 무료 플라스미드 DNA를 (세포 배양 학년) 녹입니다. 빠른 그린은 배아 뇌의 뇌실에서 볼 수 주입 솔루션을 만들 것입니다.
- 유리 micropipette를에 DNA 용액 10 μl를로드합니다. 분사 시스템 (피코 펌프)이나 입 피펫에 유리 micropipette를 연결합니다.
2. 마취
가열 패드와 수술기구와 수술 테이블을 준비합니다. 배아의 시각화를 촉진하는 차가운 광원을 켭니다. 예를 유리 구슬 살균기에 사용 수술 도구를 소독.
세 가지 마취 절차는 (토론 참조)이 프로토콜에 대한 가능합니다. 여기에서 우리는 우리가 (유량 0.5 L / 분) 마취 유도를 위해 isoflurane을 흡입을 사용하여 최선을 고려해야 하나뿐만 아니라 유지 보수 (유량 1 L / 분)를 설명합니다.
- 튜브의 짧은 길이로 Komesaroff 마크 5 마취 장치에 연결 (그래서 마우스가 계속 표시) 투명한 작은 용기에 임신 마우스를 소개합니다.
- isoflurane을 가진 기화기를 기입 한 후 장치에 연결된 산소 병을 엽니 다. isofl 중 하나 또는 두 개의 펄스를 날려urane / 마취 안으로 설정하는을위한 마우스와 시계를 들고 용기에 산소 (0.5 L / 분)
- 그들을 건조 방지하고 즉시 머리에 흐름 마취 마스크를 맞게 연고 눈을 커버, 마우스를 꺼내.
3. 개복술
- 가열 패드 (그렇지 않으면 그것의 몸의 온도가 회복의 기회를 감소, 매우 빠르게 내려 갈 것이다)에 최대 배꼽에 마우스를 놓고 테이프로 옆으로는 네 다리를 고정하여 제자리에 그 몸을 고정합니다. 반사 자극 (회사의 압력 예를 들어, 발가락이나 꼬리 핀치)에 대한 응답의 손실을 확인하여 마취의 깊이를 평가합니다.
- 복부 표면을 면도 iodophorpovidone 요오드 (Braunoderm)로 소독.
- 복부 피부에 종 절개 (1-1.5 ㎝ 길이)를 확인합니다. 그런 복막를 잘라. 절개 주위에면 거즈를 놓습니다. 하나의 자궁을 표시하고 PBS-씻어서 gauz에 무딘 집게로 조심스럽게 잡아 당깁니다전자. 매우 자주 그것은 항상 (그림 2A와 2B) 촉촉한 유지하기 위해 PBS와 자궁을 씻어. 전체 절차를 수행하는 동안 자궁 내부의 높은 압력이 낙태의 결과로 주입시 유체의 손실의 가능성을 증가 배아를 전송합니다 때문에, 꽉 mesometrium 또는 자궁을 당겨 마십시오.
4. 뇌 심실로 DNA 주입
- 뇌의 뇌실을 시각화 할 수있는 방식으로 자궁을 누릅니다. 광범위하게 불리한 위치에 놓여 태아의 위치를 변경하지 마십시오 - 이것은 낙태의 가능성을 증가시킵니다.
- 정상에서 배아의 머리를 보면, 왼쪽과 오른쪽 대뇌 반구 사이의 시각 차이 또는 균열을 집중. 반구 구별하기 쉽고 그 안에서 측면 심실은 (을 대상으로하지 않은) 보통 다소 어두운 모양으로 인식 할 수 있습니다. 배아 (넘겨 준다 DNA 주입을 위해 완벽 지향이 발견 된 경우에스 2C와 2D)는, 그것을 관통하여 자궁 벽에 가능하며 한 번에 세 번째 뇌실을 입력합니다. 약 1mm 대한 침투, 자궁 벽과 대뇌 피질 반구 사이의 간격의 주동이의 끝 부분에 구멍을 45 °로 유리 micropipette를 잡으십시오. 이러한 방법으로 유리 마이크로 피펫의 끝은 뇌 (안 뇌실) (그림 2C와 2D)의 세 번째 뇌실로 들어갑니다. 이 배아의 머리 근처에서 첫 번째 구멍을 뚫어 질 벽 (항상 45 °에서)에 유용 덜 호의적 중심의 배아에서 대뇌 피질 반구 사이의 올바른 위치에 micropipette의 팁을 배치하고 단지 그 후에 뇌를 관통. 세 번째 뇌실 (좋은 주사 녹색 액체가 뇌실을 채우고)에 DNA 용액 1 μL에 대해 주입. 하나의 자궁 뿔의 배아와 동일한 절차를 반복합니다. 이 DNA 솔루션에 대한 약간의 시간이 심실 유체로 균일하게 혼합 entir에 도달 할 수 있습니다전자 neuroepithelium.
5. Electroporation에 대한 시상을 대상으로
- 에 electroporator를 전환하고 배아 나이 (E12.5 위해 우리는 5 구형파 펄스를 사용하여, 50 V, 50 밀리 ON/950 밀리 초 OFF)에 따라 설정을 조정합니다. 양극 스테인레스 스틸 바늘 전극 (CUY550-10)로하고 부정 극 원형 평면 전극 (CUY700P4L)로 사용합니다. (그것은 그렇지 않으면 현재 그냥하지만 그것을 통해 배아 주위에 흐르고 있기 때문에 전극, 배아보다 작은 것이 중요합니다.)
- electroporation에 대한 그의 지느러미 쪽 (즉, 실험을 향하고)까지이다 (입니다 대부분으로) 그 배아를 선택하고, 그 방향으로 유리한되지 않은 버립니다. 그것은 에탄올 소독 손가락이나 장갑으로 자궁을 만지지 지금은 안전합니다. 집게와 자궁을 잡고, 그러나, 일렉트로 동안 전류의 흐름을 방해한다.
- 피어스 AMN 사이에 태아의 머리에 의해 자궁 벽바늘 전극의 끝으로 그것을 통해 아래로 밀어하여 iotic 주머니와 태반. 스러스트 블록으로 다른 손의 집게 손가락을 사용합니다. 전극의 끝 부분의 약 5 mm은 중뇌 (그림은 2E 및 2 층) 약 수준에서 양막 낭과 자궁 벽 사이에 지금 있어야합니다. 이 "표적 전극", 그래서 그것의 위치는 시상 하부 neuroepithelium의 일부 형질을받을 가능성이 가장 높은 결정됩니다 것을 기억하십시오. 태아는 매우 부드럽게 전극 사이에 "압박"으로되어 있습니다.
- 다른 한편으로, 위치에 태아의 머리 (그림의 2E와 2G)의 반대편에 자궁 벽의 외부 둥근 편평한 전극.
- (950 밀리 초 OFF, 5 구형파 펄스 50 V, 50 밀리 초) 전압을 적용 페달 스위치를 사용합니다.
- 다른 손의 검지 손가락으로 자궁을 다시 잡고 천천히 자궁의 바늘 전극을 당겨 - 만약 양수 검진TIC 액체가 구멍이 벽을 통해 손실, 일반적으로 배아 낙태를 받게 될 것이다. 모든 배아와 절차를 반복합니다.
- 복부에 자궁 경적을 반환하고 남은 경적 주사와 일렉트로를 반복합니다.
6. 수술 마무리
- 모든 배아의 주입과 electroporation을 한 후, 그들은 그것을 닫기 전에 식염수로 복강 전에 촉촉하고 있었다 정확하게 위치, 아주 조심스럽게 복부에 다시 자궁을 배치합니다.
- 외과 장선 (Vicryl Polyglactin 910, 5-0, ETHICON V4914)와 복막을 봉합. 피부 사용의 폐쇄 methodwith 대한 저항력이 봉합 (Supramid 나일론, 6-0, Serag Wiessner 07171L TO) "스티치 중단".
- 포비돈 요오드 (Braunoderm)와 복부 표면을 소독 비 스테로이드 피하 항염증제 (예 : 0.9 % 염화나트륨의 Rimadyl의 1:10 용액 100 μL) 또는, 더 나은, 부와 같은 아편 주사prenorphine (Temgesic, 0.9 % 염화나트륨의 0.05-0.1 ㎎ / ㎏ 체중)은 통증을 완화한다.
- 마취 기계에서 어머니를 제거하고 가열 패드에 의해 가열 케이지에 넣습니다. 완전히 마취에서 회복 될 때까지 계속 마우스를 모니터링 할 수 있습니다. 나중에, 그들은 감염이나 고통의 흔적없이 프로 시저에서 복구하는 보장하기 위해 매일 동물을 확인합니다.
7. 결과 분석
- 분석 원하는 날짜에 따라 배아 (또는 postnatals) 수확. 출생 마우스 (1 - 2 일 이전)는 잘린에 의해 살해된다.
- 이전 electroporation의 주석에 따라 모든 배아를 분리합니다. 입체 현미경 하에서 뇌를 해부하고 해당 지역의 녹색 형광 신호 (GFP 기자에서)에 대한 현미경으로 확인합니다.
- 선택한 두뇌는 "신선한"을 분석 할 수있다 : 4 % 파라 포름 알데히드에 짧은 시간 동안 조직을 수정하고 아가 4 % 또는 젤라틴에 포함lbumin 후 vibratome 형 장치 부분 (그림 3). 더 자세한 면역 분석 (그림 4), 10 설치 매체 (조직 테크)에 포함 30 % 자당 용액에 뇌를 극저온 보호는 그라 이오 스탯에 20 μm의 섹션을 잘라.
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Representative Results
대부분의 시상 하부 뉴런은 다소 짧아 마우스 개발 27,28로 번역 쥐 26 출생 연대 분석에 따르면, E11.5 사이 E15.2에 태어난다. 시상 하부 신경의 피크 E12.5 29-31에 도달합니다. 따라서, 본 연구 (E12.5)에 대해 선택된 형질의 나이에, 시상 하부 뉴런의 큰 비율은 주어진 rostro - 꼬리 수준에서 표시 할 수 있습니다.
두꺼운 vibratome 유형 섹션에 E18.5에서 분석 (그림 3A 및 3B) 시상 하부 neuroepithelium의 전체 rostro - 꼬리 확장 일렉트로 (그림 3A)에 액세스 할 수 있는지 보여줍니다. 특정 나이에, 뉴런 계보 연구 32과 일치, 모든 메디 - 측면 수준 (그림 3B)에서 표시 할 수 있습니다. mammillary 몸 (MBO)는 가장 ventra에 오목 안감 neuroepithelium에서 개발 신경 핵이다L과 전뇌의 꼬리 부분입니다. 이 대상 원칙적으로 MBO는 매우 어려워집니다. 기능적으로, MBO는 선행 성 기억 상실증 33 메모리 통합과 병적 인 변성 결과에 대한 중요한 구조입니다. 우리는이 핵 (그림 3C 및 3D)으로 매우 구체적 기자 플라스미드를 형질 할 수 있었다. MBO의 뉴런은 형질 (그림 3C에서 화살촉) 후 표시되는 두 개의 매우 독특한 기능적으로 중요한 책자를 형성하는 축삭을 확장합니다. 횡단면 (그림 3D) (형질 전환 실험 장소를 데려 가기 전에 즉) E12.5 (형질 세)에서 태어난 뉴런 이전에 생성 뉴런의 비 표시 대용량의 주위에 곡선 "레이어"를 형성하는 것을 보여줍니다.
형광 기자 단백질, 결과를 자세히 분석의 도움으로 두꺼운 부분에 대한 검사로 나와있는 일반적인 마이그레이션 패턴을 넘어 포스는ible 그라 이오 스탯 섹션에 특정 항체를 사용하여 (그림 4). 여기서 선택한 예제를 분석하기 위해, MBO, 우리는 mammillary 오목 (그림 4A)에서 나오는 광선 폐해 프로세스의 평면에 평행 수평 섹션을 준비했다. 우리는 GFP (그림 4B)에 대한 항체에 의해 E12.5에 표시된 neuroepithelium에서 태어난 MBO 신경을 확인했다. 예상대로, 항체 MBO 세포의 제한된 그룹 (그림 4B, 4C와 4D의 화살촉)로 표시. 두 전 (측면)와 (내측) E12.5 후 태어난 MBO 뉴런에 각각 대응하는 측면과 중간 MBO 영역을 레이블이없는 사이에이 그룹은 위치했다. 예를 들어, 우리가 neuroepithelium의 반경 폐해 프로세스에 대한 개별 레이블 뉴런의 이동 모드를 보여주기 위해 스틴 (그림 4C와 4D 빨간색)에 대한 항체와 공동 염색.
그림 1. midgestation에서 시상과 피질의 상대적인 위치는. 시상 (A) 및 횡 (B) 대부분의 지느러미와 대부분의 표면 전뇌 구조 피질 (CTX, 파랑)뿐만 아니라 대부분의 깊이 등을 표시 midgestation 마우스 태아의 뇌 다이어그램 배치 전뇌 구조, 시상 하부 (HY, 빨강).
그림 2. 절차의 다이어그램. (A) 임신 댐 마취하고 자궁 노출. (B) 각각의 자궁 팽윤에서 태반 삽입 (블랙 화살촉)를 식별태반 (PL) 및 배아. ME, mesometrium. (C) 왼쪽과 오른쪽 대뇌 피질 반구 (빨간색 X)의 중간에 삽입 지점을 확인합니다. (D) 제 3 뇌실에 DNA 용액을 주입한다. (E) 바늘 전극 (양극) 자궁 벽을 뚫고 태아와 태반의 삽입 사이. 평면 전극 (음극) 자궁의 자유 측면에 달려있다. 시상 하부를 따라 긍정적 인 전극의 위치를 보여주는 태반 측면에서 (F) 가설보기. (G)의 위치를 표시하는 자궁의 자유 측면에서보기 음극.
그림 3. 전체 시상 하부 또는 그것의 일부를 형질. 네 가지의 두꺼운 진동 - 마이크로톰 섹션E12.5에서 형광 리포터 유전자 GFP (A, C) 또는 CFP (B, D)를 운반하는 플라스미드 DNA의 자궁 형질의 후 시상 하부를 보여주는 야생 유형 E18.5 마우스 뇌. (A) 시상 부분 (왼쪽 주동이) 주동이의 꼬리에 형질 전환 시상을 표시합니다. 스케일 바 500 μm의. (B) 횡단면. 형질 전환 측면에서 레이블이 세포는 모든 메디 - 측면 수준에서 찾을 수 있습니다. (C) 시상 섹션은 특히 형질 mammillary 몸 (점선, 별표)를 표시하고 특성 축삭 트리 (화살촉)의 라벨. (D) 횡단면은 mammillary 몸을 통해 (점선). 에 electroporation하여면 (별표) E12.5에서 태어난 뉴런에 해당하는 레이블이 밴드를 볼 수 있습니다. HY, 시상 하부, 목, 시상
그림 4. 시상 하부 발달의 특정 단계를 분석. mammillary 몸 (적색)를 보여주는 두뇌 개발을 통한 수평 단면의 (A) 다이어그램입니다. 이 지역에 묘사 된 (B)와 (C) 액자입니다. E12에서 GFP를 형질 전환 한 후 E18.5 mammillary 몸을 통해 수평 단면에서 GFP의 (B) 항체 라벨. E12.5에서 태어난 세포는 핵에 뚜렷한 밴드 (B의 화살촉, C 및 D)을 형성. 스케일 바 100 μm의는. 섹션 neuroepithelial 마커 스틴 (적색)의 (C) 항체 라벨링 (B)에서와 같이. 스케일 바 100 μm의. (D) 개별 세포는 높은 배율에서 mammillary 몸의 특정 E12.5 대역에서 확인할 수 있습니다. 20 μm의 눈금 막대.
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Discussion
마취 소개 : 시상 하부에 자궁의 electroporation 기술적으로 험난 할과 긴 마취 시간을 필요로 할 수 있기 때문에, 우리는 산소와 isoflurane을의 혼합물의 관리를 통해 마취를 유도하고 유지하는 것을 선호합니다. 우리의 경험에서, 동물, 적어도 어머니의 회복이 매우 빠르고, 배아 생존율이 향상 1 시간까지의 기간 동안이 방법으로 적절한 마취 남아있을 수 있습니다. 마취 다른 방법도 사용할 수 있습니다. 가장 간단한 절차를 복강 내 주사하여 마취를 유도하고 유지 관리하는 구성 2.5 0.9 밀리리터 / 케타민 (25 밀리그램 / ML), Xylazin (1.2 ㎎ / ㎖) Acepromazin (0.35 밀리그램 / ML)의 혼합물 체중 kg % 멸균 염화나트륨 ( "트리플 콤보"). 혼자 혼합물로, 여기에서 권장 용량에서 약 30 분 (일부의 경우 최대 45 분)의 마취가 유도된다. 이것은 일반적으로 충분한 E12.5에서 피질로 자궁의 electroporation에 대한 (주사 통해측면 뇌실의 ection). 이 방법의 장점은 완전히 혼수 상태 - 장치와 다른 장치의 필요성을 피할 수 있다는 것입니다. 수술의 긴 시간이 필요한 경우, 복강 내 마취의이 유형은 마취 동물에 더 주사 마취 기간을 연장하기 위해 종종 죽음 뒤에되기 때문에 권장하지 않습니다. 먼저 마취를 유도하기 위해 "트리플 콤보"(위와 같이)의 주입을 사용하여 복강 및 흡입 마취를 결합하는 것도 가능하다, 다음, isoflurane을 / 산소 흡입을 유지합니다. 는 필요에 따라이 특정 방법으로 마취는만큼 유지 될 수 있지만, 수술 후 임신 한 쥐의 회복은 혼자 흡입을 가진만큼 좋지 않다. 게다가, 우리는 "트리플 콤보"복강 내 주입을 사용할 때마다, 배아 생존은 감소한다.
태아의 머리에 전극의 위치는로 묘사 개복술은 충분히 간단하다. 그러나 실험은 평평한 학습 곡선 후 배아의 높은 생존율 (전기 펄스의 관리에 따라 뇌 실내 주사 후) 가능 스킬 레벨에 도달합니다. 개별 기술은 일반적으로, 특히 시상 하부의 응용 프로그램에서 자궁의 electroporation 일부 학생들을 위해 완전히 실용적이지 증명할 수 있도록 중요한 요소이다 . 학습 기간을 단축 할뿐만 아니라, 우리가 그것을 유용에 대한 배아의 수와 위치에 대한 정보를 포함하는 세부적인 프로토콜 및 외관, 사출 품질과 전극의 대략적인 위치를 채우기 위해 발견 재현성 및 통계 분석을 증가 각각의 배아. 배아로 배아를 기준으로, 최종 결과와 실험에 대한 이러한 데이터를 비교하는 것은 이해하고 절차를 개선하기 위해 도움이 입증되었습니다. 다른 보고서 20,21가 Nepagene 족집게 형 전극 시상 하부를 대상으로했다. 우리는 일관되게 하나의 바늘 전극의 응용 프로그램과 동일한 제조 업체의 평면 커버 전극 더 나은 결과를 얻을 수 있습니다. 우리의 경험에서는,이 메소드의 사용은 쉽게 대상 rostro - 꼬리 있습니다. 트위터 전극은 유용한 결과를 얻을하기 위해 하나 더 많은 경험 / 기술이나 실험의 훨씬 더 큰 숫자를 요구하는 것 같다.
그것은 임신 한 쥐의 혈액 흐름에 형질하는 구조의 주입에 기반이기 때문에 접근의 또 다른 그룹은 완전히 수술을 피할 수 있습니다. 지역별 타겟팅이 방법으로 할 수는 없지만 shRNA 34,35 또는 플라스미드 36의 꼬리 정맥 (꼬리 정맥) 주입, 유전자 초기 배아를 조작 할 가능성이있다. 이 유망한 접근 방식은 아직 일반적으로 응용 프로그램에 대한 준비를하지 않는 것. 신생아 생쥐 (그러나 오래된 쥐)의 얼굴 정맥 주사 바이러스 입자 (아데노 - 관련 바이러스)는 뇌의 뉴런 37 형질 할 수 있습니다. 마지막으로, 결국 DNA 캐리어로 사용될 수 나노 입자, 꼬리 V 후 뇌에 도달 할 수성인 마우스 38 EIN 주입. 초기 배아를 형질의 가능성을 열어 두 방법은 아직 임신 한 쥐에 사용되지 않은 우리의 지식이 있습니다.
형질 수집 및 연령 : 절차를 학습, 그것은 E14.5 배아를 형질을 시도하고 이전보다 어려운 배아 나이에 졸업하는 것이 가장 좋을 것입니다. 우리의 경험에서 GFP 발현은 형질 전환 후 이미 UV 빛의 밑에 24 시간 볼 수 있습니다. E12.5 형질 전환 후, E18.5에서 GFP 발현이 매우 강하다. 우리는 E12.5, E13.5, E14.5, 그리고 E15.5에 electroporation하여 및 E17.5, E18.5, P0 그리고 모든 경우에 강력한 리포터 표현을 찾을 수있는 P1에서 분석했다. 그의 두뇌 자궁에서 형질 전환 된 배아 (출생 데이터 수집) 기간에 도달 할 수 있습니다 때, 때로는 선택적으로 어머니에 의해 먹게됩니다. 이 뇌의 조작에 의해 유도 된 강아지 모양이나 동작에 미묘한 변화를 (자신의 온도 제안진짜야 낮은 수, 또는 어쩌면 그들은) 우측 사운드 신호를 방출하지 않습니다. 산모 컬링 생존하는 산후 동물에서, 우리는 적어도 P1까지 기자의 발현을 관찰했다. 심지어 사개월 탄생 10 후 형질 전환 된 구조의 문학 쇼 식에보고합니다.
electroporation에 대한 벡터 : 우리는 예를 들어, 형광 기자의 cDNA를에서, 내부 ribosome 항목 사이트 (IRES) (40)에 의해 분리 된 관심의 유전자의 cDNA를 다음 CAG 프로모터 39,에 의해 구동 bicistronic 기자 플라스미드를 사용하는 향상된 녹색 형광 단백질 41. CAG 프로모터는 그들을 죽이고, 형질 세포가 너무 높은 DNA 수준을 생산할 수있는 신경에 너무 강하다. 우리는 형질, 가능한 해결책 후 대규모 apoptosis를 관찰 적이 있지만, 문제가 나타납니다, EF1 알파 42와 같이, 덜 효율적인 프로모터를 사용하는 것입니다.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 독일 연구 재단 (도이치 Forschungsgemeinschaft)에 의해 재정 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Acepromazine | Sanofi GmbH | anesthetic | |
| Isoflurane | Baxter | HDG9623 | anesthetic |
| Ketamin | Pharma GmbH | anesthetic | |
| Fast Green | Fluka | 44715 | |
| Rimadyl | Pfizer | non-steroidal anti-inflammatory | |
| Braunoderm | Braun | 3887138 | povidone-iodine |
| Phosphate Buffer Saline PBS | Gibco | 14190 | |
| Temgesic (buprenorphine) | Essex Pharma | opioid analgesic | |
| Eye Ointment | Pan-Ophtal | 7136926 | |
| Xylazine | Bayer | ||
| EQUIPMENT | |||
| Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5 | Medical Developments Australia | ACN 004 903 682 | |
| Capillary puller P-97 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Compresstome | Precisionary Instr. | VF-300 | Vibratome-type device |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Electroporator | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY21EDIT | |
| Electrode 1 | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY550-10 | Stainless Steel Needle Electrode, 10 mm-Tip, 0. 5 mm diam. |
| Electrode 2 | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY700P4L | Cover Round Platinum Plate 4 mm diameter |
| Fiberoptic cold light source | Leica | KL2500 LCD | |
| Glass capillaries | Harvard Apparatus | GC120T-15 | 1. 2 mm O.D. x 0. 94 mm I.D. |
| Glass bead sterilizer | Fine Science Tools | FST250 | |
| Heating pad | Harvard Apparatus | py872-5272 | |
| Injection device | World Precision Instruments | Pneumatic Pico Pump PV820 | |
| Suture Thread Coated Vicryl | Ethicon | V4914 | Peritoneal Suture |
| Suture Thr. Supramid | Serag Wiessner | TO07171L | Skin Suture |
References
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, E203-E207 (1999).
- Miyasaka, N., Arimatsu, Y., Takiguchihayashi, K. Foreign gene expression in an organotypic culture of cortical anlage after in vivo electroporation. Neuroreport. 10, 2319-2323 (1999).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Neurons tend to stop migration and differentiate along the cortical internal plexiform zones in the Reelin signal-deficient mice. J. Neurosci. Res. 69, 723-730 (2002).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Emx2 patterns the neocortex by regulating FGF positional signaling. Nat. Neurosci. 6, 825-831 (2003).
- Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex. Development. 131, 5639-5647 (2004).
- Shimogori, T., Grove, E. A. Fibroblast growth factor 8 regulates neocortical guidance of area-specific thalamic innervation. J. Neurosci. 25, 6550-6560 (2005).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Dixit, R., et al. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (44), e2103 (2010).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos. J. Vis. Exp. (6), e236 (2007).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. J. Neurosci. Methods. 143, 151-158 (2005).
- Haddad-Tovolli, R., Heide, M., Zhou, X., Blaess, S., Alvarez-Bolado, G. Mouse thalamic differentiation: gli-dependent pattern and gli-independent prepattern. Front Neurosci. 6, 27 (2012).
- Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).
- Vue, T. Y., et al. Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice. J. Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).
- Tanaka, S., et al. Transcriptional regulation of the hypocretin/orexin gene by NR6A1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 403, 178-183 (2010).
- Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections. J. Neurosci. Res. 87, 1620-1633 (2009).
- Canteras, N. S. The Mouse Nervous System. Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. , Academic Press. 539-562 (2011).
- Caqueret, A., Yang, C., Duplan, S., Boucher, F., Michaud, J. L. Looking for trouble: a search for developmental defects of the hypothalamus. Horm. Res. 64, 222-230 (2005).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (31), e1333 (2009).
- Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., Mackenzie, T. C. A Mouse Model of in Utero Transplantation. J. Vis. Exp. (47), e2303 (2011).
- Altman, J., Bayer, S. A.
- Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscience. 105, 7-17 (2001).
- Clancy, B., et al. Web-based method for translating neurodevelopment from laboratory species to humans. Neuroinformatics. 5, 79-94 (2007).
- Ishii, Y., Bouret, S. G. Embryonic birthdate of hypothalamic leptin-activated neurons in mice. Endocrinology. 153, 3657-3667 (2012).
- Karim, M. A., Sloper, J. C. Histogenesis of the supraoptic and paraventricular neurosecretory cells of the mouse hypothalamus. J. Anat. 130, 341-347 (1980).
- Shimada, M., Nakamura, T. Time of neuron origin in mouse hypothalamic nuclei. Exp. Neurol. 41, 163-173 (1973).
- Alvarez-Bolado, G., Paul, F. A., Blaess, S. Sonic hedgehog lineage in the mouse hypothalamus: from progenitor domains to hypothalamic regions. Neural. Dev. 7, 4 (2012).
- Vann, S. D., Aggleton, J. P. The mammillary bodies: two memory systems in one. Nat. Rev. Neurosci. 5, 35-44 (2004).
- Gratsch, T. E., De Boer, L. S., O'Shea, K. S. RNA inhibition of BMP-4 gene expression in postimplantation mouse embryos. Genesis. 37, 12-17 (2003).
- Wu, N., Yu, A. B., Zhu, H. B., Lin, X. K. Effective silencing of Sry gene with RNA interference in developing mouse embryos resulted in feminization of XY gonad. J. Biomed. Biotechnol. 2012, 343891 (2012).
- Kikuchi, N., Nakamura, S., Ohtsuka, M., Kimura, M., Sato, M. Possible mechanism of gene transfer into early to mid-gestational mouse fetuses by tail vein injection. Gene Ther. 9, 1529-1541 (2002).
- Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27, 59-65 (2009).
- Xin, H., et al. The brain targeting mechanism of Angiopep-conjugated poly(ethylene glycol)-co-poly(epsilon-caprolactone) nanoparticles. Biomaterials. 33, 1673-1681 (2012).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Kaufman, R. J., Davies, M. V., Wasley, L. C., Michnick, D. Improved vectors for stable expression of foreign genes in mammalian cells by use of the untranslated leader sequence from EMC virus. Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991).
- Tsien, R. Y.
- Londrigan, S. L., et al. Evaluation of promoters for driving efficient transgene expression in neonatal porcine islets. Xenotransplantation. 14, 119-125 (2007).
